专利名称：用于区分和拣选含有感兴趣的遗传因子的种子的方法和计算机程序产品的制作方法
技术领域：
本发明不同的实施方案通常涉及一种方法和计算机程序产品，其
区分和拣选，更具体的，本发明的实:方案能够通过检测 一种或多种 可辨别的标记物的存在，来区分和拣选含有感兴趣的遗传因子的种子， 该标记物被连接到一种或多种相应的感兴趣的遗传因子上。
背景技术：
遗传工程包括将新的遗传信息插入到已经存在的生物体细胞中来 创造新的基因型，目的是为了改变该生物体的一种或多种特性而对它 进行改性。可以出于多种原因来对活的生物体进行遗传工程，包括合 并新的和/或有益的特性到该生物体中。对于农作物种植而言，这可以 包括遗传工程种子，目的是使得由该种子长成的植物包括一种或多种 有益的特性。这样遗传工程可以包括但不限于插入编码可辨别的标记 物的基因或者赋予抗除草化合物性能的基因。单个遗传改性生物体的 后代也会包含感兴趣的遗传因子，因此研究者会希望从大样中隔离和/
常规的遗传技术也可以用来组合至少两种生物体的特性，来在"遗
传交配(genetic cross)"和/或杂种生物体中产生新的和/或有益的特性。
通常难以确定一种具体的种子是否包含感兴趣的遗传因子，特别 当与没有进行如此改性的种子相混合时更是如此。使用现有的技术， 将不得不使具体的种子发芽生长，然后取样所形成的植物，来确定该 种子是否可能包含感兴趣的遗传因子。或者，不得不取样该种子本身。 但是，在各自的植物发芽生长之前来区分一组含有感兴趣的遗传 因子的种子具有一定的优势，特别是在其中研究区域空间、进行拣选 的人员、和时间通常是有限的植物研究学科中更是如此。在玉米以及 其他依靠风来授粉的农作物中，经常对植物进行人工授粉，其中人工 将花粉从穗状雄花(tassel)转移到穗须(silk)上，并将该穗须用生长袋
9(shoot bag)包上来防止其他植物授粉。这种人工授粉方法需要大量的劳 动力和穗状雄花袋和生长袋(shoot bag)。通过拣选种子来事先取消不期 望的植物(即不包含感兴趣的遗传因子的植物)可以消除对于这种劳动 力和时间密集型的活动的需要。另外，研究者会对由含有感兴趣遗传 因子的种子发芽生长而成的植物的潜在产量感兴趣。因此，重要的是 在规定的空间(即研究区域)中由含有感兴趣遗传因子的种子发芽生长 而成的植物在统计上显著的数据。此外，研究者要求准确性，并且经 常不能承受等待或者猜测来确定植物是否包含具体感兴趣遗传因子。 另外，种子和/或种子组织采样是一个精细的技术。例如，如果从具体 的种子中取样过多的组织，则这里存在着该种子不能发芽生长或者不 能产生可繁育的植物的风险。
已经公开了这样的 一 些方法，其用于可视化在转基因(transgenic) 植物中绿色荧光蛋白(GFP)表达来选择转基因种子，例如Kim等人的 US专利No.6947144中所述，具体的，该Kim参考文献描述了 一种用 于分离绿色荧光蛋白(GFP)转化的种子的系统，其包括通过带通滤波器 6'进行滤光的光源5，。光源5'位于在传送带3，上传输的植物样品以上， 并且与其的夹角是45。。 CCD照相机9'也位于传送带3，以上，在被检 验的植物样品4'的正上方。该CCD照相机9'检测由植物样品的一部分 表面区域通过滤波器7'所产生的光。参见例如该Kim参考文献的图9。
但是，该Kim参考文献所公开的系统具有几个不足。例如，这里 有许多不同的特性，包括荧光蛋白的表达，为此，在种子的大于一部 分的表面区域中对该种子进行精密测量会是重要的。在某些情况中， 荧光蛋白的表达沿着种子的整个表面区域可能不是均匀的。因此，如 果种子的局部区域表达为荧光蛋白，并且该区域面朝下(例如靠着Kim 参考文献中的传送带)，则CCD照相机将检测不到该荧光蛋白，该种子 将不能被正确的拣选。
另外，使用GFP来鉴别和/或选择转基因植物材料存在着几个技术 上的挑战。首先，用于GFP可视化的激励和发射波长处于可见光谱的 边缘，并且因此不容易使用常规的研究和/或制造环境中所存在的正常 的"白"光来肉眼观察到(或者不容易被许多常规的可视化系统观察到)。 此外，已经注意到GFP会在已经用该GFP标记的植物材料中体内产生 蛋白质聚集。公知的是不受限制的蛋白质聚集不但会对种子产品产生不利的影响，而且如果GFP标记的种子被引入到与外部的生态系统(例 如邻近农业研究区域的森林和/或湿地)相互作用的农业环境中时，其还 会产生有害的环境影响。
