专利名称：：谷氨酸脱羧酶抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析领域，具体地，本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：谷氨酸脱羧酶(gad)是合成y氨基丁酸(gaba)的限速酶，在胰岛p细胞中与胰岛素同处存在，同时分泌，具有自分泌和旁分泌信号调节e细胞合成及分泌胰岛素的功能。谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)阳性患者中，一方面由于体内存在GAD-Ab，GAD-Ab与GAD结合后影响了GABA的合成速度，干扰了胰岛素合成及分泌的调节，使胰岛e细胞的胰岛素合成受到影响，导致体内循环中的胰岛素不足，从而引起胰岛素依赖的糖尿病。另一方面，机体产生的GAD-Ab激发了T淋巴细胞而引起e细胞的破坏。绝大多数l型糖尿病是由免疫介导的胰岛0细胞破坏造成的。这种选择性破坏与细胞免疫和体液免疫有关。除巨噬细胞、淋巴细胞浸润外，胰岛细胞抗体(ICA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)、胰岛素自身抗体(IAA)可以预报1型糖尿病的发病。在诸多自身抗体中，GAD-Ab出现早、持续时间长。在l型糖尿病诊断后3-5年，ICA抗体滴度和检出率显著下降，10年后仅20%的病人阳性。相反，GAD-Ab下降幅度小，1型糖尿病诊断10年后54%的病人中仍能检出GAD-Ab。同时，与ICA相比，GAD-Ab测定简单，费用低，易于标准化。因此，采用灵敏度髙的GAD-Ab检测，可以尽可能多的从高危人群中诊断出l型糖尿病患者。成人晚发自身免疫性糖尿病(LADA)发病初期，临床特点与2型糖尿病很相似，但短短的数年内就依赖于胰岛素治疗，实质上为1型糖尿病。表现为低体重指数，ICA及其他一些自身抗体阳性。GAD-Ab作为LADA诊断的免疫学指标，要优于ICA。GAD-Ab检查有利于早期发现LADA病人，加强随诊，早期予以胰岛素治疗，可以保护残存的胰岛P细胞功能，减少近期和远期并发症。2型糖尿病是由胰岛素抵抗和(或)相对缺乏造成的，并非免疫介导的胰岛炎所致。故2型糖尿病患者GAD-Ab阳性率低于l型糖尿病患者。在2型糖尿病中，最初即应用胰岛素的病人及GAD-Ab阴性的病人，其胰岛e细胞功能衰减幅度要低的多，高滴度的GAD-Ab预示着更快的胰岛e细胞功能衰竭。因此，糖尿病发病时GAD-Ab的状态是预测其临床过程的理想指标，它可以将LADA与2型糖尿病区分开来。综上GAD-Ab的检测在糖尿病的预测、诊断及正确分型方面均具有重要价值。目前用于检测GAD-Ab的免疫分析方法主要有放射免疫分析(RIA)、酶联免疫分析(ELISA)。根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，化学发光免疫分析(CLIA)要大大优于酶免疫分析、放射免疫分析。放射免疫分析技术因其使用放射性元素作为标记物，因此对环境有放射性污染，并存在操作复杂，试剂保存时间短等不足；酶免疫分析法存在灵敏度低，信噪比不高，灰区附近难以判定等方法学制约因素；化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，可使检测灵敏度达到10—"摩尔水平，而且检测范围可达6个数量级，其酶标记物稳定，可长期使用。较RIA和ELISA优势明显。
发明内容本发明的目的是提供一种谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒，其中，所述试剂盒包括l)GAD-Ab阴性对照品；2)GAD-Ab阳性对照品；3)谷氨酸脱羧酶(GAD)抗原包被的微孔板；4)用于稀释血清样本的样本稀释液；5)辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；6)洗涤液；7)化学发光底物液。根据本发明的试剂盒，其中，所述微孔板为48孔、96孔微孔板。根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中化学发光底物A液，包括1.7716g/L鲁米诺、0.051g/L4-羟基联苯、0.012g/L4-碘苯硼酸、11.4g/L硼酸、4.9g/L硼砂，其pH值为8.0~8.5;化学发光底物B液，包括0.329g/L过氧化脲、0.01订ween20、51.58g/LNa2HP0412H20、8.74g/LNaH2PO,2H20，其pH值为7.0~7.5。化学发光底物液包含A液和B液使用方法A、B液双组分试剂，在使用前根据使用量计算完毕后A:B为l:1混合，应保证在6h内使用。谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，包括A:制备GAD-Ab阴性对照品根据本发明试剂盒制备方法中，所述制备GAD-Ab阴性对照品、阳性对照品，其基质配方为含2g/LBSA,lg/L水解明胶，0.l°/。Proclin300,0.05mol/LPH7.8Tris-HCL。配制基质液后，用此基质液做为阴性对照品，分装成2ml/瓶后-20t:保存。B:制备GAD-Ab阳性对照品配制基质液后，将GAD-Ab纯品稀释成适当浓度阳性对照，再加入0.001%食品红后分装成2ml/瓶，做为阳性对照品，-20X:保存。