专利名称：亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种亚硝基硫醇定量检测用的试剂盒，适用于与亚硝基硫醇和一氧化氮信号 通路相关疾病的病因及发病机理的基础研究，适用于各种环境或化学因素引起的亚硝基硫 醇水平变化的定量检测。
背景技术：
亚硝基硫醇(S-nitrosothiol, SNO)是一氧化氮与硫醇类化合物形成的酯，在一氧化氮 信号通路中起重要作用。SNO的形成可保存NO的生物学活性，并能调节蛋白活性，在生 理和病理条件下，SNO信号通路可能上调或者下调，因此，亚硝基硫醇作为某些疾病的生 物标志物有非常重要的价值。
国内外多年来一直致力于研究有效的SNO检测方法，现有方法中有的检测灵敏度较 低；有的检测灵敏度较高但需要昂贵的设备、特异性抗体以及样品处理非常复杂。 Saville-Griess方法是一种比较简单的SNO检测方法，其中可见光的分析方法灵敏度较低， 可用于某些细胞实验。目前国内外尚无可用于SNO定量检测的试剂盒。
发明内容
本发明的任务是在Saville-Griess方法基础上加以修饰，并提供一套预先由生产厂家称 量配制和分装好，临时用只需简单操作即能使用的试剂盒。提供灵敏、简便、不需要昂贵 试剂盒设备的SNO检测方法，并且样品处理简单，可广泛用于生理病理条件下SNO浓度
本发明的技术方案是
将生物样品分为两份， 一份加入不含氯化汞的磺胺溶液， 一份加入含氯化汞的磺胺溶 液，观察有无沉淀产生；如果有，则需要将样品离心，上清液加入一份N-l-萘二胺二氢氯 化物(NED)溶液显色，用可见光测定产物，并通过标准曲线计算得到SNO的浓度。
本发明的一种亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒，包括装不同试剂的五个试剂瓶 试剂瓶1 、试剂瓶2 、试剂瓶3 、试剂瓶4 、试剂瓶5，盒体，盒盖，带孔固定板， 以及试剂盒说明书，五个试剂瓶由带孔固定板分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂 瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶1中装有溶于5wt。/。磷酸的磺胺 溶液，试剂瓶2中装有含氯化汞的5wty。磷酸溶解的磺胺溶液，试剂瓶3中装有N-l-萘二胺 二氢氯化物，试剂瓶4中装有磺基水杨酸，试剂瓶5中装有NaN02标准溶液。
所述的试剂瓶1为黑色塑料瓶，瓶内封闭包装溶于5wt。/。磷酸的磺胺溶液lOOmL，磺胺浓 度lg/100raL溶液。
所述的试剂瓶2为黑色塑料瓶，瓶内封闭包装含3. 7mM氯化汞的5wty。磷酸配置的磺胺 溶液100mL，磺胺浓度lg/100mL溶液。
所述的试剂瓶3为黑色塑料瓶，瓶内封闭包装100mL含有N-l-萘二胺二氢氯化物0. lg溶液。
所述的试剂瓶4为白色塑料瓶，瓶内封闭包装5% (g/ml)磺基水杨酸溶液lOOmL。 所述的试剂瓶5为白色塑料瓶，瓶内封闭包装0. 1M NaN02标准溶液10 mL。 本亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒的盒体和盒盖用硬纸或薄塑料板制作，固定板 用塑料泡沫板制作。
使用本发明时，操作者按照试剂盒说明书操作使用，就可以测定各类细胞样品亚硝基 硫醇浓度。本发明简化了实验操作中的很多繁杂步骤，能节约实验者时间，较好地满足实 验操作的简单化和提高实验结果的准确性。
图1:亚硝基硫醇可见光定量检测试剂盒结构图
图中序号标示l为试剂瓶l， 2为试剂瓶2， 3为试剂瓶3， 4为试剂瓶4， 5为试剂瓶 5, 6为固定板，7为盒体，8为盒盖，9为试剂盒说明书。
具体实施例方式
一下结合附图对本发明的构成与使用方法作进一步的详细说明 检测试剂盒的构成
试剂瓶l:黑色塑料瓶，瓶内封闭包装溶于5%磷酸的磺胺溶液。准确称取lg磺胺，充
分溶解于100mL 5%磷酸溶液，此为试剂I。
试剂瓶2:黑色塑料瓶，瓶内封闭包装含3.7mM氯化汞的5。/。磷酸配置的磺胺溶液。准 确称取0.05g氯化荥，溶解于lmLDMSO (二甲基亚砜)，再与lg磺胺同时溶解于100mL 5% 磷酸溶液，此为试剂II。
试剂瓶3:黑色塑料瓶，瓶内封闭包装O. 1。/。的NED溶液。准确称取O. lg NED，溶解于 1 OOmL双蒸馏水中，此为试剂III。
试剂瓶4:白色塑料瓶，瓶内封闭包装5%的磺基水杨酸溶液。准确称取5g磺基水杨酸， 溶解于lOOmL双蒸熘水中，此为试剂IV。
试剂瓶5:白色塑料瓶，瓶内封闭包装NaN02标准溶液，准确称取0. 069g NaN02，溶于
10mL双蒸馏水中，得到O. 1M NaN04示准溶液，此为试剂V。
上述五个试剂瓶和试剂盒说明书一同放入一个由硬纸材料制成的长方形盒子7中，并 用带有圆孔的塑料泡沫板6固定各试剂瓶，然后用盒盖8盖好加封。 检测试剂盒的使用方法，检测步骤