因此，这里需要一种方法和计算机程序产品，其用于从种子大样 中区分这样的种子，该种子包含了与所选择的基因型相结合的标记物。 这种方法和计算才几程序产品应当允许基于标记物的存在或者标记物的 不存在来拣选大样，并且应当提供一定程度的便利性、精确性、速度 和环境安全性，其不是使用常规的技术来获得的。另外，该方法和计 算机程序产品应当提供使用市售的高速拣选装置以最小的改变来正确 的拣选大样的种子的能力，该拣选是基于与所选择的基因型相结合的 标记物存在还是不存在来进行。
发明内容
本发明的实施方案满足上列的需要，并且提供了下述的其他优点。 本发明的一些实施方案可以包括一种从大样(bulk sample)中区分含有 感兴趣的遗传因子的种子的方法，其包括将可辨别的标记物与该大样 的至少一些含有感兴趣的遗传因子的种子相结合，使用评价装置来评 价该大样的至少一些种子存在还是不存在标记物，和基于存在还是不 存在标记物来拣选含有感兴趣的遗传因子的种子。
在一些实施方案中，种子是使用电磁能发射装置来激励的，该发 射装置被配置来激励种子的大部分表面区域。在一些实施方案中，使 用电磁能发射装置激励种子包含使用至少一种照明装置来激励种子， 该照明装置被配置来照亮种子的大部分表面区域。在一些实施方案中， 使用至少一种照明装置激励该种子进一步包含使用两种或者多种排列 的照明装置来共同的照亮该种子的大部分表面区域。在一些实施方案 中，评价大样的至少一些种子包含使用至少一种图像传感装置来评价 大样的至少 一 些种子，该传感装置被排列来接收来自该种子大部分表 面区域的发射。在一些实施方案中，评价大样的至少一些种子进一步 包含使用两种或者多种排列的图像传感装置来共同的接收来自该种子 的大部分表面区域的发射。
本发明的其他实施方案可以包括 一 种方法和计算机程序产品，其
ii色荧光蛋白(RFP)标记物与大样的至少 一些含有感兴趣的遗传因子的 种子相结合，使用评价装置来评价该大样的至少一些种子存在还是不 存在该RFP标记物，和基于存在还是不存在该RFP标记物来拣选含有 感兴趣的遗传因子的种子。
在一些实施方案中，当用波长范围为基本上大约500nm-基本上大 约580nm的某种能量激励时，该RFP标记物是可辨别的。在一些这样 的实施方案中，该某种能量可以基本上在大约550nm具有峰。在其他 实施方案中，该评价步骤包含用某种能量来激励含有感兴趣的遗传因 子的种子；和检测至少部分由该激励步骤所形成的发射。在一些这样 的实施方案中，所形成的发射的波长范围可以是基本上大约500nm-基 本上大约600nm。此外，该发射可以具有基本上在大约580nm的峰。 在一些实施方案中，该评价装置可以进一步包含基本上布置在图像传 感装置和含有感兴趣砝遗传因子的种子之间的至少一个滤波器。该滤 波器可以配置来使得来自红色荧光蛋白标记物的发射通过到图像传感 装置。
一些实施方案可以进一步包含将多个补充标记物与大样的至少一 些含有相应的多个另外的感兴趣的遗传因子的种子相结合。这样的实 施方案可以进一步包含步骤使用评价装置来评价大样的至少一个种 子存在还是不存在多个补充标记物，和基于存在还是不存在多个补充 标记物来拣选含有多个另外的感兴趣的遗传因子的种子。在这样的实 施方案中，该补充标记物可以包括但不限于黄色荧光蛋白；黄色/橙 色荧光蛋白；橙色荧光蛋白；橙色/红色荧光蛋白；红色/橙色荧光蛋白； 红色荧光蛋白；青色荧光蛋白；和这样的补充标记物的组合。
在一些实施方案中，评价装置可以是种子颜色拣选器。在其他实 施方案中，图像传感装置可以是电荷耦合装置(CCD装置)或者互补金 属氧化物半导体(CMOS)装置。在其他实施方案中，评价步骤包含使用 至少一种图像传感装置评价种子的RFP标记物的存在，该传感装置被 配置来区分一定范围的正常种子发射和可辨别的RFP标记物。在其他 实施方案中，拣选步骤可以包含将所拣选单个种子分发到至少一个容 器中，该容器包括仅仅存在RFP标记物的种子或者仅仅在其中不存在 RFP标记物的种子。
其他实施方案进一步包含步骤使用单颗化(singulating)装置从大样中单颗化(singulating)单个种子。在一些实施方案中，该单颗化 (singulating)步骤包含使用与真空源操作相连的多个伸长的中空结构来 单颗化种子。在其他实施方案中，该单颗化步骤包含在料斗中接收大 样并且振动该料斗，来沿着倾斜的螺旋形斜坡推进单个种子，并且通 过被配置成允许一次通过一个种子的间隙。在其他实施方案中，该单 颗化步骤包含在料斗中接收该大样，将种子从料斗供给到可旋转盘， 和旋转该可旋转盘，目的是通过施加离心力来将种子分布到该可旋转 盘的外围。在其他实施方案中，该单颗化步骤包含在料斗中接收该大 样，振动该大样，以使得种子倾向于朝着料斗的开口移动，从该料斗 开口将种子分配到包含至少一个凹槽的倾斜装置，来在该凹槽中形成 成行的单个种子，和通过重力将单个种子从该倾斜装置存放到传输装 置上。
