专利名称：：胰岛素样生长因子Ⅱ受体在检测心力衰竭中的应用及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明公开了一种胰岛素样生长因子II受体(IGF-IIR)的新用途，具体地说是一种胰岛素样生长因子II受体在制备检测心力衰竭试剂盒中的应用。
背景技术：
：胰岛素样生长因子-II受体(IGF-IIR)能降解胰岛素样生长因子_11、抑制肿瘤生长，IGF-IIR表达减少或缺失在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、肾癌、肾上腺肿瘤等生长中起重要作用。(TheRoleofInsulin-LikeGrowthFactor2andItsReceptorsinHumanTumors.KresimirPavelic，MolecularMedicine.2002;8:771-780.)胰岛素样生长因子-II受体(IGF-IIR)结构中含有重要基团6磷酸甘露糖(M-6-P),此受体也称为6磷酸甘露糖M-6-P。IGF-IIR/M-6-P的分子结构250kDa蛋白，有一个很大的胞外功能域，可以结合M-6-:P，溶酶体酶及IGF-11。IGF-1IR/M-6-:P:胞外部分由15个同源的重复单位组成，平均长147个氨基酸；重复单位13、79每个包括1个M-6-P结合点，与含M-6-P配体的酶结合，如溶酶体酶、TGF-131等；重复单位11是IGF-II结合点。在细胞表面，IGF-IIR/M-6-P结构性的细胞内化，主要功能是结合内化非糖基化的多肽激素IGF-II，次要作用是重摄入分泌的酸性水解酶；作用是清除循环中的IGF-II、抑制肿瘤生长、调节溶酶体酶的运输、基质降解和信号传导。IGF-IIR/M6-P的溶解形式可以由培养中的细胞释放，并在血浆中循环，仍具有结合IGF-II的能力，能阻止IGF-II刺激的DM合成。Scott等也证明溶解的IGF-IIR/M-6-P，在生理浓度，能阻止IGF-II的促细胞增长，并阻止肿瘤生长。心力衰竭引起的心脏疾病在全世界都有很高的发病率和死亡率。心力衰竭是一个多因素引起的疾病，内在的分子机制还不是很清楚,但很可能与潜在的基因和蛋白质表达改变有关。蛋白质是决定心血管功能和疾病表型的最重要物质，蛋白质技术是用来检测心衰中蛋白表达变化最有效的工具，为我们研究心衰中的分子机制、寻找新的诊断心衰的生物标记提供更女子的方法。(BiomarkersofCardiovascularDisease,RamachandranS.Vasan,MD，Circulation.2006;113:2335—2362.)大批量的蛋白处理技术正作为一种新的蛋白发现和鉴定的新途径，例如，细胞因子蛋白芯片技术，可以同时检测多个细胞因子,对发现新的生物标记起重要作用。使用生物标记来检测患病风险、评估预后、指导治疗是医学研究的一个重要进展。(ProteomicsoftheHeart,UnravelingDisease.EmmaMcGregor,etc,CircRes.2006;98:309-321.)蛋白芯片技术自1991年Fodor等提出DM芯片至今，以I)NA芯片为代表的生物芯片技术快速发展，并逐步应用于基础医学及临床医学研究，为未来生命科学的发展奠定了坚实基础。但基因转录水平的研究只在一定程度上反映基因表达产物的变化，并不能提供3认识各种生命活动直接的分子基础——蛋白质。20世纪90年代末期，第l代蛋白芯片技术的出现给蛋白组学的研究带来了新思路。这项技术能够同时提供大量的、涉及许多相关生物学过禾呈的、有统计学意义的信息。(Proteinmicroarraysandproteomics.MacBcathG.NatGenet,2002，32:526-532.)蛋白芯片技术的基本原理蛋白芯片系统由蛋白质芯片、芯片处理器、芯片阅读器和芯片分析软件4部分组成。其基本原理是将能捕获的各种蛋白质的分子(抗体、多肽、核酸等)通过化学或非化学的方法，有序地固定于各种载体上,成为检测用的芯片。