糖化血红蛋白酶法检测试剂盒的制作方法

专利名称：：糖化血红蛋白酶法检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物制剂
技术领域：
，具体说涉及一种糖化血红蛋白酶法检测试剂盒。
背景技术：
：世界卫生组织估计，全世界有1.8亿人患有糖尿病。糖化血红蛋白(糖化Hb)对于糖尿病患者来说是一个非常重要的检查指标。，HbAlc为Hb的e链N末端的a氨基被糖化的糖化Hb，在糖化Hb中，也被作为糖尿病诊断等的特别重要的指标。目前，HbAlc的测定方法主要有离子交换层析法、高效液相色谱法、亲和层析法、放射免疫法、酶免疫法和胶乳免疫凝集法等，以上方法或是需专业的昂贵设备、或是检测准确度、抗干扰性、速度等尚不理想，一定程度上限制了其在临床上的大规模应用。糖化血红蛋白酶法检测试剂利用了氧化还原反应，克服了上述几种方法的灵敏度较低、重复性差、耗时难以大量检测等缺点，具有检测灵敏度高、反应产物无污染且抗干扰能力强等优点，并符合糖化血红蛋白临床检测要求快速、大批量、经济的特点，有利于临床大规模应用。利用上述氧化还原反应的糖化Hb的测定，依据下列方法进行。首先，将含有糖化Hb的样品用蛋白水解酶处理，使得糖化蛋白质分解为较小的糖化肽片段和糖化氨基酸；然后，将果糖缬氨酸氧化酶(FVO)作用于该糖化蛋白质的分解物，进行氧化还原反应;上述氧化还原反应产生的过氧化氢的量与参与反应的糖化蛋白的量成正比，糖化蛋白质在FVO作用下产生的过氧化氢与因氧化而显色的基质通过过氧化物酶进行反应，通过测定显色基质的显色量，可确定过氧化氢的量。在此，显色基质可以使用N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺(简称DA-64)。然而，利用现有果糖基氨基酸氧化酶催化该反应，时间仍嫌稍长，酶量需求较高。所以要求开发一种新型具有高活性、检测时间短及准确度高的糖化血红蛋白酶法检测试剂盒。
发明内容本发明的目的在于克服上述不足，提供一种具有高活性的糖化血红蛋白检测试剂盒，其中的高活性酶可更快速地与糖化肽片段或糖化氨基酸反应，生成过氧化氢，在相同底物量的反应体系中，所需的酶量也更少。可降低生产成本，,反应时间，便于更快速的进行大批量样品检测。本发明的糖化血红蛋白酶法检测试剂盒，其是由溶血缓冲液、试剂Rla、试剂Rib和试剂2组成的，其中溶血缓冲液为10-1000mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000mmol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS)，1-100g/L聚氧化乙紐十二烷基醚；试剂Rla为100-10000kU/L金属蛋白酶，0.1-10讓ol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐；试剂Rlb为0.1-10mmoI/L吗啉代乙基磺酸(MES)，0.5-50謹ol/LCaCl2;试剂2为1-100kU/L高活性果糖缬氨酸氧化酶，30-600kU/L过氧化物酶(POD)，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4,4双偶(二甲胺)-二苯胺钠盐(DA-64)，10-1000mmol/LTris-HCl。该试剂盒利用氧化还原反应，通过高活性果糖缬氨酸氧化酶使糖化血红蛋白释放出H202，11202在过氧化物酶(POD)作用下使显色底物N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺(简称DA-64)氧化而显色，通过测定显色量可知样品中糖化血红蛋白的量。该试剂盒所述高活性果糖缬氨酸氧化酶为FVO-m-21，其含有SEQID.No.1所示核苷酸序列和SEQID.No.2所示氨基酸序列。其制备方法步骤如下(1)以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR扩增，建立果糖缬氨酸氧化酶的突变文库；(2)将突变文库转入大肠杆菌，对其基因进行克隆、重组转化和表达；(3)利用醌法测定酶活性，筛选出髙活性果糖缬氨酸氧化酶。棒状杆菌属Corynebacteriumsp.2-4-1菌株含有果糖基缬氨酸氧化酶(FVO)的编码基因。本发明基于FVO的基因编码序列，设计两条FVO基因的易错PCR引物，上游引物序列为5，-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3，，下游引物序列为5，-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3，。以FVO的基因编码序列作为模板，进行易错PCR扩增，经扩增35个循环后，PCR产物纯化西收，与原核表达载体pMD-18TVector连接，转化入大肠杆菌XL1-Red中，涂布LB平板，收集含有插入片段的克隆，组成突变体库。提取突变体库中的质粒DNA，酶切，回收目的片段，连接入载体pGEX-4T-lm，转化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖缬氨酸和N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺[DA-64]的LB平板，由于大肠杆菌自身含有过氧化物酶，故37。C培养12-24小时后，可见明显变色现象。