移植物抗宿主疾病的检查及治疗方法

专利名称：移植物抗宿主疾病的检查及治疗方法
技术领域：
本申请要求基于日本专利申请2007-165547(2007年6月22日申请)的优先权， 将其内容作为参照引入本说明书。 本发明涉及用于检查移植物抗宿主疾病的方法及试剂、以及治疗方法及治疗用药 物组合物。
背景技术：
造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation :HSCT)是将他人 的造血干细胞移植给患者使其造血功能及免疫功能再构筑的治疗方法，作为广泛种类的血 液、肿瘤、代谢及免疫疾病的治疗方法已经确立。最近20年内移植后免疫抑制疗法显著进 步，但是移植物抗宿主疾病(Graft Versus Host Disease ;GVHD)依然是性命攸关的严重的 移植后并发症。HSCT的受血者(患者)的30-80%，尽管采用利用免疫抑制剂的预防方法， 却仍然患上GVHD。因此，人们期望早期诊断GVHD并早期开始治疗，客观地监控治疗效果。另 外，采用目前的治疗方法有时不能痊愈，因此人们期望开发新的治疗方法。关于GVHD的发 病率、诊断和治疗可以参照Sullivan等(Sullivan KM. Graft vs. host disease. In :Blume KG， FormanSJ， Appelbaum FR， eds. Thomas' Hematopoietic Cell Transplantation. 3rd ed. Malden， MA :Blackwell Publishing ;2004 :635—664)。 但是，目前GVHD的诊断主要是基于皮疹、高胆红素血症、腹泻等的临床症状进行 的，不存在能够将GVHD与其他类似的并发症(静脉阻塞疾病、病毒复活、与毒性相关的治疗 方案等)相区别的决定性生物标志物(biomarker)。因此，GVHD的鉴别诊断需要脏器活检 等侵入性方法。但是活检是具有侵入性且主观性的诊断方法。因此需要开发一种新方法， 不依赖于活检并且能够在初期进行准确、客观且定量的诊断，从而对GVHD进行适当的治疗 及改善HSCT的危象。 最近蛋白质组学的进步提供了几种方法用于研究生物学液体中蛋白质的广泛表 达，鉴定疾病或病理状态中的新型生物标志物。上述方法之一为表面加强激光解析/电离 飞行时间质谱(SELDI-TOFMS)，这是一种高通量且高灵敏度的蛋白质组学方法，用于从血 浆等复杂组成的体液中分离蛋白质，生成比较蛋白质谱。Petricoin等(Petricoin EF， Ardekani AM，Hitt BA，et al. Use of proteomic patternsin serum to identify ovarian cancer. Lancet. 2002 ;359 :572-577)报道了一种利用使用SELDI的蛋白质组学解析的卵巢 癌生物标志物。在SELDI中将从生物学样品中得到的蛋白质选择性地结合于蛋白质芯片 (Ciphergen Biosystems， Fremont CA)上的经化学修饰的亲和表面，冲洗非特异结合的杂 质。然后，利用TOF-MS分析捕捉的蛋白质，得到各蛋白质的分子量(m/z)及相对浓度(强 度)的光谱。最近的研究成功地将该技术适用于癌症及其他疾病的诊断。
对于GVHD中人体液的蛋白质组学分析，也有相关报道。但是，在使用人的临床试 样的实验中，不能避免受遗传背景及环境影响的假象，这使新型生物标志物难以表达。特 别是对于HSCT后的患者由于存在多种已有疾病、调整的养生方案以及GVHD预防方法等，所以目前为止还没有基于包括蛋白质组学分析的生化方法发现有用标记的报道。例如， Kaiser等(Kaiser T， Kamal H， Rank A， et al. Proteomics applied to the clinical follow—up of patients after allogeneichematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2004 ;104 :340-349)报道了以尿作为材料利用蛋白质组学解析的GVHD标记的研究。 鉴定了两种蛋白质(白三烯；炎症介质，血清白蛋白；血清中最多的蛋白质)，但没有发现 GVHD特异蛋白质。 在本说明书中引用的参考文献如下所述。所述文献中记载的内容均作为参照援引 在本说明书中。申请人认为这些文献中的任意一篇都不构成影响本发明专利性的现有技 术。 非专利文献1 :Sullivan KM. Graft vs. host disease. In :B1聽KG， Forman SJ， Appelbaum FR， eds. Thomas'Hematopoietic CellTransplantation. 3rd ed. Malden， MA : Blackwell Publishing;2004 :635-664 非专禾U文献2 :Petricoin EF， Ardekani AM， Hitt BA， et al. Use ofproteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet. 2002 ;359 :572_577
非专禾U文献3 :Kaiser T， Kamal H， Rank A， et al. Proteomicsapplied to the clinicalfollow_up of patients after allogeneichematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2004 ;104 :340-349