用标记了特定荧光剂的蛋白质或检测抗体与芯片作用，借助抗体与抗原，受体与配体的相互作用，利用专用的生物芯片荧光扫描仪或激光共聚扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过不同荧光强度获得靶蛋白表达图，从而确定生物样品中特异性蛋白分子的含量、组成及分布，达至U测定各禾中蛋白质功會fe的目的。仏axgescalefimctionalanalysisusingpeptideorproteinarrays.EmiliAQ.etc.NatureBiotechnology,2000，18:393-397.)[■]蛋白芯片技术的主要特点一次样品用量少，几十微升；高通量，可同时分析集成的成千--匕万密集排列的分子微阵列；平行分析，从一个样品可得到许多相关蛋白或基因的信息；快速反应，能够在短时间内分析完成大量的生物分子测试；特异性高，基于抗体与抗原，受体与补体等相互作用，样品检测及分析过程连续化、集成化、微型化、自动化。(Myocardialmolecularbiology:anintroduction.BrandNJ，etc.Hearl，2002。87:284-293.)目前，我们还没有单一的一个标记或多个标记的组合来解决心衰相关的诸多问题。即使文献中常报道的心衰BNP标记也未能满足一个理想标记的要求，另一方面，一些现有的生物标记在心衰中的作用被忽视了。(GeneticMarkers,ProgressandPotentialforCardiovascularDisease.GaryH.Gibbons,MD，etc,Circulation.2004;109[supplIV]:IV-47-IV-58.)
发明内容本发明的目的在于提出一种胰岛素样生长因子II受体(IGF-IIR)的新用途，并且提出一种含有该受体的可以高效准确的检测心力衰竭疾病的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案本发明发明人经过长期的实验得出使用细胞因子抗体芯片找到潜在的心衰生物标记，并通过实验证实胰岛素样生长因子-II受体(IGF-IIR)在制备检测心力衰竭疾病试剂盒中的新用途。本发明的发明思路为本发明发明人使用细胞因子抗体芯片的新方法找到新型心衰生物标记。胰岛素样生长因子-i:]:受体(igf-]::i:r)结构中含有重要基团6磷酸甘露糖(M-6-P)，此受体也称为6磷酸甘露糖M-6-P。IGF-IIR/M-6-P的分子结构250kDa蛋白，有一个很大的胞外功能域，可以结合M-6-P，溶酶体酶及IGF-II。IGF-IIR/M-6-P:胞外部分由15个同源的重复单位组成，平均长147个氨基酸；重复单位13、79每个包括1个M-6-P结合点，与含M-6-P配体的酶结合，如溶酶体酶、TGF-131等；重复单位11是]:GF-]:]:结合点。在细胞表面，IGF-IIR/M-6-P结构性的细胞内化，主要功能是结合内化非糖基化的多肽激素IGF-II，次要作用是重摄入分泌的酸性水解酶；作用是清除循环中的IGF-II、抑制肿瘤生长、调节溶酶体酶的运输、基质降解和信号传导。发明人在实验中发现IGF-IIR缺4陷的小鼠:循环中的IGF-II水平升高,器官增大，这些小鼠出生时或出生后不久即死于心衰，其次死于心脏增生，IGF-II基因敲除的小鼠能幸免于IGF-IIR基因突变引起的围生期致死。本发明提出了胰岛素样生长因子II受体在制备检测心力衰竭试剂盒中的应用。其中IGF-IIR基因为本领域技术人员公知的基因(人类基因组genbank编号NT—007422.13)。根据上述