提供了许多的优点，其可以S:但不限于、提供一种方法;:算机程 序产品，其能够允许基于存在还是不存在标记物或者多个RFP标记物 来拣选大样的种子，所述的标记物与所选择的基因型或者多个所选择 的基因型相关。本发明提供一定程度的便利性、速度、精确性和环境 安全性，其不是使用常规的技术来获得的。另外，本发明提供了对所 拣选的种子另外的加工，包括将该拣选的种子分发到容器中。
本发明的方法和计算机程序产品提供了这些优点和其他对本领域 技术人员来说显而易见的优点。
因此已经概括的描述了本发明，现在将参考附图，其不必是按照 尺寸绘制的，在其中
图1表示了一种根据本发明一种实施方案的方法的流程图，该方 法包括步骤将标记物与含有感兴趣的遗传因子的种子相结合，评价 该种子的标记物的存在，和基于存在还是不存在标记物来拣选该种子；
图2表示了根据本发明的一种实施方案，用于区分含有感兴趣的 遗传因子的种子的种子拣选器装置的非限定性示意图3表示根据本发明的一种实施方案， 一种用于在基于标记物的 存在来评价和分离种子之前，带有用于单颗化种子的真空鼓单颗化装置的系统的非限定性示意图4表示根据本发明的一种实施方案， 一种用于在基于标记物的
存在来评价和分离种子之前，带有用于单颗化种子的料斗的系统的非
限定性示意图，该料斗具有斜坡；
图5表示根据本发明的一种实施方案， 一种用于在基于标记物的 存在来评价和分离种子之前，带有用于单颗化种子的可旋转盘的系统 的非限定性示意图；和
图6表示根据本发明的一种实施方案， 一种用于在基于标记物的 存在来评价和分离种子之前，带有用于单颗化种子的斜坡的系统的非 限定性示意图，该斜坡具有凹槽特征；
图7表示了本发明示例性实施方案的示例性电子装置的非限定性 框图，该装置被配置来区分大样的遗传转化的(genetically transferred) 种子；
图8表示了根据本发明一种实施方案的种子拣选器装置的非限定 性示意图，该装置用于区分含有感兴趣的遗传因子的种子；
图9表示了根据本发明一种实施方案的带有真空鼓单颗化装置和 一对照明装置的系统的非限定性示意图；和
图IO表示了根据本发明一种实施方案的带有一对照明装置和一对 评价装置的种子拣选器装置的非限定性示意图，该装置用于区分含有 感兴趣的遗传因子的种子；
具体实施例方式
本发明现在将参考附图，在下文中更充分的描述，在其中表示了 一些，而非全部的本发明的实施方案。确实的，本发明可以体现在许 多不同的形式中，并且不应当解释为受限于在此所阐明的实施方案； 相反，提供了这些实施方案来使得本发明满足可适用的法律的要求。 在全文中，同样的数字表示了同样的元件。
在现有技术的方法下，在发芽生长(germination)之前，难以从不含 感兴趣的遗传因子的种子中区分出包含这样的遗传因子的种子。为了 解决该问题，本发明的不同实施方案提供了一种方法和计算机程序产 品，其至少部分的基于可辨别的标记物和一种或多种含有感兴趣的遗 传因子的种子之间的关系来拣选种子。在本说明书和附加的权利要求中，术语"可辨别的(discernable)"指的是当用某种能量进行激励时，识 别标记物的能力。在不同的实施方案中，这可以包括电磁光谱的可见 光部分，以及紫外和红外光谱。
图1表示了一种表示方法10的流程图，该方法用于从大样中区分 含有感兴趣的遗传因子的种子。在步骤12中，将标记物与大样的至少 一部分的含有感兴趣遗传因子的种子相结合。在不同的实施方案中， 标记物与至少一部分的含有感兴趣遗传因子的种子的结合可以包含多 种用于标记期望的基因型的技术。在一种示例性实施方案，标记物与 至少一部分的含有感兴趣遗传因子的种子的结合包含了将红色荧光蛋 白(RFP)代码的DNA序列联接到期望的特性DNA序列，该期望的特 性DNA序列被插入到种子或者一组种子中。应当注意的是虽然下述的 示例性实施方案是将RFP标记物与期望的特性进行结合，但是在其他 实施方案中，多种荧光蛋白(FP)标记物可以与相同的种子中的期望的特 性DNA序列或者多种期望的特性DNA序列相结合。这样的另外的 FP标记物可以包括但不限于黄色；黄色/橙色；橙色；橙色/红色， 红色/橙色；红色(包括此处所述的RFP);和青色。在其他实施方案中， 该标记物可以包含表型标记物例如(3-半乳糖香酶和荧光蛋白例如青色 荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004) J.CW/ 777: 943-54和Kato等