发明内容
本发明的目的在于提供检查移植物抗宿主疾病的方法、所述方法中使用的诊断试 剂、和治疗方法及治疗用药物组合物。 本发明人等广泛研究了在移植物抗宿主疾病发病的模型动物和对照动物之间不
同地表达的蛋白质，结果发现在移植物抗宿主疾病中CCL8的表达量明显上升，进而发现移
植物抗宿主疾病的临床症状发病及过程与CCL8表达量相关，从而完成了本发明。 S卩，本发明提供一种用于检查移植物抗宿主疾病的方法，其特征在于，测定取自受
试者或受试动物的试样中CCL8蛋白质的量，并将得到的测定值作为移植物抗宿主疾病的
诊断或过程的指标。优选移植物抗宿主疾病的诊断在移植物抗宿主疾病的临床症状发病前进行。 在本发明的方法中，优选使用抗CCL8抗体测定CCL8蛋白质的量。另外优选使用 选自质谱法(MS)、高效液相色谱法(HPLC)及双向电泳中的方法测定CCL8蛋白质的量。
另外，本发明提供一种含有抗CCL8抗体的移植物抗宿主疾病的诊断试剂。
进而，本发明提供一种选择移植物抗宿主疾病治疗药的候选物质(candidate substance)的方法。所述方法包括下述各步骤向移植物抗宿主疾病的模型动物给与试验 物质，测定取自上述模型动物的试样中CCL8蛋白质的量，然后比较给与试验物质时与未给 与试验物质时的CCL8蛋白质的量，在给与试验物质时的CCL8蛋白质的量低于未给与试验 物质时的CCL8蛋白质的量的情况下，选择所述试验物质作为移植物抗宿主疾病治疗药的 候选物质。 本发明还提供含有抗CCL8抗体作为有效成分的用于治疗移植物抗宿主疾病的药 物组合物。并且，本发明提供一种治疗移植物抗宿主疾病的治疗方法，所述方法包括向患有移植物抗宿主疾病的受试者给与抗CCL8抗体。 根据本发明可以以高可靠性诊断移植物抗宿主疾病的发病及过程，通过本发明的 方法可以使现有主观的诊断变成客观且定量的更准确的诊断。进而，根据本发明可以治疗 移植物抗宿主疾病，特别是治疗对现有治疗方法具有抗性的患者的移植物抗宿主疾病。


[图1]图1表示小鼠GVHD模型的临床症状和病理学评分的经时变化。[图2]图2表示由GVHD小鼠模型得到的样品的代表性的SELDI光谱，及各时间点
的样品中8972Da峰的平均归一化强度(average normalized intensity)。[图3]图3表示由给与CsA的小鼠模型得到的样品的代表性的SELDI光谱，及各
时间点的样品中S972Da峰的平均归一化强度。[图4]图4表示由同种移植小鼠模型得到的样品的代表性的SELDI光谱，及各时 间点的样品中S972Da峰的平均归一化强度。[图5]图5表示含有8972Da蛋白质的HPLC馏分的SELDI光谱及2D电泳的结果。
[图6]图6表示从S972Da蛋白质中分离的肽的代表性的MS/MS光谱及鉴定的氨 基酸序列。[图7]图7表示利用免疫测定的CCL8蛋白质的检测。[图8]图8表示人临床样品中CCL8蛋白质水平的经时变化。[图9]图9表示人临床样品中CCL8蛋白质水平的经时变化。[图10]图10表示人临床样品中CCL8蛋白质的检测。[图11]图11表示多个人临床样品中CCL8蛋白质的检测。[图12]图12表示人临床样品中CCL8蛋白质水平的经时变化。[图13]图13表示人临床样品中CCL8蛋白质水平的经时变化。[图14]图14表示给与TLR配体的小鼠和GVHD小鼠中CCL8的蛋白质水平。[图15]图15表示小鼠GVHD模型的临床症状和CCL8蛋白质水平的经时变化。[图16]图16表示给与了抗CCL8抗体的小鼠GVHD模型的组织染色。[图17]图17表示小鼠GVHD模型中抗CCL8抗体的治疗效果的病理学评价。
具体实施例方式
本发明的特征在于通过测定受试者血液等受试试样中CCL8的表达量，诊断移植 物抗宿主疾病并监控过程的方法。具体内容如下述实施例所示，可确认在接受了骨髓移植 或脐带血移植的患者中，移植物抗宿主疾病发病患者的CCL8的表达量明显较高、以及移植 物抗宿主疾病的临床症状的发病与CCL8的表达之间存在相关性。 所谓CCL8为属于趋化因子家族的碱性肝素结合性分泌蛋白，也称为 MCP-2 (GenBank Accession No. NP 005614)。已知此蛋白质在单核细胞、成纤维细胞、上皮 细胞等中产生，与作为受体的CCR2， CCR3， CCR5及CCR11结合。已知CCL8以CD4阳性T细 胞、CD8阳性T细胞、单核细胞、NK细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞等作为靶细胞。 一般认 为移植物抗宿主疾病在造血干细胞移植后经三个阶段发病。第一阶段为预处理，包括对准 备进行造血干细胞移植的宿主(患者)进行放射线照射；第二阶段为移植T细胞的活化、
5增殖、分化；第三阶段为细胞性或炎症性效应物的出现(关于该机理，参照以下两篇综述； Reddy P. Pathophysiology of acute graft—versus—host disease. Hematol Oncol. 2003 ; 21 :149—161. ， Ferrara几，Reddy P. Pathophysiology of graft_versus_host disease. SeminHematol. 2006 ;43 :3-10)。在第二阶段中，为了移植T细胞的活化，必须进行树状细 胞的抗原呈递。在该树状细胞的分化、增殖、活化中包括CCL8的趋化因子发挥重要作用 (关于第二阶段中趋化因子的重要性参照以下文献Wysocki CA， Panoskaltsis-Mortari A， BlazarBR， Serody JS.Leukocyte migration and graft—versus—host disease. Blood. 2005 ;105 :4191-4199)。但是，机体内CCL8的作用及其在免疫系统调节中的意义尚 不完全清楚。因此，本发明所发现的CCL8的表达与移植物抗宿主疾病的相关性的机理目前 为止尚不明确。 作为需要测定CCL8蛋白质量的受试试样，可以使用从受试者或受试动物中获取
