专利名称：：一种现场快速检测蛋白氮的检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种食品分析方法，特别是涉及一种检测食品中蛋白氮的方法。
背景技术：
：目前市场上出现将假蛋白(如"三聚氰胺"及其类似物)非法添加到食品及动物饲料中现象，而传统的蛋白质检测方法对此无能为力。美国食品药品监督管理局(FDA)采用了关于蛋白原料中"三聚氰胺"分析的试行GC/MS方法，筛查"三聚氰胺"、"三聚氰胺二酰胺"、"三聚氰胺一酰胺"及"三聚氰酸"。"三聚氰胺"(分子式见图)含氮量达66.67%，白色无味，与蛋白粉外观相似。添加1%的"三聚氰胺"就可以在定氮法检测中使检测结果氮含量增加4.1%以上。在巨大利益的驱动下，不法分子在食品及饲料中掺加大量非蛋白氮(即假蛋白)。NH2目前蛋白质检测常用有二种方法凯氏定氮法、杜马斯法。凯氏定氮法现在常常用来进行食品行业中蛋白质检测，测量样品中的总氮含量，然后依据氮含量来计算蛋白质含量，这是目前的标准方法。凯氏(Kjddahl)定氮法始于1883年，主要用来测定有机氮含量。其原理是样品中加入浓硫酸进行消化，使蛋白质分解生成氨，氮与硫酸化合生成硫酸铵。消化结束后加入强碱消化液。使硫酸氨分解，放出氨。用硼酸液吸收后，再用标准碱溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。该测量时间较长，耗费化学试剂。而且用的化学试剂也是非常危险，需要将硫酸加热到400度。杜马斯方法被认为是有显著进步的一种方法，并取得了一些成功。测定原理是待测样本在纯氧(299.99%)环境中高温燃烧，将其所含的有机氮和无机氮全部转化成氮的氧化物后被还原剂还原成氮气。最后，用TC检测器检测氮气产量。基于此原理，杜马斯燃烧法能够在46分钟内测定出样品的总氮含量，而且还能测定出凯氏法所不能测定的饲料硝态氮。它将样品进行燃烧，测量释放出来的氮，然后算出蛋白质含量。反应产物需要通过燃烧获得，所以会产生很多仪器的维护问题。大样品的测量也是一个问题，因为这样会产生大量燃烧产物，因此样品量受到限制。液体样品也很少能够做好，因为分析液体样品时需要额外的步骤。定氮法的局限在于测量含氮量，再换算成蛋白质总量。硫酸消化或高温转化过程将所有含氮物质均被误统计成蛋白氮，添加假蛋白后，不合格的产品照样可以混淆通过检测。还有一些蛋白检测方法，如双縮脲法、紫外吸收法、Folin—酚试剂法(Lowry法)、BCA法等，但都为特性蛋白样品检测，并非总蛋白质含量检测方法，也无法广泛应用于常规检测。这些方法都不是直接测量真的蛋白质的方法，凯氏定氮法和杜马斯法都是测量总氮含量，根据总氮含量，通过换算，再转化成蛋白质含量。这些己有的检测方法导致了任何一种含氮物质的加入都会引起蛋白产品定氮法测数据虚高，提供了造假的可能。直接测定样品中是否含有假蛋白确实是避免掺加的一种手段，但是假蛋白的多样性也让各种蛋白产品分析工作疲于应付。如"三聚氰胺"及其类似物、尿素、硝酸铵等廉价高氮物质等。以上任何一种含氮物质的加入都会引起蛋白产品定氮法测数据虛高，因此在食品及饲料的蛋白质分析中，仅仅使用GC/MS、HPLC、LC/MS方法检测"三聚氰胺"及其类似物检测结果将会比较繁琐、效率低下且不能解决快速现场测试，因此以往使用的蛋白产品定氮方法从主观上存在着对目标物进行预先无掺假假设的盲区。由美国CEM公司发明的iTAG技术是一种新技术。其原理是利用呈酸性的iTAG试剂与氨基酸残基反应来测量蛋白质，iTAG分子由酸性基团和芳香基团所组成，芳香基团能使之有显色反应效果，再根据显色检测其吸收特征频率，用计算机自动标定换算蛋白质的含量。这种技术的测量过程只需要2分钟，测试牛奶样品仅需要2克、领U试用乳粉样品仅需要0.2-0.3克，但是其测量精度却可以达到0.1mg，测量数据范围能够达到0.0199.99%。例如用iTAG技术检测酪蛋白时，由于该蛋白含有201个氨基酸，其中有27个反应位点，包括15个精氨酸，4个组氨酸，7个赖氨酸和1个肽链末端的氨基，占酪蛋白组成氮基酸的13.4%。这些反应位点能与iTAG分子结合。但是此方法使用特定的大型仪器设备，价格昂贵，检测成本非常高，且不适宜于现场大量检测o
发明内容本发明所解决的技术问题是提供一种适用于现场快速检测蛋白氮的检测方法。本发明的另一个目的是提供一种或几种现场快速检测蛋白氮的比色试纸。一种现场快速检测蛋白氮的检测方法，采用iTAG蛋白标签技术的iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂与待检样品快速反应显色后，通过与标准比色卡或读卡器对比读取样品中蛋白氮的含量。本发明的检测方法，所述标准比色卡是采用不同浓度的蛋白质标准品与iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂显色反应后得到的结果制作而成的色卡。本发明的检测方法，所述标准比色卡设置在比色计内，所述比色计为手持式的。本发明的检测方法，所述蛋白质标准品的蛋白氮含量优选为1040%。。因为奶粉样品中的蛋白氮含量约为33%左右，故在制作标准比色卡时，可以采用蛋白氮含量为1040%的蛋白质标准品来测量制作，制得的标准比色卡可用于检测奶粉样品；而牛奶中的蛋白氮含量约为9496%之间，在检测时将样品适当稀释即可。一种比色试纸，由上述的标准比色卡和包覆有iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin一酚试剂的测试区两部分组成。