专利名称：：一种氨基葡萄糖的分析方法
技术领域：
：本发明涉及分析化学领域，具体的涉及氨基葡萄糖的分析方法。技术背景软骨是由一小部分软骨细胞和大部分软骨基质组成的，软骨基质是由蛋白多糖、胶原纤维和水等组成的。蛋白多糖集聚体是由蛋白多糖聚合而成，其最主要的作用是组成细胞间的基质，包括关节软骨中的基质，是支撑、维系各细胞间关系的结构性物质，充斥于人们身体的每一部分。它也是关节软骨的重要组成成分，并吸引大量水分子形成凝胶状，它与胶原纤维共同组成软骨基质的固体、网络形态，承受关节运动时的负荷。每一个蛋白多糖集聚体就像一个小弹簧，具有良好的弹性和膨胀能力，对关节起机械性保护作用。蛋白多糖与其它基质大分子相连，有助于稳定软骨基质。由于蛋白多糖中的羧基、硫酸根均带有负电荷，彼此相斥，所以蛋白多糖集聚体在溶液内呈瓶刷状。在正常的组织修复，以及软骨退变过程中，关节软骨中的蛋白多糖不断地被分解，并从软骨中排出。被分解的片段可以在关节滑液中找到，并可以通过滑膜进入淋巴系统。而氨基葡萄糖(Glucosamine)是人体内天然存在的氨基单糖，是软骨细胞Chondrocytes进行生物合成与代谢必不可少的底物。在正常情况下，氨基葡萄糖是通过体内葡萄糖的氨基化来合成的，具有与葡萄糖Glucose完全不同的生理活性。氨基葡萄糖是组成聚氨基葡萄糖(Glucosaminoglycan，GAG)的最小单位之一，它和糖醛酸组成了聚氨基葡萄糖，以前叫"粘多糖Mucopolysaccharide"。聚氨基葡萄糖主要有硫酸软骨素ChondroitinSulfate、硫酸角质素KeratanSulfate、硫酸皮肤素De歷tanSulfate、透明质酸HyaluronicAcid等。一种或多种聚氨基葡萄糖GAG以共价键与核心蛋白(CoreProtein)结合，称为蛋白多糖(Proteoglycans蛋白多糖，也叫蛋白聚糖，全称为蛋白质核心多糖，由聚氨基葡萄糖共价连接于核心蛋白形成，它是一种复杂的大分子。蛋白多糖通过连接蛋白(LinkProtein),在透明质酸长链两侧的特殊位点上结合，形成非常大的聚合体，即蛋白多糖集聚体(ProteoglycanAggrecan)，重量约为2X103kDa。氨基葡萄糖是一种从天然甲壳质中提取的氨基己糖，是人体及动物体内关节组织中糖蛋白的天然成分，其化学结构式为随着年龄的增长，人体内氨基葡萄糖合成能力减弱，从而使蛋白多糖合成不足，进一步引发退行性关节疾病和骨关节炎。氨基葡萄糖可以刺激软骨细胞产生有正常多聚体结构的蛋白多糖，抑制损伤软骨的酶如胶原酶和磷脂酶A2，并可防止损伤细胞的超氧化自由基的产生，从而延缓骨关节炎的病理过程和疾病的进展，改善关节活动，缓解疼痛，近年来国外已成功的将其盐酸盐引入到全身骨关节炎的治疗和预防。氨基葡萄糖的含量测定方法通常采用比色法测定，将样品显色后在525nm处测定[化学药品地方标准上升国家标准(第十六册)，国家药典委员会]，但操作较为繁琐、费时，且重现性较差。陈金东，李蔚在<〈中国卫生检验杂志》2002年02期采用滴定分析方法和分光光度法,定量测定保健食品中的D-盐酸氨基葡萄糖.滴定分析法精密度(『6)为94.0%±0.4%,相对标准偏差(RSD)为0.4%回收率为97.1%99.7%.分光光度法精密度(『6)为93.9X土1.0X，相对标准偏差(RSD)1.1%,回收率为97.4%103.0%.对两种实验方法比对实验的结果进行t检验，t=0.243<t(0.05,18)=2.101，P>0.05:两种分析方法所得实验的结果无明显差异.两种方法操作简便,精密度、准确度均较高,适合于保健食品中D-盐酸氨基葡萄糖的测定，滴定分析法更适合D-盐酸氨基葡萄糖含量较高的保健食品及原料纯度进行测定。但这些方法仍然有不够准确和简便，而且专属性不强，随着氨基葡萄糖在食品，保健食品和药品中的广泛应用，需要建立一套比较快速、简便和精确的分析方法用于氨基葡萄糖的定量分析。
发明内容本发明的目的是提供一种准确、简便、专属性强的氨基葡葡糖的分析方法。具体而言，本发明的色谱分析技术方案如下a.分析仪器采用采用高效液相色谱仪，反相色谱柱和紫外检测器；b.流动相为pH值为2.0-4.0的磷酸盐缓冲液和有机溶剂配制而成，其体积比为磷酸盐缓冲液有机溶剂=10:90-90:10;c.稳定高效液相色谱仪后，对色谱体系进样，流速为0.5-1.5ml/min，d.采用外标法测定样品含量。优选的，上述反相色谱柱为氨基色谱柱；优选的，上述反相色谱柱的长度为10-30cm，直径为3-10mm;优选的，上述的流速为0.6ml/min;优选的，上述的色谱分析时间为10-45rain;更优选30mir,;优选的，上述的进样量为5y1-10yl;优选的，上述的流动相中有机溶剂为甲醇和乙腈；优选的，上述磷酸盐缓冲液的pH值为3.0。