的体液、血液、血清及血浆等。另外，还可以使用取自受试者的组织和细胞。 取自受试者的试样中CCL8蛋白质的量，可以使用抗CCL8抗体，采用本技术领域中
熟知的免疫学测定法进行测定。抗CCL8抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体。市场上销
售有多种抗CCL8多克隆抗体及单克隆抗体，上述抗体均可用于本发明。 或者，抗体也可以采用本技术领域熟知的方法进行制备。与CCL8结合的多克隆抗
体可以如下得到使用CCL8或其肽片段作为致敏抗原将动物免疫，从免疫后的动物中分离
含有抗体的抗血清，使用ELISA分析、蛋白质印迹分析或放射免疫测定等本技术领域熟知
的方法，确认具有所希望特异性的抗体的存在。 与CCL8结合的单克隆抗体可以如下得到根据本技术领域熟知的方法使用CCL8 或其肽片段作为致敏抗原将动物免疫，取出所得的免疫细胞使其与骨髓瘤细胞融合，选择 产生抗体的杂交瘤并进行克隆，培养该杂交瘤，由此得到。 本发明使用的抗CCL8单克隆抗体中，除了由杂交瘤产生的抗体之外，还包括由用 含有抗体基因的表达载体转化的转化体产生的基因重组抗体。基因重组抗体可以如下制 备由生产与CCL8结合的单克隆抗体的杂交瘤克隆编码抗体的cDNA，将该cDNA插入表达 载体中，使用该载体对动物细胞，植物细胞等进行转化，培养该转化体而制备。另外，可以将 编码抗CCL8抗体的基因导入转基因动物，在转基因动物中产生抗CCL8抗体。
为了治疗人类患者进行使用时，根据本发明的抗CCL8抗体优选为人型嵌合抗体 (human chimeric antibody)或人源化抗体。人型嵌合抗体是由人之外的动物抗体的重链 可变区及轻链可变区、和人抗体的重链恒定区及轻链恒定区构成的抗体。人源化抗体由来 自人之外的动物的抗体的互补决定区(CDR)、和来自人抗体的构架区(FR)及C区域构成。 由于人型嵌合抗体及人源化抗体由于在人体内的抗原性降低，所以作为本发明药物组合物 的有效成分有用。用于得到人型嵌合抗体及人源化抗体的一般的基因重组方法以及评价上 述抗体的结合活性的方法在本技术领域是公知的。或者，也可以通过向具有人抗体基因的 全部的全套抗体库的转基因动物给与CCL8得到抗CCL8人抗体。 并且，在本发明中也可以使用抗体片段。所谓抗体片段是指虽然缺失抗CCL8抗体 全长的一部分但仍具有对CCL8的结合能力的肽。作为抗体片段的例子，例如可以举出Fab、 Fab'、F(ab' )2，Fv等。抗体片段可以通过用酶处理抗体生成抗体片段而得到。进而，本发 明的抗体片段还包括通过用连接体等连接抗CCL8抗体的VL链和VH链而构筑的抗体片段及其二聚物，例如scFv、双链抗体(diabody) 、 sc(Fv)2等。 使用由此得到的抗体利用免疫学方法测定从受试者或受试动物获取的试样中的 CCL8蛋白质。测定可以为定性测定也可以为定量测定。取自受试者的CCL8表达的免疫学 测定例如可以使用放射免疫测定、ELISA、免疫沉淀法、免疫凝集法、蛋白质印迹法等进行。
例如，作为典型例子可以如下进行夹心ELISA。采集受试者的外周血调制血桨，将 其加入固定有抗CCL8抗体的平板或芯片上培养适当时间。清洗平板或芯片除去未结合成 分后，加入其它抗CCL8抗体。所述抗体可以通过酶、荧光色素、化学发光物质、生物素、放射 性化合物等进行标记使其可以进行检测。培养适当时间后清洗平板或芯片，通过测定荧光、 发光、放射活性等，检测标记。或者，也可以使抗CCL8抗体结合后加入二次抗体(例如羊抗 小鼠抗体)增强信号。二次抗体用酶、荧光色素、化学发光物质、生物素、放射性化合物等标 记使其可以进行检测。如上所述，可以测定取自受试者的血浆中CCL8蛋白质的量。
其它方案中可以使用利用了凝集反应的检测方法检测CCL8蛋白质。在该方法中 可以使用结合有抗CCL8抗体的载体例如胶乳粒子检测CCL8。如果将结合有抗CCL8抗体的 胶乳粒子与试样混合培养一定时间，若试样中含有CCL8则粒子发生凝集。肉眼观察该凝集 的程度或者使用分光光度计进行定量，由此可以检测试样中的CCL8。 在其他方案中可以使用利用了表面细胞质基因组共振现象的生物传感器检测 CCL8蛋白质。利用了表面细胞质基因组共振现象的生物传感器以表面细胞质基因组共振信 号的形式对蛋白质_蛋白质间的相互作用进行监控。例如，通过使用BIAcore (Pharmacia 制)等生物传感器，可以检测CCL8蛋白质与抗CCL8抗体的结合。具体而言，使受试试样与 固定有抗CCL8抗体的传感器芯片接触，能够以共振信号变化的方式检测与抗CCL8抗体结 合的CCL8蛋白质。 或者，CCL8蛋白质也可以如实施例2所示使用金属螯合剂和肝素等亲和载体将受
试试样进行粗精制(浓縮)后通过MS进行检测及定量。另外，也可以如实施例3所示通过
HPLC进行检测及定量，也可以通过进行双向电泳后进行银染色来检测及定量。 另外，本发明提供含有抗CCL8抗体的移植物抗宿主疾病诊断试剂。本发明的移植
物抗宿主疾病诊断试剂以诊断试剂盒的形式提供。诊断试剂盒含有用于检测CCL8的试剂
例如抗CCL8抗体作为有效成分。另外，该试剂盒还可以进一步含有测定所需的适当试剂