利用本发明的检测方法，在现场检测时，只需准备一些最简单常用的容器设备，如烧杯、容量瓶等，将待检测的样品少量(液体取样2克，加蒸馏水稀释1倍后取2克；固体O.l0.3克溶解制成溶液取2克左右即可)加入容器中，再向容器中直接加入iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂适量，显色反应后，把反应后的物质放在分光检测仪器中，读取数据，或与标准比色卡比对后即可知道待测样品的大致蛋白氮含量；或直接利用本发明提供的比色试纸，将其伸入至待测样品中即可得到结果。本发明的检测方法，成本极低仅相当于酸碱PH试纸，更远低于大型精密仪器的使用成本，且操作简单方便快捷，虽然精密度有所不足，但对于食品企业现场收购大量原材料如牛奶时，可以非常快速地得出不同批次的牛奶中的蛋白氮含量，根据其样品显色结果即可直观地得出其蛋白质(蛋白氮)含量是否达标，适用于大量样品现场粗检测。如果样品本身质量优良，那就不必进一步进行假蛋白筛査；如果真蛋白检测指标有可疑，产品可能有掺假，还可以使用其他定氮法及一些标准或法定物质分析方法(如GC/MS、HPLC、LC/MS等)继续分析流程，这样就可以有效判定产品加工过程掺假成分。具体实施例方式为进一步说明本发明，结合以下实施例具体阐述实施例1:一种现场快速检测蛋白氮的检测方法，采用蛋白氮含量为1040%的蛋白质标准品与iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂显色反应后得到的结果制作而成的标准比色卡，取待测样品奶粉0.2克，用蒸馏水定容至10毫升，取2克溶液加入至50毫升的烧杯中，再加入iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂2克，混合均匀后显色，利用读卡器与标准比色卡对比读取样品中蛋白氮的含量。实施例2:一种现场快速检测蛋白氮的检测方法，采用蛋白氮含量为1040%的蛋白质标准品与iTAG试剂显色反应后得到的结果制作而成的标准比色卡，将其设置在手持式的比色计内，取待测样品牛奶2克，加蒸馏水2克稀释后取样2克加入至手持式的比色计的加样孔内，再加入iTAG试剂2克，混合均匀后显色，与标准比色卡对比读取样品中蛋白氮的含量。实施例3:一种比色试纸，由采用蛋白氮含量为1040%的蛋白质标准品与iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂显色反应后得到的结果制作而成的标准比色卡和包覆有iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂的测试区两部分组成。以下样品各取适量(固体样品0.2克定容至10毫升后取2克；液体样品取2克)，分别利用此试纸测其蛋白氮含量，再利用凯氏定氮法测其氮含量，结果见表l-表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表2可以看出，相同的样品按质量比添加1%"三聚氰胺"后，利用本发明的方法检测样品，发现其蛋白氮量降低，这是因为掺加了别的物质后，蛋白质的百分含量肯定有所降低;而利用凯氏定氮法测出的因为是总氮量，含氮量反而升高，此结果更好地说明了本发明检测的是蛋白质中氮含量，而不是总氮量。其检测结果是一个很好的指标，若样品检测结果低于常规蛋白含量，则基本可以初步判定其掺加了别的含氮物质。注本发明中所用的iTAG试剂均购自美国CEM公司。本发明中所用的考马斯亮蓝法染色试剂为常规考马斯亮蓝法中使用的染色试剂。本发明中所用的染色试剂为常规Folin—酚法中使用的酚染色试剂。本发明所使用的染色试剂不仅仅限于以上几种，凡是可以使蛋白质内氨基酸显色的有效试剂均可以在本发明中采用，凡此可以通过本领域普通工程技术人员的有限次试验即可得到。本发明中涉及的％如无特殊说明外，均指的是重量百分比。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。权利要求1.一种现场快速检测蛋白氮的检测方法，其特征在于采用iTAG蛋白标签技术的iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂与待检样品快速反应显色后，通过与标准比色卡或读卡器对比读取样品中蛋白氮的含量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述标准比色卡是采用不同浓度的蛋白质标准品与iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂显色反应后得到的结果制作而成的色卡。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述标准比色卡设置在比色计内，所述比色计为手持式的。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述蛋白质标准品的蛋白氮含量为1040%。5.—种比色试纸，其特征在于由权利要求l一4任一项所述的标准比色卡和包覆有权利要求1所述的iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin—酚试剂的测试区两部分组成。全文摘要一种现场快速检测蛋白氮的检测方法，采用iTAG蛋白标签技术的iTAG试剂或考马斯亮蓝法染色试剂或Folin-酚试剂与待检样品快速反应显色后，通过与标准比色卡对比读取样品中蛋白氮的含量。本发明的检测方法，成本远远低于大型精密仪器，且操作简单方便快捷，虽然精密度有所不足，但对于食品企业现场收购大量原材料如牛奶时，可以非常快速地得出不同批次的牛奶中的蛋白氮含量，根据其样品显色结果即可直观地得出其真蛋白质(蛋白氮)含量是否达标，适用于大量样品现场粗检测。文档编号G01N33/68GK101368971SQ200810222988公开日2009年2月18日申请日期2008年9月25日优先权日2008年9月25日发明者杰崔,崔蕴文申请人:杰崔