专利名称：一种基于可视化蛋白芯片的食物过敏原检测方法
技术领域：
本发明涉及一种可视化蛋白芯片的检测方法，特别是涉及食品过敏原的快速及通
量化检测。
背景技术：
食物过敏原通常是一些水溶性或盐溶性糖蛋白，倾向于耐热、耐酸、耐酶解(果蔬 过敏原例外)，在简单的加工或消化过程中不会被破坏掉，仍会引发过敏症，其症状轻则出 现皮肤骚痒、腹泻等问题，重则发生休克死亡，故而食物过敏原的检测有着重大的意义。目 前，食物过敏原的常用检测方法主要有如下几种 1、皮肤试验法，主要指划痕试验、点剌试验、皮内注射实验，该法虽快捷，但结果的 特异性和敏感性差，给患者造成痛苦，不安全和不易定量等问题，常造成假阳性和假阴性结 果。 2、双盲实验，准确度较高，但是由于体内实验不确定性因素较多，而且给患者造成 较大的不便和痛苦。 3、基因法，该法虽然检测限比较低，方法灵敏，但假阳性率相对较高，且操作麻烦。
4、免疫法，主要有放射过敏原吸附抑制试验，、免疫杂交电泳、酶联免疫等。其中 放射性的危险限制了放射过敏原吸附抑制试验的广泛应用，免疫杂交电泳存在定量难的问 题。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏、快速、简便、通量化、特异性好的应用于食品过敏 原的可视化蛋白芯片检测方法，所需样本极微量，检测成本低。
本发明所提供的可视化蛋白芯片检测方法，包括如下步骤
1)以手动式点样仪将捕获抗体点至琼脂糖三维基片上； 2)待测抗原与预制好的蛋白芯片进行杂交，加入以辣根过氧化物酶(HRP)标记的 待测蛋白的检测抗体； 3)加入沉淀型TMB与蛋白芯片进行杂交，然后以H2S04或水洗终止反应，检测样品 点处的色素沉积。 其中，HRP标记的待测蛋白检测抗体的方法参照文献(PAUL K.NAKANE ANDAKIRA KAWAOI， THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY ANDCYTOCHEMISTRY，1974，22(12) :1084-1091) 制备，HRP标记抗体的使用浓度为0. 5-5ug/ml， H2S04浓度为2mol/L。 本发明方法能应用于食物过敏原的快速可视检测，能检测到待检蛋白的蛋白芯片 含有食物过敏原的兔多克隆抗体。 辣根过氧化物酶(HRP) —种含亚铁血红素的蛋白质，具有来源广泛，标记操作简 便，标记效率高等特点。本发明利用辣根过氧化物酶作为待测蛋白检测抗体的标记物，加入 的沉淀型TMB (3， 3' 5， 5——四甲基联苯胺)在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和待测蛋白的量呈正相关。本方法操作简单，能同 时实现对多个待检样本的检测，其检测限可达到10ng/ml以下，与荧光检测的灵敏度相当， 并且具有设备简易，成本低廉的优点。
图1蛤蜊过敏原浓度与灰度值间的关系图
图2海鱼过敏原浓度与灰度值间的关系图
图3芯片重复性实验结果
具体实施例方式
实施例1、蛤蜊及海鱼鱼过敏原的检测
1、制备抗体蛋白芯片 蛋白芯片的制备方法参见文献(金世辉、刘必成，张春秀等，中国生物工程杂志， 2005， 25 (2) :57-60)，所用的蛤蜊、海鱼抗原及其捕获抗体均为实验室自制。
2、辣根过氧化物酶(HRP)标记检测抗体 将抗蛤蜊及海鱼抗原的鼠单克隆抗体参照文献(PAUL K. NAKANE ANDAKIRA KAWAOI， THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY ANDCYTOCHEMISTRY,1974，22(12) :1084-1091)
中所述的方法进行标记。
3、芯片杂交 将抗体蛋白芯片放入芯片反应盒内，加入不同浓度待测的蛤蜊及海鱼抗原样品， 25ul/区域，蛤蜊及海鱼抗原浓度为10，50，100，500ng/ml，l，5，10ug/ml，孵育1小时后，加 入2ug/ml的HRP标记的抗蛤蜊的鼠单克隆抗体，15ul/区域，孵育1小时，加入TMB显色液， 避光作用20min，后以2mol/L硫酸终止使其变成褐色的可目视检测的样点。
4、实验结果检测 以平板扫描仪扫描获得检测图像，数据采用软件处理获得各点的灰度值。 各检测点的灰度与过敏原的浓度关系如图1和图2所示。图1为蛤蜊过敏原浓度
与灰度值的关系图，图2为海鱼过敏原浓度与灰度值的关系图。由图1和图2可见，利用HRP
标记鼠单克隆抗体，采用双抗夹心式杂交方法，具有较高的检测灵敏度，对10ng/ml的蛤蜊
及海鱼抗原均能较好地检出。 实施例2、芯片的重复性 1、制备抗体蛋白芯片 蛋白芯片的制备方法参见文献(金世辉、刘必成，张春秀等，中国生物工程杂志， 2005， 25 (2) :57-60)，采用兔抗蛤蜊制备抗体芯片。