类，例如缓冲液、稀释液、反应终止液、清洗液和对照样品等。 在本发明中可以以如上所述测定的CCL8蛋白质的量作为指标进行移植物抗宿主 疾病的检查。如果按照本发明的方法，无需目测检查或观察腹泻量，可以以CCL8蛋白质作 为标记，客观地诊断移植物抗宿主疾病，可以监控移植物抗宿主疾病的发病及过程。本发 明的检查方法对于例如移植物抗宿主疾病发病前的诊断(早期诊断)、发病的确诊、严重程 度的判定、疾病过程的监控、治疗效果的判定及预后的预测有用。特别是如图14所示由于 CCL8蛋白质的表达量经过由TLR(Toll样受体)介导的途径没有升高，所以通过使用CCL8 蛋白质作为标记可以对移植物抗宿主疾病和细菌或病毒感染进行鉴别诊断。
如下述实施例所示，移植物抗宿主疾病发病的患者中CCL8的表达量与发病前相 比显著升高。实施例8中，骨髓移植模型小鼠呈现出CCL8的表达量自确认移植物抗宿主疾 病临床表现两天前开始上升。进而，如图8及9所示，即使在人类患者中CCL8的表达量也 自观察到移植物抗宿主疾病临床表现之前开始上升，这表明根据本发明的方法可以进行移
7植物抗宿主疾病的早期诊断。另外，本发明的方法对治疗效果的判定也有用。如图8及9 所示，通过治疗移植物抗宿主疾病临床表现得到改善，同时观察到CCL8的表达量下降。在 治疗抗性GVHD中通常的甲基泼尼松龙(methylprednisolone)治疗无效，需要进行更加严 格的治疗，由于这种治疗副作用强，所以根据本发明的方法边适当地监控治疗效果边调节 给药量进行处置是有益的。 另外，如图11所示由于CCL8的表达量与移植物抗宿主疾病的严重程度及预后相 关，所以根据本发明的方法可以早期发现重症患者并进行适当治疗。 并且，本发明的方法对移植物抗宿主疾病的治疗方法的开发及改良也有用。如图 11所示，通过检查CCL8的表达量可以明确具有治疗抗性GVHD病例的患者。对这种患者还 没有确立治疗方法。因此，通过对上述病例边进行上述监控边研究同时使用多种制剂等的 效果，可以期待开发适合的治疗方法。 进而，由于对于移植物抗宿主疾病通常没有特效药，所以根据本发明以CCL8的表 达量作为指标，可以筛选移植物抗宿主疾病治疗药的有力的候选物质。可以通过向移植物
抗宿主疾病的模型动物给与试验物质，测定取自模型动物的试样中CCL8蛋白质的量，进行 筛选。作为试验物质例如可以使用抗CCL8抗体。或者，试验物质也可以由各种合成或天然 的化合物文库、组合文库、寡核苷酸文库、肽文库等文库中取得。另外，还可以使用由细菌、 真菌类、藻类、植物、动物等天然物得到的提取物或其部分精制物作为试验物质。在给与试 验物质时与未给与试验物质时相比，在CCL8蛋白质的量低的情况下，可以选择上述试验物 质作为移植物抗宿主疾病治疗药的候选物质。即，本发明的检查方法提供开发移植物抗宿 主疾病的新型治疗方法的平台。 另外，本发明提供含有抗CCL8抗体作为有效成分的、用于治疗移植物抗宿主疾病 的药物组合物，以及通过给与抗CCL8抗体治疗移植物抗宿主疾病的方法。如下述实施例9 所示，对移植物抗宿主疾病模型动物给与抗CCL8抗体进行病理学评价，结果确认了炎症细 胞对皮肤的表皮真皮接合部的浸润减少，毛囊及皮脂腺的障碍减轻，表明给与抗CCL8抗体 对GVHD的治疗有效。 本发明的药物组合物可以采用本领域技术人员公知的方法进行制剂化。例如可以 通过适当组合药学上允许的载体或介质，具体而言为灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、 混悬剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂等，以通常认可的进 行制药所要求的单位用量形态混合，进行制剂化。 用于口服给药时，可以通过将本发明的提取物或化合物或其盐与本技术领域中公 知的药学上允许的载体进行混合，制成片剂、丸药、糖衣剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆 剂、浆液、悬浮液等。 用于非口服给药时，可以使用本技术领域公知的药学上允许的媒介物，将本发明 的提取物或化合物或其盐制成注射用制剂、喷雾给与用制剂、透皮给与用制剂等形态。
可以通过口服给药或非口服给药将本发明的药物组合物给与患者。优选为非口 服给药。作为给药途径，例如可以举出静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、直 肠内给与、经鼻给与、经肺给与、透皮给与等。作为给药量例如可以在每lkg体重每次给与 0. 0001mg至1000mg的范围内进行选择。主治医生可以根据患者的年龄、症状的严重程度、 给药中的其他药物等适当选择给药途径及给药量。
本说明书中明确引用的全部专利及参考文献的内容均作为参照引入本说明书中。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
实施例1
骨髓移植(BMT) 通过对小鼠进行异种骨髓移植诱导急性GVHD。作为受体小鼠使用BALB/c (H_2d); 作为供体小鼠，用于异种BMT时使用C57BL/6 (H_2b)，用于同种BMT时使用BALB/c (H_2d)。 小鼠均为7-12周龄(Sankyo Labo Service Corporation)。 在BMT当日通过颈椎脱臼处死供体小鼠。冲洗股骨及胫骨的骨体，收集供体的骨 髓细胞，放入含有2X胎牛血清/1X青霉素-链霉素的DME培养基(Dulbecco' s modified Eagle' s medium)中调制单细胞悬浮液。用RPMI1640培养基清洗细胞，再悬浮于相同培 养基中。调制骨髓细胞接种物，使其在用于异种BMT时200 L中含2X 107个骨髓细胞，用 于同种BMT时100 ii L中含1 X 106个骨髓细胞。 受体BALB/c小鼠在BMT前用酸性水饲养至少7日，防止致死量放射线照射后的败 血症。以0. 34Gy/分钟的比例对受体小鼠进行共计8. 5Gy的全身照射，在3小时以内经尾 静脉静脉内注射供体小鼠骨髓细胞。