挑取变色快和变色圈大的克隆进行液体培养基培养。将初步筛选出的克隆在25'C液体培养基中培养48小时，诱导表达，裂解细菌，利用醌法测定酶活性，最终得到一株酶活性约为普通果糖缬氨酸氧化酶活性6倍的高活性菌株，其所携带的FVO突变命名为FV0-m-21。通过测序分析发现，该突变克隆中发生五个碱基点突变，分别是碱基序列中57位C—T、374位T—C、534位G—A、914位C—A和1056位G—C，共引起了两个氨基酸突变，分别是氨基酸序列中125位lie—Thr和305位Ala—Glu。作为进一步优选，本发明试剂盒的组成如下溶血缓冲液为100-800mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，试剂Rlb为试剂Rla为100-800mmol/L吗啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；100-8000kU/L金属蛋白酶，0.4-9mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐；0.4-9mmol/L吗啉代乙基磺酸，0.8-40mmol/LCaCl2;试剂2为:1-100kU/L高活性果糖缬氨酸氧化酶FV0-m-21，30-600kU/L过氧化物酶，0.05-0.4mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4双偶(二甲胺)-二苯胺钠10-1000訓ol/LTris-HCl。作为最优选，溶血缓冲液为本发明试剂盒的组成如下:500mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，500mmol/L吗啉代丙烷磺酸，50g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；试剂Rla为500kU/L金属蛋白酶，5謹ol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐；试剂Rlb为5mmol/L吗啉代乙基磺酸，12蘭ol/LCaCl2;试剂2为60kU/L高活性果糖缬氨酸氧化酶FVO-m-21，200kU/L过氧化物酶，0.4mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4双偶(二甲胺)-二苯胺钠盐，700腿ol/LTris-HCl。本发明糖化血红蛋白酶法检测试剂盒具有高活性，其中的高活性酶可更快速地与糖化肽片段或糖化氨基酸反应，生成过氧化氢，在相同底物量的反应体系中，所需的酶量少，可降低生产成本，縮短反应时间，符合糖化血红蛋白临床检测要求快速、大批量、经济的特点，有利于临床大规模应用。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但并不仅限于下述实施例。实施例1:高活力果糖缬氨酸氧化酶FVO-m-21'的获得。一、以Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因编码序列为模板，进行易错PCR扩增。1.引物序列正向引物5'-TTGTTCGGATCCATGTCCTCCACCGCTAC-3，反向引物5，-TTGTTCAAGCTTCTAGGAGAACCGGCCCG-3，2.易错PCR反应体系和反应条件PCR反应体系100HL体系中含有10mMTris-HClpH8.30，50mMKC1，6.5mMMgCl2，0.15mMMnCl2，0.2mMdGTP/dATP，0.8mMdTTP/dCTP，2.2[igSSBProtein,0.5nM正向/反向引物，10ng模板DNA2.5单位TaqDNA聚合酶。PCR反应条件94。C5min;94。C30sec,55°C30sec，72。C2min，35个循环；72°C10min;斗。Cforevero3.易错PCR产物取3^iL于in/。的琼脂糖凝胶电泳，可见lkb左右有产物条带。将易错PCR产物用纯化回收试剂盒纯化回收，与pMD-l8TVector连接，转化入大肠杆菌XLl-Red中，涂布Amp抗性LB平板，可获得Corynebacteriumsp.2-4-1的FVO基因的突变体库。二、突变体菌株的初筛提取突变体库中的质粒DNA，用BamHI和HindIII双酶切，回收lkb左右的目的片段，载体pGEX-4T-lm同样用BamHI和HindlII双酶切，回收，二者4'C连接过夜，转化入BL-21菌株，涂布于含有IPTG、果糖缬氨酸和N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨萄-联苯胺[DA-64]的LB平板，37。C培养12-24小时后，可见明显变色现象。挑取变色快和变色圈大的克隆进行液体培养基培养，共挑取克隆48个。三、突变体酶活性的醌法检测1.在诱导表达4小时后，收集菌液，测量并且记录细胞培养物的OD600值。2.制备检测酶活的细菌裂解液。在374pLB-PERtm细菌蛋白抽提试剂(Pierceproduct78248)中重新悬浮细胞，再加入50uL蛋白酶和磷酸化酶抑制剂以及细菌细胞提取物(Sigma产品P8465)，1uL34mg/mL的氯霉素(用甲醇配制)。快速涡旋振荡一分钟。在冰上放置5min。离心1min后置于冰上。3.用Bradford法测定蛋白含量。4.取50nL上述细菌裂解液加到醌法反应混合液中，37'C温浴1-3min，测量555nm处吸光值。