本发明与现有技术相比具有如下优点分析结果误差小，准确、可靠；分析过程快速，操作简便。本发明与比色法、滴定分析方法和分光光度法相比具有准确、简便、专属性强的特点。具体实施方式:下面用实验例进一步描述本发明，有利于对本发明及其优点、效果更好的了解，但所述实验例仅用于说明本发明而不是限制本发明。实验例l一高效液相色谱条件的选择仪器与试剂采用日本岛津LC-10A型高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱分离系统的控制和记录由威玛龙色谱工作站完成。盐酸氨基葡萄糖对照品购自中国药品生物制品检定所；盐酸氨基葡萄糖样品购自浙江诚意药业有限公司；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司，北京屹东博杰科技有限公司提供)，流动相用水为超纯水，其它试剂均为分析纯。色谱柱WelchMaterials公司UltimateXB-NH2，5,4.6X250mm;柱温30。C。检测波长盐酸氨基葡萄糖无特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外区，故选择195nm作为检测波长。流动相磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈=65:35。进样量lO)ll。盐酸氨基葡萄糖结构中含有多个羟基，极性强，在反相色谱柱上保留能力弱，并有拖尾现象经过试验，当流动相选择以磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈二65:35，在该流动相系统下，各杂质峰与主成分峰均能达到有效分离。实验例2—高效液相色谱条件的选择仪器与试剂采用日本岛津LC-10A型高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱分离系统的控制和记录由威玛龙色谱工作站完成。盐酸氨基葡萄糖对照品购自中国药品生物制品检定所；盐酸氨基葡萄糖样品购自浙江诚意药业有限公司；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司，北京屹东博杰科技有限公司提供)，流动相用水为超纯水，其它试剂均为分析纯。色谱柱WelchMaterials公司UltimateXB-NH2，5pm,4.6X250mra;柱温-3CTC。检测波长盐酸氨基葡萄糖无特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外区，故选择195nm作为检测波长。流动相磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液乙腈=70:30进样量10^1。盐酸氨基葡萄糖结构中含有多个羟基，极性强，在反相色谱柱上保留能力弱，并有拖尾现象。经过试验，当流动相选择以磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液乙腈=70:30，在该流动相系统下，各杂质峰与主成分峰均能达到有效分离。实验例3—高效液相色谱条件的选择仪器与试剂采用日本岛津LC-10A型高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱分离系统的控制和记录由威玛龙色谱工作站完成。盐酸氨基葡萄糖对照品购自中国药品生物制品检定所；盐酸氨基葡萄糖样品购自浙江诚意药业有限公司；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司，北京屹东博杰科技有限公司提供)，流动相用水为超纯水，其它试剂均为分析纯。色谱柱WelchMaterials公司UltimateXB-NH2，5(xm，4.6X250mm;柱温30°C。检测波长盐酸氨基葡萄糖无特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外区，故选择195nm作为检测波长。流动相流动相选择以磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈50:50。进样量10^1。盐酸氨基葡萄糖结构中含有多个羟基，极性强，在反相色谱柱上保留能力弱，并有拖尾现象。经过试验，当流动相选择以磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈=50:50，在该流动相系统下，各杂质峰与主成分峰均能达到有效分离。