GVHD的监控 每日观察受体小鼠的GVHD临床表现，即体重减少、弓背姿势、皮肤红斑、脱毛及腹 泻。在异种BMT小鼠中在移植后7日以内出现急性GVHD的临床症状，例如腹泻及褶皱状白 苔(ruffled fur) ，21日以内确认到皮肤红斑及脱毛。在第14日与第21日之间出现死亡 例。 组织病理学分析 在移植后第7日、第14日、第21日及第28日处死受体小鼠。取出皮肤、肝脏及小 肠，在10%福尔马林缓冲液中固定。将固定后的组织包埋在石蜡中制备切片，用苏木精及曙 红染色，在显微镜下观察。代表脏器中的认为与GVHD相对应的组织学变化如下所述皮肤 (单核细胞向表皮真皮接合部的浸润及毛囊或皮脂腺的损伤)；肝脏(单核细胞向门静脉的 浸润及肝细胞坏死)；及小肠(隐窝细胞的细胞程序死亡及绒毛扩张或变平)。评分系统是 分别将上脏器的阴性结果作为0，阳性对照作为1 ( 一只小鼠的最大分数为6)。图1表示各 时间点平均病理学评分和临床症状。该结果为5次独立实验的代表例。受体小鼠在移植后 的全部时间点均有GVHD的病理学征兆，第14日的病理学评分最大。另外，各时间点的病理 学评分与GVHD的临床表现一致。
血浆样品 在BMT前及BMT后第7日、第14日、第21日及第28日采集血液样品。使用涂布 了肝素的毛细管从活小鼠的尾静脉采集血液样品，在30分钟以内在10，000rpm下离心分离 5分钟调制血浆。用于分析之前将其于-8(TC下保存。
实施例2 SELDI蛋白质芯片阵列分析 向10iiL各血浆样品中加入于Tris-HCL(pH7. 4)中含有9mol/L尿素及10g/L CHAPS的20 ii L溶液。将混合物于4"下涡旋15分钟，用Tris-HCl将其稀释为1 : 40。用 50mmol/L CuS04活化8斑点固定金属亲和捕获阵列(IMAC-30)。将稀释后的样品(50 y L)
9加入蛋白质芯片阵列的各斑点中，在振荡器中培养l小时。用相同的Tris-HCL清洗后用 水轻轻洗涤，在各斑点中加入0. 5iU的饱和芥子酸(sin即inic acid ;SPA)加2次，进行 风干。使用Ciphergen ProteinBiology System II飞行时间质谱仪(PBS II， Ciphergen Biosystems，Inc)测定与螯合后的金属结合的蛋白质的质荷比(m/z)光谱。通过将在激光 强度200及检测器灵敏度8的条件下得到的65个激光脉冲(laser shots)进行平均，求出 数据。 SELDI-TOF质谱的统计学分析 编译全部的光谱，使用Ciphergen Protein Chip Software 3.2.0.进行数据初步 分析。作为血浆样品使用GVHD组(移植后第7日、第14日、第21日及第28日)50个样品 及对照组(BMT前)28个样品共计78个样品。结果在m/z = 2k 200k的范围内检测到表 达不同的共169个峰。对于这些峰通过使用Biomarker Pattern' s Software对2组间进 行比较，提取峰强度变化为5倍以上且p < 0. 05的峰，结果发现在GVHD组中有10个峰上 升、9个峰下降。 利用SELDI-T0F MS得到的蛋白质谱 对上述2. 0-200kDa质量范围的169个峰进一步使用峰强度值进行分析。使用 Biomarker Pattern' s Software (BPS， CiphergenBiosystems， Inc)，禾U用交叉验证法使用 全部169个峰制备分类树。简单而言，在分类树中一次使用一个规则以问题的形式将数据 分割为两个节点。在该实验中基于由SELDI蛋白表达谱鉴定的峰或簇的归一化强度水平来 确定分割。即，由SELDI谱鉴定的各峰或簇是分类过程中的变量。继续进行分割过程直至 达到末端节点且不能由数据分类进一步分割。 使用该方法制备多个分类树，基于分类树分析选择最优秀的分类树。结果，作为在 GVHD组中与对照组相比明显上升的峰之一，选择8972Da的峰。通过使用8972Da的峰可以 对GVHD组和对照组进行分类使灵敏度及特异度均为100%。 8972Da峰的表达例如图2所示。图2A表示在6000-lOOOODa范围内由相同个体的 小鼠得到的正常对照样品(preBMT ;移植前)及GVHD样品(移植后第7日、第14日、第21 日及第28日)的代表性SELDI光谱。线包围的部分表示平均质量S972Da的峰。确认到所 述峰与正常血桨相比GVHD过量表达，第7日以后峰强度明显上升。组织评分和峰强度均在 第28日下降。图2B表示各时间点样品中8972Da峰的平均归一化强度(在各个点n = 9)。 GVHD样品峰的平均表达明显高于对照样品(preBMT;移植前)的平均表达。
CsA给药模型 将作为GVHD治疗药的环孢菌素A(CsA) (Novartis Pharma)用0. 9% NaCl稀释至 1.67mg/mL。从移植后第8日至第13日对异种移植小鼠以每日20mg/kg的用量腹腔内给与 CsA。图3表示CsA给与例的同一个体中8972Da峰的推移、以及各时间点样品中8972Da峰 的平均归一化强度(在各个点n = 4)。在CsA处置GVHD小鼠中8972Da的峰强度在第7日 上升，给与CsA后下降。
同种移植模型 在使用具有从BALB/c小鼠移植的骨髓移植的BALB/c小鼠的同种移植模型中没有 诱发GVHD，并且在移植前样品和移植后样品中峰的平均表达没有显著性差异(图4A， B)。