C:制备谷氨酸脱羧酶(GAD)抗原包被的微孔板根据本发明试剂盒制备方法中，所述制备谷氨酸脱羧酶(GAD)抗原包被的微孔板，其包被缓冲液为0.05m磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。包被浓度1~3mg/ml谷氨酸脱羧酶，4'C24h后，去离子水洗涤2次，2y。BSA室温封闭3h后，在温度20-28'C及湿度小于或等于3(W条件下干燥12h，装袋封装。D:配制用于稀释血清样本的样本稀释液根据本发明试剂盒制备方法中，所述配制用于稀释血清样本的样本稀释液，其配方为0.05MpH值为7.2的磷酸盐缓冲液，10g/LBSA，0.3%TritonXIOO。E:制备辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体根据本发明试剂盒制备方法中，所述制备辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，标记方法采用过碘酸钠法。其具体方法为称5mgHRP溶于lml双蒸水中，加入0.2ml新配的0.1MNal04溶液，室温避光20min。lmMpH4.4醋酸钠缓冲液透析，4'C过夜。加入20m10.2MpH9.6碳酸盐缓冲液，加入lml0.OIM碳酸盐缓冲液含5mg抗体，室温2h。再加0.lml新配4g/LNaBH4，混匀，4。C2h。0.15MpH7.4PBS透析4'C过夜。搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4匸lh。3000rpm离心0.5h,弃上清。沉淀物溶于lm10.15MpH7.4PBS。0.15MpH7.4的PBS透析4。C4h,10，OOOrpm离心30min,上清液即为酶结合物，加入等量丙三醇，-20。C保存。根据本发明试剂盒制备方法中，所述制备辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，其稀释液配方为0.05MpH值为7.2的磷酸盐缓冲液，15%新生牛血清。配制完成后，应混匀，放置30分钟后用肉眼观察无晶体或沉淀析出，应釆用电子pH计或中性pH试纸进行检验pH应控制在7.0-7.5之间，最佳pH为7.2。然后分装到适当体积的聚乙烯塑料瓶中。将上述标记完成的辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体，用标记物稀释液进行1:1000-1:70，000之间的一个适当稀释比例进行稀释。根据本发明试剂盒制备方法中，所述制备辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体为羊抗体或兔抗体。F:配制洗涤液根据本发明试剂盒制备方法中洗涤液的配方为0.01MpH值为7.2的磷酸盐缓冲液，0.01%Tween20,2g/LKC1。G:配制化学发光底物液化学发光底物液A液配方硼酸11.4g硼砂4.9g鲁米诺1.7716g4-羟基联苯0.G51gg4-碘苯硼酸0.012g双蒸水定容1000ml化学发光底物液B液配方磷酸二氢钠(NaH2P04*2H20)8.74g磷酸氢二钠(Na2HP04'12H20)51.58g过氧化脲(CH6N203)0.329gTween200.1ml双蒸水定容1000ml最后组装上述各组份成为成品试剂盒。综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量检定，包括抗原的纯度、标记抗体的活性、微孔板的吸附性能和变异大小、辣根过氧化物酶的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。对于辣根过氧化物酶的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法。本发明公开了基于上述摸索试验得到的各种试剂配方，包括化学发光底物液配方、阴性对照品和阳性对照品的基质配方、样本稀释液配方、洗涤液的配方、辣根过氧化物酶标记物的稀释液配方。利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，操作简单，无放射性污染,试剂盒成本低，临床适用性强，可广泛应用于我国临床检测。具体实施例方式实施例1谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒发光底物液的制备按照化学发光底物液A液配方硼酸11.4g硼砂4.9g鲁米诺1.7716g4-羟基联苯Q.Q51gg4-碘苯硼酸0.012g双蒸水定容1000ml配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分装10m1.按照化学发光底物液B液配方磷酸二氢钠(NaH2P04*2H20)磷酸氢二钠(Na2HP04*12H20)过氧化脲(CH6N203)Tween208.74g51.58g0.329g0.lml1000ml双蒸水定容配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分装lOml.实施例2谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒阴性对照品的制备根据本发明阴性对照品的配方三羟甲基氨基甲烷(Tris)牛血清白蛋白(BSA)水解明胶(HG)0.lmol/L盐酸(HCL)Proclin300双蒸水定容6.06g2glg3.45mllml1000ml配制完毕后，使用3ml容积的西林瓶，每瓶分装2ml，贴签后，-20'C冷冻保存.