实验例4一高效液相色谱条件的选择仪器与试剂采用日本岛津LC-10A型高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱分离系统的控制和记录由威玛龙色谱工作站完成。盐酸氨基葡萄糖对照品购自中国药品生物制品检定所；盐酸氨基葡萄糖样品购自浙江诚意药业有限公司；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司，北京屹东博杰科技有限公司提供)，流动相用水为超纯水，其它试剂均为分析纯。色谱柱WelchMaterials公司UltimateXB-nh2，5pm，4.6X250腿；柱温3CTC。检测波长盐酸氨基葡萄糖无特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外区，故选择200nm作为检测波长。流动相磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈z55:45。进样量5^1。盐酸氨基葡萄糖结构中含有多个羟基，极性强，在反相色谱柱上保留能力弱，并有拖尾现象经过试验，当流动相选择以磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈二55:45，在该流动相系统下，各杂质峰与主成分峰均能达到有效分离。实验例5—高效液相色谱条件的选择仪器与试剂采用日本岛津LC-10A型高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱分离系统的控制和记录由烕玛龙色谱工作站完成。盐酸氨基葡萄糖对照品购自中国药品生物制品检定所；盐酸氨基葡萄糖样品购自浙江诚意药业有限公司乙腈为色谱纯(美国Fisher公司，北京屹东博杰科技有限公司提供)，流动相用水为超纯水，其它试剂均为分析纯。色谱柱WelchMaterials公司UltimateXB-NH2，5网，4.6X250腿；柱温30。C。检测波长盐酸氨基葡萄糖无特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外区，故选择195nm作为检测波长。流动相磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液乙腈=45:55进样量2nl。盐酸氨基葡萄糖结构中含有多个羟基，极性强，在反相色谱柱上保留能力弱，并有拖尾现象。经过试验，当流动相选择以磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液乙腈=45:55，在该流动相系统下，各杂质峰与主成分峰均能达到有效分离。实验例6—高效液相色谱条件的选择仪器与试剂采用日本岛津IX-10A型高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱分离系统的控制和记录由威玛龙色谱工作站完成。盐酸氨基葡萄糖对照品购自中国药品生物制品检定所；盐酸氨基葡萄糖样品购自浙江诚意药业有限公司；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司，北京屹东博杰科技有限公司提供)，流动相用水为超纯水，其它试剂均为分析纯。色谱柱WelchMaterials公司UltimateXB-NH2，5pm，4.6X250mm;柱温30°C。检测波长盐酸氨基葡萄糖无特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外区，故选择195nm作为检测波长。流动相流动相选择以磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈z50:50。进样量2^1。盐酸氨基葡萄糖结构中含有多个羟基，极性强，在反相色谱柱上保留能力弱，并有拖尾现象。经过试验，当流动相选择以磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈=50:50，在该流动相系统下，各杂质峰与主成分峰均能达到有效分离。实验例7—盐酸氨基葡萄糖标准曲线的制作仪器与试剂采用日本岛津LC-10A型高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱分离系统的控制和记录由威玛龙色谱工作站完成。盐酸氨基葡萄糖对照品购自中国药品生物制品检定所；盐酸氨基葡萄糖样品购自浙江诚意药业有限公司；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司，北京屹东博杰科技有限公司提供)，流动相用水为超纯水，其它试剂均为分析纯。色谱柱WelchMaterials公司UltimateXB-NH2，5(im，4.6X250咖；柱温30。