专利名称：定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术：
随着我国工业化程度的不断提高，水环境污染日益严重，尤其是海洋接纳了经 河流输入的污染物以及近岸城市排放的工业废水、生活废水和养殖废水。这些污染 物不仅破坏了海洋生物的生存环境，对海洋生物造成了严重的危害；而且也能够在 鱼类体内累积，进入人类的食物系统，造成了严重的食品安全问题，危害了人类的 健康。越来越多的报道指出海洋鱼类的雄鱼雌性化现象、鱼类繁殖能力的降低都与 内分泌扰乱化学物质的污染密切相关。能够扰乱人类及野生生物内分泌系统的污染 物统称为内分泌扰乱化学物质，即能够干扰人和动物体内激素的合成、释放、运输、 代谢，以及激素与受体的结合、功能的表达等一系列生物过程，从而扰乱人和动物 内分泌系统、神经系统和免疫系统的机能，甚至对生物后代生殖功能也能产生危害。 鉴于内分泌扰乱化学物质对野生生物和人类产生了严重的危害，迫切需要开发筛选 和检测内分泌扰乱化学物质的试剂盒，并应用到内分泌扰乱化学物质的检测、海洋 环境质量的评价、养殖鱼类的食品安全评价等领域。
鱼类卵黄原蛋白(Vitellogenin， VTG)是卵黄蛋白的前体，是一种大分子量的脂磷 聚糖蛋白(Glycolipophosphoprotein)。在雌鱼卵黄形成期，在雌激素的刺激下卵黄原 蛋白由肝脏合成，并通过血液运输到发育的卵巢中，被卵巢吸收；在卵巢内，卵黄 原蛋白裂解成为两种卵黄蛋白卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin)和卵黄高磷蛋白 (Phosvitin)，这两种蛋白贮存在卵中，作为胚胎发育的营养源。卵黄原蛋白是雌鱼的 特异性蛋白，只能在雌鱼卵黄形成期检测到。但是由于雄鱼的肝脏中也有卵黄原蛋 白基因，因而雌激素也能诱导雄鱼肝脏合成和分泌卵黄原蛋白。除内源雌激素外， 某些具有环境雌激素活性的内分泌扰乱化学物质，即使低浓度的内分泌扰乱化学物 质也能诱导雄鱼卵黄原蛋白的产生，起到类似于内源雌激素的作用。因而，卵黄原 蛋白是内分泌扰乱化学物质筛选和检测的理想生物标记物。在野生雄鱼中检测到卵 黄原蛋白表明海洋环境受到了内分泌扰乱化学物质的污染；在养殖雄鱼体内检测到 卵黄原蛋白表明养殖鱼类的食品安全受到了威胁，不适用于食用；此外卵黄原蛋白
还可以用于鉴定鱼类个体的性别和雌鱼的性成熟期。
目前国内外也建立了利用海洋鱼类卵黄原蛋白检测海洋内分泌扰乱化学物质的 试剂盒，但是由于鱼类分布的地域限制和鱼类卵黄原蛋白的种间差异，因而在我国 并不适用，而且所用的试剂盒价格昂贵，难以推广。真鲷在我国海域广泛分布，同 时也是主要的养殖鱼类；而且真鲷为肉食性，处于海洋食物链的顶端，能够富集内 分泌扰乱化学物质，因而可以用于内分泌扰乱化学物质的近海监测和实验室筛选研 究等方面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒及其制备方法和 应用。它能克服现有技术的上述缺点。
一种定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒，包括一个盒体，盒体内有PVDF膜1 张，以及显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗 鼠二抗各1支，其特征在于它还装有鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支、真鲷卵 黄原蛋白纯品1支。
上述定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒的制备方法，其特征在于由下述步骤组 成l)制备真鲷卵黄原蛋白纯品；2)制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体；3)将步骤 l)中得到的真鲷卵黄原蛋白纯品1支、步骤2)得到的鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗 体1支、PVDF膜1张，以及显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组血清和辣根过氧
化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支放到盒体内，得到定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂 盒。
上述定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒在海洋内分泌扰乱化学物质调查中的应用。
本发明的试剂盒利用抗原抗体之间的特异性结合能力，可灵敏、准确、方便的
检测真鲷卵黄原蛋白，其最低检测限为100ng m1/1，为内分泌扰乱化学物质筛选、
检测和海洋生态环境风险评价提供了一个有效的手段。
具体实施例方式
制备定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒时分为以下步骤 (l)制备真鲷卵黄原蛋白纯品
将10mgl7yS-雌二醇(17A-estradiol,E2)溶于0.5mL无水乙醇，再加入0.5mL花生 油中，充分混匀，配制17/ -雌二醇乳状液。取17/ -雌二醇乳状液进行真鲷腹腔注射，
注射剂的用量为0.5mL/条，10天后再进行尾静脉取血，4'C8000g离心5min，获得 卵黄原蛋白的血浆。取血浆lmL加入分子筛层析柱，填料为Sephacryl S-300,用含 0.07 MNaCl的25 mM Tris-HCl (pH7.5)洗脱，收集含真鲷卵黄原蛋白的样品用于离 子交换层析，填料为DEAE Sepharose Fast Flow,用含0.1M和0.2M NaCl的25 mM Tris-HCl进行不连续洗脱，采用部份收集器收集洗脱液，电泳鉴定后把含有真鲷卵 黄原蛋白纯品的等分试样-8(TC保存。
(2) 制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体
取纯化的真鲷卵黄原蛋白50mg与0.1 mL弗氏完全佐剂充分混匀，进行小鼠腹 腔注射进行第1次免疫。两周后进行第2次免疫，取纯化的真鲷卵黄原蛋白10 mg 与0.1mL弗氏不完全佐剂充分混匀，进行小鼠腹腔注射。以后每周注射l次，注射 液的剂量与第2次相同。于第5次注射后，在l周内连续注射两次，以加强免疫效 果，注射液的剂量均与第2次相同。小鼠尾静脉取血，釆用双向扩散法测定抗血清 效价。小鼠眼眶动脉取血，获得抗血清用于制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体。