实施例3谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒阳性对照品的制备根据本发明阳性对照品的配方三羟甲基氨基甲烷(Tris)牛血清白蛋白(BSA)水解明胶(HG)0.lmol/L盐酸(HCL)谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)Proclin300食品红双蒸水定容6.06g2glg3.45ml15mglml0.Olml1000ml配制完毕后，使用3ml容积的西林瓶，每瓶分装2ml，贴签后，-20'C冷冻保存'实施例4谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒包被微孔板的制备取谷氨酸脱羧酶(GAD)浓原料10mg,使用0.05M磷酸二氢钠-磷酸氯二钠缓冲液将原料稀释到包被浓度2pg/ml,摇匀，取96孔微孔板，每微孔中加入120jaL，4'C2化后，去离子水洗涤2次，2y。BSA室温封闭3h,在温度20-28。C及湿度小于或等于30y。条件下12h后，用铝箔袋热封口封装。实施例5谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒样本稀释液的制备配制用于稀释血清样本的样本稀释液，其配方为磷酸二氢钠(NaH2P(V2H20)2.19g磷酸氢二钠(Na2HP04*12H20)12.9g牛血清白蛋白(BSA)10gTritonX1003ml去离子水定容1000ml配制完毕后，使用lOml容积的聚乙烯塑料瓶，每瓶分装lOml,贴签后，-20'C冷冻保存。实施例6谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒酶标记物稀释液的制备辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体稀释液配方为磷酸二氢钠(NaH2P04*2H20)2.19g磷酸氢二钠(Na2HP04M2H20)12.9g新生牛血清150ml去离子水定容1000ml配制完成后，应混匀，放置30分钟后用肉眼观察无晶体或沉淀析出，应采用电子pH计或中性pH试纸进行检验pH应控制在7.0-7.5之间，最佳pH为7.2。实施例7辣根过氧酶标记物最佳稀释比例的选择采用平行试验法将辣根过氧化物酶标记抗体以不同稀释度进行对比，以最高信噪比大于150，最低信噪比大于5为基准，优化选择成本最低的稀释比例。将辣根过氧化物酶标记抗体以1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1/32000、1/6400'0的不同稀释度，进行条件对比实验，发现满足最高信噪比大于150,最低信噪比大于5的比例中，将辣根过氧化物酶标记抗体1/32000的比例所用成本最低。故选择这个稀释比例。实施例8谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒洗涤液的制备根据洗涤液的配方进行配制磷酸二氢钠(NaH2P04*2H20)1g磷酸氢二钠(Na2HP04*12H20)1.28g氯化钾(KCL)2gTween200.lml去离子水定容1000ml配制完成后，应混匀，放置30分钟后用肉眼观察无晶体或沉淀析出，应釆用电子pH计或中性pH试纸进行检验pH应控制在7.0-7.5之间，最佳pH为7.2。实施例9谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒半成品及成品组成上述实施例18所得产品分装即为半成品。将半成品在组装前抽检经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒，按照标准操作规程进行组装成品，并经过质量人员复核后记录、入库。实施例10本发明的试剂盒的使用方法一、实验前准备1、蒸馏水或去离子水；2、吸水纸用于板条冲洗后的拍干；3、封口膜在反应过程中覆盖板条；4、用于血清稀释的试管；5、微量加样器，带有10iul-200Ml吸液Tip头；6、微孔板冲洗机或冲洗瓶；7、化学发光测量仪二、标本采集病人标本无需特殊处理，采用常规医用技术收集全血标本，离心分离后吸取血清用于检测。待测血清如在24小时之内使用，可于2-8。C保存，若需长期存放应保存在-2(TC以下，并避免反复冻溶。三、使用本试剂盒实验的具体操作步骤如下1、首先，根据试验需求设计好分布图，然后将所需的微孔条固定于板架上，编好顺序。2、分别加入lOOnil阴性对照品、阳性对照品和已稀释的血清样品于相应的孔中，空白孔除外。3、用封口膜将板条封好，置37'C温育1小时。4、每孔加入配制好的洗涤液200-300iul，停留30秒，甩干，重复洗涤五次，在吸水纸上轻拍数下。在洗涤过程中应避免产生气泡。5、每孔加入酶结合物IOOmI,空白孔除外。6、用封口膜或塑料胶条将板封好，置37C温育1小时。7、反应后，再次洗涤(同4)，拍干。8、加发光底物A及B各50jal，混匀，室温(20-25。C)避光反应5分钟。立即在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间l秒/孔。四、结果分析从阴性、阳性对照品和样品孔的发光度值中减去空白孔发光度值。在阳性对照品/阴性对照品发光强度比值大于等于10时，将阴性对照品的发光强度2.1倍定为CUTOFF值。