C。检测波长盐酸氨基葡萄糖无特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外区，故选择195nm作为检测波长。流动相磷酸盐缓冲液(PH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈z65:35。进样量10pl。精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品50mg，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得标准储备液(浓度为2nig/ml)，分别精密移取储备液适量用水配成标准溶液系列(浓度为0.2-2.Omg/ml)，各取10^1进样。以峰面积(A)为纵坐标对浓度(C)作图，得线性良好的标准曲线，相关系数为0.9998，回归方程为A=517672C+9737。实验例8—盐酸氨基葡萄糖含量测定仪器与试剂采用日本岛津LC-10A型高效液相色谱仪，紫外检测器，色谱分离系统的控制和记录由威玛龙色谱工作站完成。盐酸氨基葡萄糖对照品购自中国药品生物制品检定所；盐酸氨基葡萄糖样品购自浙江诚意药业有限公司；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司，北京屹东博杰科技有限公司提供)，流动相用水为超纯水，其它试剂均为分析纯。色谱柱WelchMaterials公司UltimateXB-NH2，5pm，4.6X250面；柱温30°C。检测波长盐酸氨基葡萄糖无特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外区，故选择195nm作为检测波长。流动相磷酸盐缓冲液(pH3.0)为水相时，效果比较好，峰形比较尖锐，分离度较好，故流动相可以为磷酸盐缓冲液(pH3.0):乙腈z65:35。进样量10pl。精密称定五份盐酸氨基葡萄糖样品约25mg，分别置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成五份样品溶液。每份溶液分别取lOpl各进样5次，单份溶液分析结果见表l。五份盐酸氨基葡萄糖样品的平均含量为99.21%，相对标准偏差为0.66%。表l盐酸氨基葡萄糖含量测定结果(『5)样品溶液序号百分含量RSD<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通过本发明的实施，完整地建立了盐酸氨基葡萄糖的高效，快速，准确和精确的定量分析方法，为盐酸氨基葡萄糖在食品、保健食品和药品的应用和检测奠定了良好的基础。权利要求1.一种氨基葡萄糖的分析方法，其特征在于采用以下方法定量分析a.氨基葡萄糖包括盐酸氨基葡萄糖及硫酸氨基葡萄糖；b.分析仪器采用采用高效液相色谱仪，反相色谱柱和紫外检测器；c.流动相为pH值为2.0-4.0的磷酸盐缓冲液和乙腈配制而成，其体积比为磷酸盐缓冲液∶乙腈＝20∶80-80∶20；优选65∶35。d.稳定高效液相色谱仪后，对色谱体系进样，流速为0.2-2ml/min。d.采用外标法测定样品含量。2.根据权利要求1所述的氨基葡萄糖的分析方法，其特征在于所述反相色谱柱中为氨基柱。3.根据权利要求1所述的氨基葡萄糖的分析方法，其特征在于所述反相色谱柱的长度为10-30cm，直径为3-10mm。4.根据权利要求1-3任一所述的氨基葡萄糖的分析方法，其特征在于所述的流速为0.6ml/miru5.根据权利要求1-3任一所述的氨基葡萄糖的分析方法，其特征在于所述的色谱分析时间为5-45min。6.根据权利要求1-3任一所述的氨基葡萄糖的分析方法，其特征在于所述的色谱分析时间为30min。7.根据权利要求1-3任一所述的氨基葡萄糖的分析方法其特征在于所述的进样量为2ul-20u1。8.根据权利要求1-7任一所述的氨基葡萄糖的分析方法，其特征在于所述的pH值为2.0-4.0的磷酸盐缓冲液乙腈的比例优选65:35。9.根据权利要求8所述的氮基葡萄糖的分析方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液的pH值为3.0。全文摘要本发明属于分析化学领域，具体的涉及一种氨基葡萄糖的高效液相色谱分析方法。通过本发明的实施，完整地建立了氨基葡萄糖的高效，快速，准确和精确的定量分析方法，为氨基葡萄糖在食品、保健食品和药品的应用和检测奠定了良好的基础。文档编号G01N30/00GK101271093SQ20081010577公开日2008年9月24日申请日期2008年5月5日优先权日2008年5月5日发明者司成桃申请人:北京诚创康韵医药科技有限公司