实施例3
舶薩,分m 禾U用免疫耗竭色谱法(Multiple Affinity Removal Column MS_3，4. 6mm IDX50mm ;Agilent)从汇集后的血浆样品中除去量最多的三种血浆蛋白质(白蛋白、IgG、 运铁蛋白)。用缓冲液A(Agilent)将50iiL血浆稀释至5倍，注入免疫耗竭色谱柱。回收 流过的馏分(flow-through fractions)，用高效液相色谱法(HPLC)进一步分离。HPLC中 使用的分离柱为Inertsil(注册商标)Ph柱(5iim，4.6mmlDX150mm;GL Sciences)。洗脱 梯度分布情况如下所述(1)洗脱溶剂A 2% ACN/0. 1% TFA， B 80% ACN/0. 1% TFA ; (2) 线性梯度:0-100% B/50分钟；流速1. Oml/分钟。 每30秒收集馏分，将2 ii L馏分置于Au芯片(Ciphergen)上，用SPA基质处理，用 SELDI-TOF MS监控各馏分的组成。根据SELDI-TOF MS监控回收洗脱时间为31. 0_31. 5分 钟(约38%乙腈)的HPLC馏分。在GVHD样品中含有大量8972Da蛋白质，但在对照样品中 却基本没有(图5A)。冷冻干燥该馏分并溶解于200yL溶解缓冲液中(7M尿素、2M硫脲、 50m MDTT、2% Ampholine、3% CHAPS、1% TritonX-100)。 然后，将如上所述浓縮后的样品用2D电泳进行分离。超声波处理后，将样品溶 液置于IPG胶条(pH3-ll， NL，长度llcm， AmershamBioscience)中，将该胶条在30V下再 水化10小时。作为第一维分离的等电聚焦电泳法(IEF)使用IPGphor系统(Amersham Bioscience)在20。C下共进行12kVhr。 IEF后将IPG胶条在含有6M尿素、2% SDS、30X丙 三醇、0. 002%溴酚蓝及1%二硫苏糖醇的50慮Tris-HCL(pH8. 8)中平衡化15分钟，然后在 含有2. 5%碘乙酰胺代替二硫苏糖醇的相同缓冲液中再平衡15分钟。使用8-20%梯度聚 丙烯酰胺凝胶进行作为第二维分离的SDS-PAGE，在40mA/凝胶的恒电流下进行电泳。2D电 泳后通过硝酸银染色使蛋白质可见。通过比较GVHD及对照样品的两个凝胶的图像，鉴定出 位于6， 500Da-12， 300Da、在GVHD样品中高度表达的斑点(spot)(图5B， C)。
g白质的鉴定 将作为候补蛋白质的8972Da的斑点在凝胶内消化。简单而言，用100% ACN及 100mM NH4HC03清洗切下的凝胶斑点，然后真空干燥，在5 y L胰蛋白酶溶液(50mMNH4HC03 及5mMCaCl2中12. 5ng/ ii L)中于37。C下培养16小时。将得到的肽用20 ii L 20mMNH4HC03 提取一次，用20ii L的在50% ACN中为5%甲酸提取三次。将回收的提取物真空干燥至约 40 ii L，然后用NanoFlowHPLC-ESI-MS/MS进行分析。使用DiNa系统(KYA)进行HPLC，用Hi Qsil(注册商标)C18色谱柱(75iimlDX50mm ;KYA)分离胰蛋白酶消化后的样品。分离条件 如下所述。洗脱溶剂A :0. 1X甲酸，溶剂B :0. 1%甲酸中70% ACN，梯度0-100% B/40分 钟，流速200nL/分钟。使用QSTAR XL Q-TOF质谱仪(A卯lied Biosystems)确定分离得 到的肽的特性。使用所得的质谱数据通过MASCOT软件(Matrix Science Inc.)检索NCBI 蛋白质数据库。 结果，8972Da蛋白质的部分氨基酸序列与CCL8前体序列一致。从8972Da蛋白质
分离得到的肽的代表MS/MS光谱示于图6。所述肽通过Nano LC-MS/MS被鉴定为CCL8肽
68-79 (QGMSLCVDPTQK)。同样操作鉴定与理论质量相匹配的ll种肽。如果将上述肽的序列
组合，则CCL8前体的氨基酸序列的52%被覆盖(下划线部分)。 1MKIYAVLLCL LLIAVPVSPE KLTGPDKAPV TCCFHVLKLKIPLRVLKSYE 51 RINNIQCPME AVVFQTKQGM SLCVDPTQKWVSE预EILDQ KSQILQP (序列号1)
11
CCL8前体的推定质量为11，017Da，推定pl为8.64。 CCL8前体含有19个氨基酸的 信号肽及与其相连的78个氨基酸残基的成熟CCL8序列。成熟CCL8的推定质量为8972Da， 推定pl为8. 45，这与由SELDI-TOF MS及2D-PAGE得到的数据一致。
实施例4 利用免疫测I定确认CCL8表汰 通过使用特异性的家兔抗小鼠CCL8抗体的SELDI免疫测定，进一步确认8972Da 标记为CCL8。在PS20(Preactivated Surface)蛋白质芯片(Ciphergen)的各斑点加入 0. 1 y g抗小鼠CCL8抗体，在加湿室中室温下培养2小时。用5 iil的1M乙醇胺(pH8. 0)将 残留活性部位封闭30分钟后，将斑点用PBS中的0. 5% TritonXlOO清洗三次，用PBS清洗两 次。用PBS将血浆样品稀释至1 : 75，加入PS20芯片的抗体固定斑点中，边使用生物芯片 处理器(bioprocessor)在室温下柔和地混合边培养2小时。将各斑点用PB S中的0. 5% TritonXlOO清洗两次，用PBS清洗两次。用5mM HEPES轻柔清洗后加入SPA基质，使用PBS II蛋白芯片阅读器进行MS分析。结果，从GVHD血桨样品中检测到CCL8，但在对照样品中 基本没有检测到(图7)。