发明内容，本发明提出一种用于检测心力衰竭的试剂盒,其包含有所述的胰岛素样生长因子II:受体特异性结合的抗体，抗体的制备为本领域技术人员公知的。上述用于检测心力衰竭的试剂盒，还包含有抗原包被的微孔板，酶标抗人IgG及其它试剂制成，应用双抗体夹心法ELISA原理检测胰岛素样生长因子II受体。本发明所述的IGF-1IR试剂盒为市售产品，也可以根据现有制备抗体的技术制备IGF-1IR试剂盒。试剂盒包括酶联板(96孔板)包被有]:gf-]::i:r受体抗体；标准品(冻干品)i:gf-i:ir受体；检测溶液A(生物素化的抗IGF-IIR抗体)；检测溶液B(HRP标记的亲和素)；底物溶液(TMB显色溶液)、终止液(2NH2S04)等。—种用于检测IGF-IIR受体的试剂盒，该试剂盒用于检测心力衰竭疾病。上述的一种用于检测:[GF[iR受体的试剂盒用于检测心力衰竭进程中i:GF[iR受体表达情况的用途。本发明的优点和有益效果本发明提出了一种IGF-IIR的新用途。本发明经实验验证IGF-IIR可以用于检测心力衰竭，并且纵向和横向比较i:GF[iR在心衰中的生物标记物的地位，本发明所述的IGF-IIR受体可用来制备检测心衰的试剂盒，应用该试剂盒利用血清学检测可以快速准确检测终末期心脏病具有极大的应用前景和市场前景。在ARVC所致心衰组表达差异最显著的是上调17.52倍的IGF-IIR。本发明IGF-IIR制备的检测心力衰竭的试剂盒优势有敏感度和特异性高，血清稀释比例高，与现有检测心衰的方法相比较，成本低、效率高、使用方便等。现有技术也有用血清学检测的,但是敏感性等不甚理想。本发明也可以说是克服了本领域技术人员的技术偏见而得出的，本领域技术人员长期以来一致认为，IGF-IIR受体为特有的肿瘤标记物，仅用其制备检测肿瘤的试剂盒，并无法得知IGF-IIR受体结构上与心衰等心脏病有直接联系，并且可以制备成快速准确检测心衰的试剂盒来应用。且较比现有检测心衰的方法，成本大幅度下降，普通患者均可以接受。上述本
发明内容已经对本发明做了详细的描述，为了使本领域技术人员更清楚本发明的
发明内容和技术效果，下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明。图1IGF-IIR蛋白表达水平的Westernblot技术分析；图2苏木素伊红(HE)染色ARVC心肌组织光镜所见(上面两图，即图2A和图2B)和使用单克隆抗体免疫组化:i:GFi:[:R(下面两图，即图2c和图2:[));图3在ARVC所致心衰组和正常对照组中NT-proBNP和IGF-IIR表达比较；图4用IGF-IIR试剂盒检测心衰组和正常组的心肌组织IGF-IIR的表达；图5用试剂盒检测心衰组和正常组的血清IGF—IIR的表达。具体实施例方式本发明所用实验样本和设备来源1、心脏标本来源8例患致右室心律失常型心脏病(ARVC)心衰终末期接受心脏移植的心脏标本和8例非心衰的对照心脏标本。所有终末期心衰的患者大都达到心衰纽约分级(NYHA)的III-IV，平均射血分数(EF)27.1±13.5%，无合并其他重要脏器疾病。心衰和非心衰患者的临床和血流动力学资料见表1。非心衰对照组是8例由于免疫不匹配而未行移植的捐赠心脏，均为健康个体。所有病人和对照组对这个研究均签有书面的知情同意书，并且经中国医学科学院阜外心血管病医院伦理学术委员会的同意。表1心衰和非心衰患者的临床和血流动力学资料；<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>ARVC:致右室心律失常性心肌病，NF:正常心脏，NYHAclass:纽约心力衰竭分级，CI:心脏指数，PAP:肺动脉压力，PVR:肺血管阻力，CVP:中心静脉压，PAWP:肺毛细血管契压，LVEF:左室射血分数。2、主要仪器来源LuxScan10K双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)、GenePix:Pro4.0图像分析软件(AxonInstruments公司)、PC:R扩增仪(ABI:75(X)型)等。3、本具体实施方式所用试剂盒为USCNLIFESCIENCE&TECHNOLOGYCOMPANY市售试剂盒，产品编号E1629h。实施例lIGF-IIR与心力衰竭关系实验致右室心律失常型心脏病(ARVC)目前病因尚不明确，主要特点是由于右心室心肌被纤维脂肪组织取代引起反复的室性心律失常。我们的8例ARVC的心衰患者主要表现为左心室功能不全，并且病理正式左室游离壁被纤维脂肪组织取代。每个标本取自心脏移植后心衰心脏的左室游离壁和非心衰捐献心脏。