反应混合液成分为lOOmM磷酸钾缓冲液(pH8.0)，1purpurogallinunit/ml过氧化物酶，0.45mM4-氨基安替吡啉，0.5mMTOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)，5.0mM果糖缬氨酸，总体积为3mL。其中，一个酶活力单位定义为在37'C每分钟可催化产生0.5nM醌染料。实际酶活力按每分钟每mg蛋白质所形成的nmol产物来测定。四、高活性突变FVO的序列测定通过酶活力测定，筛选出活力约为普通果糖缬氨酸氧化酶活力6倍的高活突变。提取质粒DNA，测序发现该突变序列如SEQID.No.l所示。其中发生突变的位点，为57位C—T、374位T—C、534位G—A、914位C—A和1056位G—C。对应的氨基酸序列如SEQID.No.2所示。其中发生突变的氨基酸位点，共有两个氨基酸突变，分别是氨基酸序列中125位ITe—Thr和305位Ala—Glu。实施例2以蒸馏水为溶剂，按照常规配制试剂方法配制糖化血红蛋白酶法检测试剂盒各配方，如表1所示。表l糖化血红蛋白酶法检测试剂盒各配方<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3从患者采集全血(患者数35名)，红细胞自然沉降回收，取20uL沉降的红细胞部分，向其中加入本发明试剂盒溶血缓冲液500yL。将得到的30uL溶血试样与40uL试剂Rla和40ixL试剂Rlb混合，于37。C温浴3分钟，读取吸光度A1。再向反应体系中加入20uL试剂2，于37X:温浴2处钟，读取吸光度A2。AA=A2—A1。测定时可选择751nm和571nm处的吸光值。其中，HB、浓度可由波长751nm处的吸光度求出，HbAlc浓度可由波长571nm处的吸光度求出。计算公式厶A测定HbAlc浓度(％)-HbAlc标准浓度X-AA标准实施例4将实施例3中试剂2中的FVO-m-21替换为普通FVO,其他条件一致。具体时间，以方便和实施例3中的时间作对比。表2表示为本发明糖化血红蛋白酶法检测试剂盒与用普通酶检测试剂盒测量精度对比表。以本发明糖化血红蛋白酶法检测试剂盒测量值为横坐标，普通酶检测试剂盒测量值为纵坐标，拟合直线,得到实施例的相关式为"y=1.0009x+2.0218,R2=0.9978";"y=0.9973x+2.0345,R2=0.9991"。由此可知本发明试剂盒的测量精度与普通试剂盒几乎一致，因此本发明试剂盒可以以优良的精度测定糖化血红蛋白。表2本发明试剂盒与用普通试剂盒测量精度对比<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以上实施例是对专利的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>宁波美康生物科技有限公司<120>糖化血红蛋白酶法检测试剂盒<130>002<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1119<212>DNA<213>Corynebacteriumsp.<220><221>CDS<222>(1)..(1119)<400>1atgtectecaccgetaccaagcatgtcgccgtcattggcggcggcate48MetSerSerThrAlaThrLysHisValAlaVallieGlyGlyGlyHe151015ctgggcgtttecaccgccgtccacctgetccgccaaggcgeaacagtc96LeuGlyValSerThrAlaValHisLeuLeuArgGinGlyAlaThrVal202530accetcttgaccgaacagggcetcgccagegaagccacgggceggtec144ThrLeuLeuThrGluGinGlyLeuAlaSerGluAlaThrGlyArgSer3540'45ttgtectggetcaactecgccggggaacgctecactccctatcaccag192LeuSerTipLeuAsnSerAlaGlyGluArgSerThrProTyrHisGin505560ctgcgcategetggcgttgaceggtaccgcacgctgttcgccgccgat240LeuArgHeAlaGlyValAspArgTyrArgThrLeuPheAlaAlaAsp65707580cccageegggaatggttgcagttcgggggcgggetcatgtggaacgcc288ProSerArgGhiTrpLeuGinPheGlyGlyGlyLeuMetTrpAsnAla859095gccggggaaagtgaggtcaccaaagcceggcacgcctacgagaagtec336AlaGlyGluSerGluValThrLysAlaArgHisAlaTyrGluLysSer100105110ateggctacgacteccaactgctggcccctgaagaaaccggcteggtc384lieGlyTyrAspSerGinLeuLeuAlaProGluGluThrGlySerVal115120125acgccaggcategacgccagtgccgtcccggagaacgcaatettcaat432ThrProGlylieAspAlaSerAlaValProGluAsnAlaliePheAsn130135140cctggcgagggctgggtcagectgccggacctggtgaacttcctgatg480ProGlyGluGlyTrpValSerLeuProAspLeuValAsnPheLeuMet145150155160gaggaattccacgccctgggcggccagttggtcetcaacgcaggtaaa528GluGluPheHisAlaLeuGlyGlyGinLeuValLeuAsnAlaGlyLys165170175gccteagtgatggtcgagggcggcegggetaccgcggtcgaaaccgcc576AlaSerValMetValGluGlyGlyArgAlaThrAlaValGluThrAla180185190accggtgaaacctaccccgcggacgccgttetcgtagcctgcggtgcc624ThrGlyGluThrTyrProAlaAspAlaValLeuValAlaCysGlyAla195200205gcgacgccggccgtcgtaaaaccgetcggggtcgagataccgaacggt672AlaThrProAlaValValLysProLeuGlyValGluHeProAsnGly210215220tecccggtctecatgctggttgttaccaagcccgtggagcaccaggtc720SerProValSerMetLeuValValThrLysProValGluHisGinVal225230235240gcggcagtgatgaatacgccgcgcgetgccgtgcgacccaatccgggt768AlaAlaValMetAsnThrProArgAlaAlaValArgProAsnProGly245250255aacacttttgccttggatcacgactggiaigaagggcacateactgag816AsnThrPheAlaLeuAspHisAspTrpTyrGluGlyHislieThrGlu260265270cacgcggacggttcgttcaccateccggatgatgtcgtccaggaattg864HisAlaAspGlySerPheThrlieProAspAspValValGinGluLeu275280'285gcagacgagteatecaagctgategcaggaaaccccgagetcaagccg912AlaAspGluSerSerLysLeulieAlaGlyAsnProGluLeuLysPro290295300gaatcgtggaagateggttacaagccgateccgggcgacggcgaacca960GluSerTrpLyslieGlyTyrLysProlieProGlyAspGlyGluPro305310315320gtcttcggggaaetcggccgagtaccgggctgcttcgtggetttcacc1008ValPheGlyGluLeuGlyArgValProGlyCysPheValAlaPheThr325330335cacteaggtgccaccctgggcetcategcaggcgaattgetctecggc1056HisSerGlyAlaThrLeuGlyLeulieAlaGlyGluLeuLeuSerGly340345350cagatectgacgggggacaagcaccccatgttcgccacgttceggccg1104GinlieLeuThrGlyAspLysHisProMetPheAlaThrPheArgPro355360365ggceggttctectag1119GlyArgPheSer370<210>2<211>372<212>PRT<213>Corynebacteriumsp.<400>2MetSerSerThrAlaThrLysHisValAlaVallieGlyGlyGlylie151015LeuGlyValSerThrAlaValHisLeuLeuArgGinGlyAlaThrVal202530ThrLeuLeuThrGluGinGlyLeuAlaSerGluAlaThrGlyArgSer354045LeuSerTrpLeuAsnSerAlaGlyGluArgSerThrProTyrHisGin505560LeuArglieAlaGlyValAspArgTyrArgThrLeuPheAlaAlaAsp65707580ProSerArgGluTrpLeuGinPheGlyGlyGlyLeuMetTrpAsnAla859095AlaGlyGluSerGluValThrLysAlaArgHisAlaTyrGluLysSer100105110lieGlyTyrAspSerGinLeuLeuAlaProGluGluThrGlySerVal115120125ThrProGlylieAspAlaSerAlaValProGluAsnAlaliePheAsn130135140ProGlyGluGlyTrpValSerLeuProAspLeuValAsnPheLeuMet145150155160GluGluPheHisAlaLeuGlyGlyGinLeuValLeuAsnAlaGlyLys165170175AlaSerValMetValGluGlyGlyArgAlaThrAlaValGluThrAla180185190ThrGlyGluThrTyrProAlaAspAlaValLeuValAlaCysGlyAla195200205AlaThrProAlaValValLysProLeuGlyValGlulieProAsnGly210215220SerProValSerMetLeuValValThrLysProValGluHisGinVal225230235240AlaAlaValMetAsnThrProArgAlaAlaValArgProAsnProGly245250255AsnThrPheAlaLeuAspHisAspTrpTyrGluGlyHisHeThrGlu260265270HisAlaAspGlySerPheThrlieProAspAspValValGinGluLeu275280285AlaAspGluSerSerLysLeulieAlaGlyAsnProGluLeuLysPro290295300GluSerTrpLyslieGlyTyrLysProIfeProGlyAspGlyGhiPro305310315320ValPheGlyGluLeuGlyArgValProGlyCysPheValAlaPheThr325330335HisSerGlyAlaThrLeuGlyLeulieAlaGlyGluLeuLeuSerGly340345350GinlieLeuThrGlyAspLysHisProMetPheAlaThrPheArgPro355360365GlyArgPheSer370权利要求1、一种糖化血红蛋白酶法检测试剂盒，其特征在于该试剂盒是由溶血缓冲液、试剂R1a、试剂R1b和试剂2组成的，其中溶血缓冲液为10-1000mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000mmol/L吗啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；试剂R1a为100-10000kU/L金属蛋白酶，0.1-10mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐；试剂R1b为0.1-10mmol/L吗啉代乙基磺酸，0.5-50mmol/LCaCl2；试剂2为1-100kU/L高活性果糖缬氨酸氧化酶，30-600kU/L过氧化物酶，0.01-0.5mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4双偶(二甲胺)-二苯胺钠盐，10-1000mmol/LTris-HCl。2、根据权利要求1所述的糖化血红蛋白酶法检测试剂盒，其特征在于所述高活性果糖缬氨酸氧化酶为FVO-m-21，其含有SEQID.No.1所示核苷酸序列和SEQID.No.2所示氨基酸序列。3、根据权利要求2所述的糖化血红蛋白酶法检测试剂盒，其特征在于.-溶血缓冲液为100-800mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，100-800mmol/L吗啉代丙烷磺酸，1-100g/L聚氧化乙烯十二垸基醚；试剂Rla为100-8000kU/L金属蛋白酶，0.4-9mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)陽5陽(2，4-二磺苯基)-211四唑钠盐；试剂Rib为0.4-9mmoI/L吗啉代乙基磺酸，0.8-40mmol/LCaCl2;试剂2为1-100kU/L高活性果糖缬氨酸氧化酶FVO-m-21，30-600kU/L过氧化物酶，0.05-0.4mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4双偶(二甲胺)-二苯胺钠盐，'10-1000mmol/LTris-HCl。4、根据权利要求3所述的糖化血红蛋白酶法检测试剂盒，其特征在于溶血缓冲液为500mmol/LN-环乙寧-2氨基乙烷磺酸，500mmol/L吗啉代丙烷磺酸，50g/L聚氧化乙烯十二垸基醚；试剂Rla为500kU/L金属蛋白酶，5蘭ol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-211四唑钠盐；试剂Rlb为5mmol/L吗啉代乙基磺酸，12mmol/LCaCl2;试剂2为60kU/L高活性果糖缬氨酸氧化酶FVO-m-21，200kU/L过氧化物酶，0.4mmol/LN-(羧甲基氨羰基)-4，4双偶(二甲胺)-二苯胺钠，700腿ol/LTris-HCl。全文摘要本发明涉及一种糖化血红蛋白酶法检测试剂盒，由溶血缓冲液、试剂R1a、试剂R1b和试剂2组成，其中溶血缓冲液为10-1000mmol/LN-环乙基-2氨基乙烷磺酸，10-1000mmol/LMOPS，1-100g/L聚氧化乙烯十二烷基醚；试剂R1a为100-10000kU/L金属蛋白酶，0.1-10mmol/L2-(碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺苯基)-2H四唑钠盐；试剂R1b为0.1-10mmol/LMES，0.5-50mmol/LCaCl₂；试剂2为1-100kU/L高活性果糖缬氨酸氧化酶，30-600kU/LPOD，0.01-0.5mmol/LDA-64，10-1000mmol/LTris-HCl。该试剂盒符合糖化血红蛋白临床检测要求快速、大批量、经济的特点，有利于临床大规模应用。文档编号G01N21/78GK101358229SQ200810166329公开日2009年2月4日申请日期2008年9月23日优先权日2008年9月23日发明者姜云飞,邹炳德申请人:宁波美康生物科技有限公司