实施例5 人类临床样品中的CCL8表汰 作为人临床样品，使用将从接受了骨髓移植的人类患者中得到的血浆在PBS中以 1 : 25稀释得到的样品。与实施例4同样操作，使用PS20蛋白质芯片，使用抗人CCL8抗 体，通过SELDI免疫测定调查人类患者中CCL8的表达。
患者1(图8)
5岁男子 诊断范可尼贫血(Fanconi anemia)
处置非亲缘者间脐血移植(CBSCT(UR))
预防药CsA+匪F 过程移植后第13日皮肤GVHD发病，在该日开始甲基泼尼松龙治疗(mPSL)。在临 床GVHD发病前移植后10日出现CCL8。通过治疗这种情况暂时下降。但是，之后在GVHD再 次发作的同时，CCL8的表达量也再次增加。患儿暂时对治疗产生反应但最终由于治疗抗性 GVHD而死亡。CCL8的表达量与GVHD的发病及治疗效果相关。另夕卜，陷入治疗抗性后CCL8 不再下降。 患者2(图9)
IO岁男子 诊断慢性骨髓性白血病(CML)
处置非亲缘者间骨髓移植(BMT(UR))
预防药FK+MTX 过程移植后第19日皮肤GVHD发病，从该日开始甲基泼尼松龙治疗(mPSL)。该 日CCL8显示出明显的增加。GVHD—度由第二阶段转向第三阶段，但通过之后的治疗得到改 善，也未见CCL8再次高度表达。
患者3(图10)
3岁女子
诊断急性淋巴性白血病(ALL) 处置适合同胞间骨髓移植(BMT (matched-sib.)) 预防药MTX 过程没有GVHD发病。过程中未见CCL8高度表达。
患者4(图12)
11岁女子 诊断急性淋巴性白血病(ALL)
处置适合同胞间骨髓移植(MSD-BMT)
预防药短期MTX 过程移植后第11日GVHD发病。显示CCL8的表达增加。从该日开始CIV给与环 孢菌素A。在第14日GVHD的症状改善，CCL8的表达也下降。
患者5(图13) 患有严重再生障碍性贫血的19岁女性接受了来自HLA 1抗原不匹配的父亲的骨 髓干细胞移植。患者接受了由150mg/m2的氟达拉滨(Flu)及120mg/kg的环磷酰胺(CY)及 24mg/kg的抗胸腺细胞球蛋白(ATG)构成的移植前调节，使用他克莫司预防GVHD。移植后 第IO日患者出现高烧，第16日在四肢及躯体出现非定型皮疹。未出现腹泻。第20日CCL8 呈现明显增加。第23日进行皮肤活检，开始甲基泼尼松龙(mPSL)治疗。在第31日GVHD 症状改善，CCL8的表达也下降。
实施例6 移禾宵物抗宿主疾病患者和iH常人中的CCL8的血浆浓度定量结果
对正常人的血浆、及接受了造血干细胞移植的患者中移植物抗宿主疾病发病的患 者及未发病的患者的血浆CCL8进行定量。结果示于图11。数值的单位为Pg/mL。接受了造 血干细胞移植的患者中移植物抗宿主疾病未发病的患者的血浆CCL8浓度为6. 92-48. Opg/ mL平均23. 3pg/mL。但是，移植物抗宿主疾病发病的患者的血浆CCL8浓度为明显高的浓度， 为52. 0-333. 6pg/mL平均133. 3pg/mL。进而，在治疗抗性GVHD的2例中显示出极高的浓度 333. 6pg/mL及290. 4pg/mL。这两个病例对GVHD治疗具有抗性，已经死亡。正常人的血浆 CCL8浓度为极低值0-32. 6pg/mL，平均为18. 9pg/mL。由上述结果可知，在移植物抗宿主疾 病发病的患者中血浆CCL8量明显高于正常人，而且在治疗抗性GVHD的患者中血浆CCL8量 极高。 以上结果表明人类患者的GVHD的发病及过程与CCL8的表达量之间存在显著的相 关性。 实施例7 与感染症的鉴别诊断 测定对小鼠给与TLR配体时CCL8的表达水平。 雌性BALB/c (H_2d)小鼠购自Sankyo Labo Service Corporation (Tokyo, Japan)。小鼠在实验开始时为8_10周龄。在无特别说明的情况下，试剂均购自SIGMA/ ALDRICH(Tokyo, J即an)。 向野生型BALB/c小鼠的腹腔内注射500ii1 PBS，在所述PB S中含有5iig的脂 多糖(LPS) (Eschrichia coli) 、5 li g的poly (I :C) (GE Health care BioScience， Tokyo,
13Japan)及20mg的D-GalN、 lOOmg的肽聚糖(PGN) (staphylococcus aureus) (Invitorogen， CA， USA) 、20mg的酵母聚糖_A (Invitorogen， CA， USA)或20nmol的CpG-ODN(Invitorogen， CA，USA)。向对照小鼠腹腔内注射500 L的PBS。注射4小时后回收血浆样品。根据预实 验确定LPS、 poly (I :C) 、 PGN、酵母聚糖_A或CpG-0DN的给药量。 注射4小时后使用经肝素处理的注射器采集小鼠血浆样品，在30分钟以内在 5，000rpm下离心分离7分钟。进行分析之前于-S(TC下保存分装后的血浆。对志愿者及患 者进行采血调制血浆样品，分装，进行分析之前于-80°C下保存。 人CCL8使用酶免疫分析(ELISA)进行测定。人CCL8ELISA试剂盒购自 RayBiotech(Norcross， GA)，根据制造商的手册进行使用。在450nm下使用平板阅读器 (plate reader)读取平板(MultiskanJX， Thermo Labsystems， Helsinki, Finland)。