部分标本立即冷冻保存于液氮中，供人细胞因子抗体芯片、实时:PCR和WesternBlot分析，其余标本固定于1()%福尔马林供病理检査和免疫组织化学分析。具体步骤1)、细胞因子抗体芯片使用细胞因子抗体芯片检测ARVC心衰患者和健康对照组的心肌组织的多种细胞因子蛋白。使用RayBio公司的生物素标记的人抗体芯片(有507个人细胞因子抗体印于芯片上)。芯片先用缓冲液阻断，然后分别将等量的生物素标记的心衰组和对照组的心肌样本加入到玻璃芯片中，4摄氏度孵化过夜，根据说明书分析多个细胞因子，然后用AxonGenePix激光扫描仪获取图片，使用GenePixpro6.0软件分析，把图像信号转化为数字信号。生物素标记的抗体和内部对照将产生阳性的对照信号，这些信号用来确认趋势和帮助标准化不同芯片的结果。所有数据使用RayBio分析工具处理。2)、WesternBlot.:左心蛋白样本使用15%SDS-PAGE电泳单位分析，然后在15V电压下转到硝基纤维素膜20min，硝基纤维素膜用含有7.5%非脂肪干奶粉和0.1%吐温2()(非离子型表面活性剂):PBS阻断1小时，然后硝基纤维素膜在PBS与IGF-I]:R单克隆抗体(羊抗人单克隆抗体，产品目录NO.AF2447,购于R&DSyst.em，Inc，USA)孵化过夜，最后与特异性的含服P的第二抗体(JacksonI咖翻ResearchLabaratories，Inc，PA，USA)孵化。根据公司说明过氧化物酶活性通过增强的化学发光法(ECLkit,AmershamBioscience,USA)显影。3)、免疫组织化学左心室组织用10%福尔马林固定。使用酒精和二甲苯脱水，石蜡包埋，5um的切片用苏木素和伊红染色，来评估心衰和非心衰组织的形态学特点。切片用4%多聚甲醛固定，0.2X三重氢核X-100透化处理5min，用5%BSA阻断。切片用羊抗人IGF-II:R单克隆抗体(产品目录N().AF2447,R&DSystem,]:nc，USA)室温孵化l小时，用PBS缓冲液洗10min。然后切片用IgG过氧化物酶结合的第二抗体(Sigma,St..Louis，M0，USA)室温孵化1小时，用PBS缓冲液洗lOmin，O.5mg/mlMB和0.05%H202孵化，阴性对照组只和第二抗体孵化。所有切片用苏木素染色、脱水、封片，然后光镜下阅片。4)、EL]:SA:IGF-I]:R受体用酶联免疫吸附试验评估。根据商用IGF-]:]:R的EL]:SA试剂盒(产品目录NO.E1629h，USCNLifeScience&TechnologyCompany,Texas，USA)说明书进行。纯化的抗IGF-IIR抗体稀释到l-4mg/ml，把100ml的稀释抗体加到ELISA盘的孔径中，密封盘防止增发。在4摄氏度孵化过夜。恢复到室温,移除稀释抗体溶液,每孔径加2()(Ml阻断缓冲液阻断非特异性结合。密封盘后室温孵化12小时。用PBS洗三次以上，加入标准物和在阻断液中稀释过的样本，每孔径100ml。密封盘室温孵化2-4小时或4摄氏度孵化过夜。用PBS洗4次以....匕。在阻断液中稀释生物素标记的抗IGF-IIR检测抗体至0.5-2mg/ml，每孔径加100ml。密封盘室温孵化1小时，用PBS洗4次以上。在阻断液中稀释抗生蛋白链菌素服P结合物至最佳滴定浓度，每孔径加l()(Ml，密封盘室温孵化().5小时，用PBS洗5次以上。使用TMB或ABTS作为酶解物，在使用20min之内融化ABTS酶解物溶液。每llml酶解物中加100ml3%&02，每孔径中加入lOOml，室温孵化O.5小时显色。在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔光密度(0D)值。[酬5)、实验结果本发明第一次涉及IGF-IIR在终末期心脏病中的表达情况，并且从向和横向比较IGF-IIR在心衰中的生物标记物的地位，我们发明的这种用血清快速准确检测IGF-IIR来评估终末期心脏病的方法具有极大的临床意义和推广意义。7相比于非心衰组,在ARVC所致心衰组有36个细胞因子蛋白普遍和持续的表达改变至少5倍以上，其中有18个蛋白表达上调、18个蛋白表达下调。表达差异最显著的是....匕调17.52倍的IGF-IIR,在统计学上有显著差异(P<0.01，见表2,表2为ARVC所致心衰组与正常组的蛋白表达差异A:RVCFailinghearts:致右室心律失常性心肌病所致心力衰竭，Non-failinghearts:非心力衰竭心脏，FoldChange:增加倍数。蛋白按照表达差异的显著性排序。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)通过WesternBlot.证实IGF-IIR在ARVC所致的心衰组织者中较非心衰患者有显著提高，如图1所示，IGF-IIR蛋白表达水平的Westernblot技术分析。IGF-IIR蛋白表达水平在A:RVC所致心衰组(n=5)显著高于正常对照组(n=5)(**P<0.01)。内参标化物磷酸甘油醛脱氢(GAPDH)用于标化等量蛋白负荷。IGF-IIR:胰岛素样生长因子II受体;GAPDH:磷酸甘油醛脱氢;ARVC-HF:致右室心律失常性心肌病所致心衰组；NF:正常非心衰对照组。免疫组织化学和光镜检査可见ARVC心肌组织不同程度的被纤维脂肪组织取代，这是诊断ARVC的特异性表现之一。在免疫组织化学中可见ARVC心衰组有大量的IGF-IIR免疫反应，表现为残余心肌组织中细小颗粒样物,如图2所示，图2苏木素伊红(HE)染色光镜所见(上面两图，即图2A和图2B)和使用单克隆抗体免疫组化IGFI:IR(下面两图，即图2C和图2D)。可见ARVC心肌组织不同程度的被纤维脂肪组织取代,这是诊断ARVC的特异性表现之一。在免疫组织化学中可见ARVC心衰组有大量的IGF-IIR免疫反应，表现为残余心肌组织中细小颗粒样物。ARVC-HF:致右室心律失常性心肌病所致心衰组；NF:正常非心衰对照组。(3)在ARVC心衰组和非心衰对照组中IGF-IIR和NT-proBNP在心肌和血清中的表达差异:ELISA法进一步证实IGF-IIR在ARVC所致的心衰组织中表达较非心衰患者有显著提高。同时，也证实IGF-IIR表达在ARVC所致的心衰患者组血清中较非心衰患者组有显著提高。IGF-IIR和NT-proBNP在ARVC所致的心衰组织中表达较非心衰患者均有显著提高，其中NT-proBNP变化更显著。IGF-IIR和NT-proBNP在ARVC所致的心衰血清中表达较非心衰患者均有显著提高，其中IGF-IIR变化更显著，提示血清IGF-IIR比血清NT-proBNP在检测ARVC心衰中更敏感，如图3所示，图3A为心肌组织含量NT-proBNP和IGF-IIR表达比较；图3B为血清学水平NT-pro:BNP和IGF-IIR表达比较；图3C为心肌组织和血清NT-proBNP和IGF-IIR增长倍数。图3在ARVC所致心衰组和正常对照组中NT-proBNP和IGF-IIR表达比较。IGF-IIR和NT-proBNP在ARVC所致的心衰组织中表达较非心衰患者均有显著提高，其中NT-proBNP变化更显著。IGF-IIR和NT-proBNP在ARVC所致的心衰血清中表达较非心衰患者均有显著提高，其中igf-i:[:r变化更显著。igf-i:ir:胰岛素样生长因子n受体，NT-proBNP:N末端脑钠肽前体。实施例2用IGF-IIR试剂盒检测心衰组和正常组的心肌组织IGF-IIR的表达，结果在ARVC、扩张型心肌病、缺血性心肌病所致心衰组中心肌组织IGF4IR的表达均比对照组高。根据前面实验例l，规定心肌组织中IGF-IIR>lOOOpg/ml.为阳性，IGF-IIR<1000pg/ml为阴性。IGFIIR:胰岛素样生长因子II受体,ARVC:致右室心律失常性心肌病，DCM:扩张性心肌病，ICM:缺血性心肌病。结果见表3、表4、表5和表6。另如图4所示，图4用IGF-IIR试剂盒检测心衰组和正常组的心肌组织IGF-IIR的表达，结果在ARVC、扩张型心肌病、缺血性心肌病所致心衰组中心肌组织igf-:i::[:r的表达均比对照组高。