2、辣根过氧化物酶(HRP)标记检测抗体 将抗蛤蜊抗原的鼠单克隆抗体参照文献(PAUL K. NAKANE AND AKIRAKAWAOI， THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY ANDCYTOCHEMISTRY, 1974， 22 (12) :1084-1091)中所述的方法 进行标记。 3、芯片杂交 将抗体蛋白芯片放入芯片反应盒内，加入三个不同浓度待测的蛤蜊抗原样品，25ul/区域，蛤蜊抗原浓度分别为5， 10， 15ng/ml。设三个平行的芯片，每个芯片上每个浓度 重复两个区域，每个区域设9个点样点，与芯片反应1小时后，加入HRP标记的抗蛤蜊的鼠 单克隆抗体，15u1/区域，孵育1小时，加入TMB显色液，避光作用20min，后以2mol/L的硫 酸终止使其变成褐色的可目视检测的样点。
4、实验结果检测 以平板扫描仪扫描获得检测图像，数据采用软件处理可获得各点的灰度值。
由图3可见，该检测方法的重复性较好。
实施例3芯片的特异性检测
1、制备抗体蛋白芯片 蛋白芯片的制备方法参见文献(金世辉、刘必成，张春秀等，中国生物工程杂志， 2005， 25 (2) :57-60)，采用兔抗蛤蜊制备抗体芯片。
2、检测的抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记 将抗蛤蜊抗原的鼠单克隆抗体参照文献(PAUL K. NAKANE AND AKIRAKAWAOI， THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, 1974， 22 (12) :1084-1091)中所述的方
法进行标记。 3、芯片杂交 将抗体蛋白芯片放入芯片反应盒内，分别加入10ng/ml的牛奶、南美白对虾、海鱼 及蛤蜊过敏原，25ul/区域，设三个平行的芯片，每个芯片上每种过敏原重复两个区域，每个 区域设9个点样点，与芯片反应l小时后，加入HRP标记的抗蛤蜊的鼠单克隆抗体，15ul/区 域，孵育1小时，加入TMB显色液，避光作用20min，后以2mol/L的硫酸终止，使其变成褐色 的可目视检测的样点。
4、实验结果检测 以平板扫描仪扫描获得检测图像，数据采用软件处理可获得各点的灰度值。
实验结果表明，该法特异性较强。
权利要求
一种基于可视化蛋白芯片的食物过敏原检测方法，包括如下的步骤1)以手动式点样仪在基片上点制3×3的矩阵。2)待测抗原与预制好的蛋白芯片进行杂交，加入以辣根过氧化物酶(HRP)标记的待测蛋白的检测抗体；3)加入沉淀型TMB(3，3’5，5-四甲基联苯胺)与蛋白芯片进行杂交，然后以H2SO4或水洗终止反应，检测样品点处的色素沉积。
2. 根据权利要求1所述步骤1中的基片为表面铺有琼脂糖的玻片。
3. 根据权利要求l所述步骤l中的点阵，水平方向点距为1250iim，竖直方向点间间距 为750 ii m，点的大小为500-1000 ii m。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述HRP标记抗体方法参照文献 (PAUL K. NAKANE AND AKIRA KAWAOI，THEJOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, 1974,22(12) :1084-1091) ， HRP标记抗体的使用浓度为0. 5_5ug/ml。
5. 根据权利要求1所述的步骤3中的H2S04浓度为2mol/L。
6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述待测蛋白为食物过敏原，所述能 检测到待检蛋白的蛋白芯片含有该待检蛋白的抗体(兔抗)。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白芯片的检测方法。本发明所提供的蛋白芯片检测方法，包括如下步骤1)以手动点样仪点制所需的抗体芯片；2)以辣根过氧化物酶标记待测蛋白的抗体，与芯片进行杂交；3)加入沉淀型TMB显色液进行反应，扫描并分析样点的灰度值。本发明方法重复性好，特异性强，敏感性高，操作简便，可以实现对多种待测蛋白的同时检测，所需样本极微量，结果形象、直观，无需昂贵的检测设备，成本低廉。
文档编号G01N33/543GK101738469SQ20081015924
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者张轶群, 李小燕, 李振兴, 林洪 申请人:中国海洋大学