结果以平均+/-SE表示。通过双侧或单侧t检验中的任一种进行统计学显著性分 析。显著性差异设定为P <0.05。多重比较中适用Bonferroni校正。结果为一系列实验 的代表数据。 如图14所示，表明通过给与TLR配体CCL8水平未上升。这表示细菌或病毒感染 未引起CCL8的表达水平上升，暗示以CCL8表达作为指标可以鉴别诊断GVHD和感染症。
实施例8
GVHD发病前诊断 与实施例1同样操作进行小鼠同种BMT，在第1、3、5及7日采血，得到肝素血浆样 品。使用Mouse CCL8 ELISA对其血浆中CCL8的浓度进行定量。 另一方面，对同种BMT后第O日至第7日的体重变化及第7日的体重减少、弓背姿 势、毛皮(coat)、皮肤、腹泻进行评分，进行0、l、2三阶段评价。在体重减少方面，将减少不 足10%记为0，减少为10-小于25%记为1分，减少25%以上记为2分。在弓背姿势方面， 将正常姿势记为O，稍稍呈现弓背姿势记为1分，基本是弓背姿势时记为2分。在毛皮方面， 将正常情况记为O，毛稍稍竖起记作1分，将基本不梳理毛发、全身毛竖起的情况记为2分。 在皮肤方面，将正常情况记为O，尾及足呈现硬化记为1分，在有毛部位出现无毛部分时记 为2分。在腹泻方面，将正常情况记为O，稍有腹泻症状记为1分，全面爆发腹泻记为2分。 临床GVHD评价给出各评判标准的总分数，最高分为10分。 血浆中CCL8浓度的经时变化示于图15。血浆中CCL8的浓度从骨髓移植后早期开 始上升，从第5日开始显著增加。相对于此，至第6日仍未出现GVHD的临床表现。在临床 GVHD评价中第7日约为2.5分，是GVHD初期状态。之后，所有小鼠在第7日以后GVHD症状 进展，第28日的分数为6.3。 根据上述结果， 一般认为血中CCL8蛋白质的定量对小鼠GVHD发病前诊断或GVHD
早期诊断有用。 实施例9 使用抗CCL8抗体的GVHD的治疗 抗小鼠CCL8家兔抗体如下配制向家兔给与合成CCL8肽，使用亲和色谱柱从所得 的抗血清中精制抗CCL8IgG馏分，由此进行配制。作为对照的正常家兔抗体，使用正常家兔 血清的IgG馏分。 与实施例1同样操作进行小鼠骨髓移植。从异种骨髓移植前一日开始连续3日，
14通过受体小鼠尾静脉分别给与100iig抗小鼠CCL8家兔抗体或正常家兔抗体。对抗小鼠CCL8抗体(治疗组)和正常家兔抗体(对照组)各三只分别进行治疗。在骨髓移植14日后通过颈椎脱臼处死小鼠。取出皮肤、肝脏及小肠，在10%福尔马林缓冲液中固定。将固定后的组织包埋于石蜡中制备切片，用苏木精及曙红染色，在显微镜下观察认为是GVHD的病理学症状。评价方法如下所述皮肤(单核细胞向表皮真皮接合部的浸润及毛囊或皮脂腺的损伤)；肝脏(单核细胞向门静脉的浸润及肝细胞坏死)；及小肠(隐窝细胞的细胞程序死亡及绒毛的扩张或变平)。以阳性(+)、阳性与阴性的中间态(+/_)、阴性(_)三阶段进行评价。 图16表示皮肤组织染色结果的代表例。(a)给与抗小鼠CCL8抗体，(b)给与正常家兔抗体(对照)。作为皮肤GVHD症状的皮脂腺损伤(箭头)及淋巴细胞向表皮真皮接合部的浸润(箭头指示符号)，在正常家兔给药组中出现，但在抗小鼠CCL8抗体给药组中没有确认到。 图17表示使用上述评分系统的结果。仅在抗CCL8抗体处理小鼠中确认到炎症细胞向皮肤的表皮真皮接合部的浸润减少、毛囊及皮脂腺障碍减轻。这表明抗CCL8抗体处理对GVHD的治疗有效。
产业上的可利用性 本发明对移植物抗宿主疾病的诊断及过程的监控、以及治疗有用。
权利要求
一种用于检查移植物抗宿主疾病的方法，其特征在于，测定取自受试者或受试动物的试样中CCL8蛋白质的量，并将得到的测定值作为移植物抗宿主疾病的诊断或过程的指标。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，在移植物抗宿主疾病的临床症状发病前进行移植 物抗宿主疾病的诊断。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中，使用抗CCL8抗体测定CCL8蛋白质的量。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其中，使用选自质谱法、高效液相色谱法及双向电泳 中的方法测定CCL8蛋白质的量。
5. —种移植物抗宿主疾病的诊断试剂，含有抗CCL8抗体。
6. —种选择移植物抗宿主疾病治疗药的候选物质的方法，包括以下步骤， 向移植物抗宿主疾病的模型动物给与试验物质，测定取自所述模型动物的试样中的CCL8蛋白质的量，然后比较给与试验物质时与未给与试验物质时的CCL8蛋白质的量，在给与试验物质 时的CCL8蛋白质的量低于未给与试验物质时的CCL8蛋白质的量的情况下，选择所述试验 物质作为移植物抗宿主疾病治疗药的候选物质。
7. —种用于治疗移植物抗宿主疾病的药物组合物，含有抗CCL8抗体作为有效成分。
8. —种治疗移植物抗宿主疾病的方法，包括向患有移植物抗宿主疾病的受试者给与抗 CCL8抗体。
全文摘要
本发明公开了一种用于检查移植物抗宿主疾病的方法，其特征在于测定取自受试者的试样中CCL8蛋白质的量，并将得到的测定值作为移植物抗宿主疾病的诊断或过程的指标。另外，还公开了含有抗CCL8抗体的移植物抗宿主疾病的诊断试剂。通过本发明方法可以诊断移植物抗宿主疾病的发病及监控其过程，特别是可以进行移植物抗宿主疾病和传染病之间的鉴别诊断。进而还提供一种使用抗CCL8抗体的移植物抗宿主疾病的治疗方法。
文档编号G01N30/72GK101743473SQ20088002142
公开日2010年6月16日 申请日期2008年6月23日 优先权日2007年6月22日
发明者今井浩三, 堀司, 堤裕幸, 小海康夫, 苗代康可 申请人:北海道公立大学法人札幌医科大学;株式会社免疫生物研究所