i:gfi]:r:胰岛素样生长因子II受体，ARVC:致右室心律失常性心肌病,DCM:扩张性心肌病，ICM:缺血性心肌病。表3IGFIIR检测用于ARVC所致心衰组应用实例10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>敏感性=10/(10+0)=100%特异性=11/(4+11)=73.3%准确性=(10+ll)/25=84%。表6IGFIIR试剂盒用于各种心肌病所致心衰组心肌组织检测应用实例IGFIIR表达各种心肌病所致心衰组正常对照组合计39例15例阳性32436阴性71118合计391554敏感性=32/(32+7)=82.1%特异性=11/(4+11)=73.3%准确性=(32+11)/54=79.6%。从上述实验可以看出，IGF-11R检测ARVC、DCM、I:CM所致心力衰竭具有高敏感性、特异性和准确性。对于各种心肌病所致心衰组的检测敏感性高于82%、特异性和准确性均达到73%以....匕。现有临床上广泛用于诊断心衰的BNP试剂盒的敏感性、特异性分别是77%和87%，可见IGF-IIR在检测心力衰竭方面敏感性好，特异性相接近。实施例3:用试剂盒检测心衰组和正常组的血清I:GF-I:IR的表达，结果在各种心肌病所致心衰组中血清IGF-IIR的表达均比对照组高。根据前面实验例1，我们初步规定血清中IGFIIR>300pg/ml为阳性，IGFIIR<300pg/ml为阴性，结果见表7。另如图5所示，图5用试剂盒检测心衰组和正常组的血清IGF-IIR的表达，结果在ARVC、扩张型心肌病、缺血性心肌病所致心衰组中血清i:GF-[iR的表达均比对照组高。iGF:[iR:胰岛素样生长因子II受体，ARVC:致右室心律失常性心肌病，DCM:扩张性心肌病，ICM:缺血性心肌病。表7IGF-IIR试剂盒用于各种心肌病所致心衰组血清检测应用实例12IGFIIR表达各种心肌病所致心衰组正常对照组合计19例4例阳性17017阴性246合计19423敏感性=17/(17+2)=89.5%特异性=4/(4+0)=100%准确性=(17+4)/23=91.3%。由表7可知，IGFIIR试剂盒用于各种心肌病所致心衰组血清检测敏感性高达89.5%以上，特异性可以达到100%，准确性高达91.3%。综上所述，由以上实施例可清楚的得知，本发明所述IGFIIR受体在制备诊断心力衰竭疾病试剂盒的应用具有很好的效果,组织和血清学检测均具有非常高的敏感性、特异性和准确性。具有很好的应用价值和市场前景。1权利要求胰岛素样生长因子II受体在制备检测心力衰竭疾病试剂盒中的应用。2.-种用于检测心力衰竭疾病的试剂盒，其特征在于，其包含有与权利要求i所述胰岛素样生长因子ii受体特异性结合的抗体。3.根据权利要求2所述的一种用于检测心力衰竭的试剂盒,其特征在于，该试剂盒还包括标准品IGF-I]:R受体；检测溶液A:生物素化的抗IGF-I]:R抗体；检测溶液B:HRP标记的亲和素；底物溶液TMB显色溶液；终止液2NH2S04。4.一种用于检测胰岛素样生长因子II受体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测心力衰竭疾病。5.权利要求4所述的一种用于检测胰岛素样生长因子II受体的试剂盒，其特征在于，用于检测心力衰竭进程中胰岛素样生长因子II受体表达情况的用途。全文摘要本发明公开了胰岛素样生长因子II受体的新用途，具体地说是在制备检测心力衰竭试剂盒中的应用，及提出一种含有该受体抗体的试剂盒。本发明提出了一种IGF-IIR的新用途。本发明所述的IGF-IIR受体可用来制备检测心衰的试剂盒，应用该试剂盒利用血清学检测可以快速准确检测终末期心脏病具有极大的应用前景和市场前景。文档编号G01N33/53GK101738468SQ20081022678公开日2010年6月16日申请日期2008年11月24日优先权日2008年11月24日发明者劳立峰,张浩,胡盛寿,郑哲,魏英杰申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院