采用亲和层析法制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体，所用的亲和层析填料为 CNBr-activated Sepharose 4B,取上述纯化的真鲷卵黄原蛋白与之结合；将抗血清用 PBS(由0.14MNaCl、 0.015M KH2P04、 0.075M Na2HP04、 0.027M KC1所组成，pH7.3) 稀释后，加入层析柱中循环过夜；用0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脱抗体，收集鼠抗真鲷 卵黄原蛋白多克隆抗体加入保存剂，-S(TC保存。
(3) 将制备的真鲷卵黄原蛋白纯品1支、鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支、 PVDF膜1张，以及显色液、封闭液、洗漆液、阴性对照组血清和辣根过氧化物酶标 记的羊抗鼠二抗各1支装入盒体，构成本发明的试剂盒。其具体组成如下
1) PVDF膜1张；
2) 真鲷卵黄原蛋白标准品l支，使用前用双蒸水稀释到lmgmL—1;
3) 阴性对照组血清1支，使用前用双蒸水按1:100的体积比稀释；
4) 鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支，使用前用封闭液按1:200的体积比稀
释；
5) 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗1支，使用前用封闭液按1:500的体积比
稀释；
6) 显色液、封闭液、洗涤液各1支，所述的显色液为0.06%的3，-二氨基联苯胺 (DAB)的Tris-HCl， pH7.6，用前每10mL显色液加入10 30%的双氧水；封闭液
为含5°/。脱脂奶的TBST(由100 mM Tris-HCl、 150 mM NaCl、 0.05% Tween-20所组 成，pH7.5);洗涤液为TBST， pH7.5。
本发明的定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒可用于海洋内分泌扰乱化学物质调 査。使用时分为以下步骤
1) 将试剂盒中的真鲷卵黄原蛋白纯品、阴性对照组血清和待测真鲷血浆样品稀 释后，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
2) 把电泳凝胶转印到PVDF膜上；
3) 用封闭缓冲液封闭PVDF膜上的非特异性结合位点，室温下振摇孵育，弃去 溶液，用洗涤液洗漆PVDF膜3次；
4) 加入用封闭液稀释的鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体，室温下振摇孵育，弃 去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；
5) 加入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，室温下振摇孵育， 弃去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；
6) 加入显色液显色，待蛋白质条带清晰后，弃去显色液用蒸馏水终止显色反应；
7) 在雄性真鲷血浆样品中发现有显色条带，表明该鱼生活的海域受到了内分泌 扰乱化学物质的污染。
权利要求
1、一种定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒，包括一个盒体，盒体内有PVDF膜1张，以及显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支，其特征在于它还装有鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支、真鲷卵黄原蛋白纯品1支。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述真鲷卵黄原蛋白纯品为标准 浓度的真鲷卵黄原蛋白纯品。
3、 权利要求1所述的定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒的制备方法，其特征在 于由下述步骤组成l)制备真鲷卵黄原蛋白纯品；2)制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆 抗体；3)将步骤l)中得到的真鲷卵黄原蛋白纯品1支、步骤2)得到的鼠抗真鲷卵黄 原蛋白多克隆抗体1支、PVDF膜1张，以及显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组 血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支共同装入盒体，得到真鲷卵黄原蛋 白定性检测试剂盒。
4、 权利要求1所述的真鲷卵黄原蛋白定性检测试剂盒在海洋内分泌扰乱化学物 质调查中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种定性检测真鲷卵黄原蛋白的试剂盒及其制备方法和应用。制备时，首先制备真鲷卵黄原蛋白纯品；其次制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体；然后将真鲷卵黄原蛋白纯品1支、鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支、PVDF膜1张，以及显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支共同装入盒体，得到真鲷卵黄原蛋白定性检测试剂盒。本发明的试剂盒可以应用到海洋内分泌扰乱化学物质的调查中，能够灵敏、准确、方便的定性检测真鲷血液中、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵黄原蛋白。
文档编号G01N33/53GK101393219SQ20081015820
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者汝少国, 潘宗保, 欣 邴 申请人:中国海洋大学