1. 取8只试管或者离心管，编号l， 2， 3， 4， 5, 6， 7禾B8，在2， 3， 4， 5， 6， 7， 8中 分别加入lmL双蒸馏水或者空白试剂，在1中加入2mL双蒸馏水或者空白试剂，将NaN02 标准溶液稀释1000倍，即取2pL NaN02标准溶液溶解于1中。立即对半稀释6次，及 依次从前一管中取出lmL液体，与下一管中lmL双蒸馏水或者空白试剂充分混匀，7中 取出lmL后，丢弃此lmL液体，使各个管中只保留lmL液体，用于做标准曲线。8个管 中NaN02溶液浓度分别为lOO(iM, 50(aM， 25(aM， 12. 5pM， 6. 25|aM， 3. 13pM， 1. 56pM， O(aM。
2. 生物样品离心取上清液，分为两份，其中测定管一份100|LiL与lmL试剂I避光反应5min， 对照管一份lOOpL同时与lraL试剂II避光反应5min，同时，从l， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8中各取IO(VL溶液，与lmL试剂I避光反应5min。
3. 观察与试剂II避光反应的管中是否有沉淀产生，如果有，则在各管中加入50(VL试剂 IV, 6000转离心5min，取上清液用于下一步检测。如果没有沉淀产生，这一步可以省 略。
4. 各管加入lmL试剂III，避光反应5min，于540nm下检测产物，使用8调零。
5. 如果需要检查低分子量的亚硝基硫醇，可先将样品lOO(aL与500nL试剂IV反应，6000 转离心5min去除蛋白，将上清液重复1-4的操作。
6. 将吸光值的差值代入标准曲线，计算SNO浓度。
7. 计算SNO浓度()iM)=(测定管-对照管)X标准曲线系数。
权利要求
1、一种亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒，包括装不同试剂的五个试剂瓶试剂瓶1、试剂瓶2、试剂瓶3、试剂瓶4、试剂瓶5，盒体(7)，盒盖(8)，带孔固定板(6)，以及试剂盒说明书(9)，五个试剂瓶由带孔固定板(6)分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶1中装有溶于5wt％磷酸的磺胺溶液，试剂瓶2中装有含氯化汞的5wt％磷酸溶解的磺胺溶液，试剂瓶3中装有N-1-萘二胺二氢氯化物，试剂瓶4中装有磺基水杨酸，试剂瓶5中装有NaNO2标准溶液。
2、 如权利要求1所述的亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒，其特征是试 剂瓶l为黑色塑料瓶，瓶内封闭包装溶于5wt。/。磷酸的磺胺溶液100raL，磺胺浓度 lg/100mL溶液。
3、 如权利要求1所述的亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒，其特征是试 剂瓶2为黑色塑料瓶，瓶内封闭包装含3. 7mM氯化汞的5wtn/。磷酸配置的磺胺溶液 100mL，磺胺浓度lg/100mL溶液。
4、 如权利要求1所述的亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒，其特征是试 剂瓶3为黑色塑料瓶，瓶内封闭包装100mL含有N-1-萘二胺二氢氯化物0. lg溶 液。
5、 如权利要求1所述的亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒，其特征是试剂瓶4为白色塑料瓶，瓶内封闭包装5% (g/ml)磺基水杨酸溶液100mL。
6、 如权利要求1所述的亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒，其特征是试 剂瓶5为白色塑料瓶，瓶内封闭包装0.1M NaN02标准溶液10 mL。
全文摘要
一种亚硝基硫醇的可见光定量检测试剂盒，包括装不同试剂的五个试剂瓶试剂瓶1、试剂瓶2、试剂瓶3、试剂瓶4、试剂瓶5，盒体(7)，盒盖(8)，带孔固定板(6)，以及试剂盒说明书(9)，五个试剂瓶由带孔固定板(6)分隔固定，每个试剂瓶上有说明标签，试剂瓶内密封包装着固定重量配比和准确称量的试剂，试剂瓶1中装有溶于5wt％磷酸的磺胺溶液，试剂瓶2中装有含氯化汞的5wt％磷酸溶解的磺胺溶液，试剂瓶3中装有N-1-萘二胺二氢氯化物，试剂瓶4中装有磺基水杨酸，试剂瓶5中装有NaNO<sub>2</sub>标准溶液。本试剂盒检测各类细胞样品亚硝基硫醇水平简便、灵敏。
文档编号G01N21/77GK101393133SQ200810197378
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者丁书茂, 毅 曹, 旭 杨, 昆 王, 袁均林 申请人:华中师范大学