在CUTOFF值以上的样本即为阳性样本。实施例11本发明的试剂盒的方法学检定按照本领域中常规的制造及检定规程对通过实施例1~8中制备成的试剂盒进行检定1)精密性CV(W应小于15.0'"n=10)2)灵敏度将已知浓度为1500ng/ml的标准品稀释到20ng/ml，所测发光强度值应高于CUTOFF值。3)特异性与IAA的交叉反应浓度为300U/ml的IAA标准品，在本发明试剂盒中所测发光强度值应低于CUTOFF值。与ICA的交叉反应浓度为100U/ml的ICA标准品，在本发明试剂盒中所测发光强度值应低于CUTOFF值。4)稳定性将试剂盒37。C放置7天，测定结果应符合上述1)3)项要求。实施例12本发明的试剂盒同国外ELISA试剂盒临床血样测值对比使用本发明的试剂盒与国外GAD-Ab酶联免疫检测试剂盒同时检测47份I型糖尿病、29份n型糖尿病人标本，两种试剂盒的比较结果见下表l、表2:表l本试剂盒与国外试剂盒I型糖尿病测值对比结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2本试剂盒与国外试剂盒II型糖尿病测值对比结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>从两表所列检测结果数据分析，本发明试剂盒在47份I型糖尿病标本中检出30份阳性，阳性率为63.8%;29份II型糖尿病人检出5份阳性，阳性率为17.2%。与国外ELISA试剂盒能够较好符合。权利要求1.谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)GAD-Ab阴性对照品；2)GAD-Ab阳性对照品；3)谷氨酸脱羧酶(GAD)包被的微孔板；4)样本稀释液；5)辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；6)洗涤液；7)化学发光底物液。2、如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，所述微孔板为48孔、96孔微孔板。3、如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，化学发光底物A液，包括1.7716g/L鲁米诺、0.051g/L4-羟基联苯、0.012g/L4-碘苯硼酸、11.4g/L硼酸、4.9g/L硼砂，其pH值为8.0~8.5;化学发光底物B液，包括0.329g/L过氧化脲、0.01%Tween20、51.58g/LNa2HP04.12H20、8.74g/LNaH2P04.2H20,其pH值为7.0~7.5。4、根据权利要求l所述的试剂盒的一种制备方法，其特征在于，包括以下步骤制备GAD-Ab阴性对照品；制备GAD-Ab阳性对照品；制备谷氨酸脱羧酶(GAD)抗原包被的微孔板；配制用于稀释血清样本的样本稀释液;制备辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；配制洗涤液；配制化学发光底物液；及组装各半成品为成品试剂盒。5、如权利要求4所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备GAD-Ab阴性对照品、阳性对照品，其基质配方为含2g/LBSA,lg/L水解明胶，0.l°/。Proclin300，0.05mol/LPH7.8Tris-HCL。6、如权利要求4所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备谷氨酸脱羧酶(GAD)抗原包被的微孔板，其包被缓冲液为0.05M磷酸二氢钠-磷酸氩二钠缓冲液。7、如权利要求4所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述血清样本的样本稀释液，其配方为0.05MpH值为7.2的磷酸盐缓冲液，10g/LBSA，0.3%TritonXIOO。8、如权利要求4所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，标记方法采用过碘酸钠法，采用酶标记物稀释液将酶标记物稀释成工作浓度。9、如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述酶标记物稀释液，其配方为0.05MpH值为7.2的磷酸盐缓冲液，15%新生牛血清。10、如权利要求4所述的试剂盒制备方法，其特征在于，所述配制洗涤液，配方为0.01MpH值为7.2的磷酸盐缓冲液，0.01%Tween20,2g/LKC1。全文摘要本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒包括GAD-Ab阴性、阳性对照品；包被微孔板；样本稀释液；辣根过氧化物酶标记物；洗涤液；化学发光底物液。根据本发明制备上述试剂盒的制备方法包括制备GAD-Ab阴性、阳性对照品；制备谷氨酸脱羧酶(GAD)抗原包被的微孔板；配制样本稀释液；制备辣根过氧化物酶标记物；配制洗涤液、配制化学发光底物液等步骤。本发明试剂盒操作简单，无放射性污染，可广泛应用于临床检测。文档编号G01N33/573GK101368957SQ20081010541公开日2009年2月18日申请日期2008年4月29日优先权日2008年4月29日发明者于尚永,唐宝军,应希堂,王宏锐,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司