人(2002) P/"W P/z;w'o/ 729: 913-42),和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的 PhiYFP ,参见Bolte等人(2004),CW/5We"ce "7: 943-54)。对于另 外可选择的标记物而言，通常参见Yarranton(1992)Cw/T.Pp/".所o&c/z. 3: 506-511; Christopherson等人(1992)尸^^.]\^/.^<%^.&/.t/5"^ 89: 6314-6318; Yao等人(1992)Ce〃 71: 63-72; Reznikoff(1992)Mo/.MifcToWo/. 6: 2419-2422; Barkley等人(1980)在7Tze Opera"中，第177-220页； Hu等人(1987)Ce〃 48: 555-566; Brown等人(1987)CW/ 49: 603-612; Figge等人(1988)Ce//52 : 713-722 ; Deuschle等人 (1989)尸rac,A^/./4c^/Jc/.L^力86 :5400-5404 ;Fuerst等人
(1989) /Voc.AW/Jcw/.5W,"&4 86 :2549-2553 ;Deuschle 等人
(1990) 5We"ce248: 480-483; Gossen(1993)Ph.D.Thesis，海德尔堡大学； Reines等人(1993)iVoc.A^/.爿cac/.Sc/.L^4 90: 1917-1921; Labow等人 (1990)Mo/.Ce〃.&o/. 10 : 3343-3356 ; Zambretti 等人 (1992)尸rac.A^/.爿c^.5W.CAS^ 89 : 3952-3956 ; Baim等人(1991)尸roc.A^/Jcac/.6W.6^^ 88: 5072-5076; Wyborski等人(1991)iVwc/e/c ^c/ds / 仏 19 : 4647-4653 ; Hillenand-Wissman(1989)7b/ /c^ A/o/.S^wc.5/o/.10: 143-162; Degenkolb等人(1991)Jw"m/cTo6.^gew" C/zewoAer.35: 1591-1595; Kleinschnidt等人(1988) B/0c/zem,W7 27: 1094-1104; Bonin(1993)Ph.D.Thesis，海德尔堡大学；Gossen等人(1992) /VocA^/Jcm/.^/.a^ 89 : 5547-5551 ; Oliva 等人(1992) ^w"Vm.cTo6. C7^wo^^,. 36: 913-99; Hlavka等人(1985)//"wdZ7ooA:
o/ ￡!xpen'me"to/尸/zflr附"co/og7， 第78巻(Springer-Verlag, 4白4木)；Gill 等人(1988)A^wre 334: 721-724。这样的公开内容在此引入作为参考。 在其他实施方案中，标记物还可以包含可选择的标记物基因，用于转 4匕细月包(transformed cells)的选择。
上面所列出的内容并不表示为限制。任何期望的特性和标记物都 可以用于本发明中。
在不同的实施方案，期望的特性DNA序列可以基本上对应于任何 的期望插入到植物基因组中的特性。
在一种示例性实施方案中，在步骤12中与大样的至少一部分含有 感兴趣的遗传因子的种子相结合的标记物可以包含RFP标记物例如来 自新荧光蛋白(NFP)的Living Colors 系的DsRed和/或DsRed2 RFP标 t己物，其市售自力口拿大Mountain View的Clontech Laboratories, Inc.。 将RFP用作标记物可以提供相对于其他荧光蛋白标记物(例如绿色荧光 蛋白(GFP))的几个优点。例如，不同于GFP, RFP激励和发射波长接 近于电磁光谱的可见光范围的中心。所以，RFP表达的种子在'正常的， 环境白光中可以是肉眼可见的(和未有辅助装置的和/或未改进的照相 机或者其他传感器装置可见的)。因此，种子拣选(例如步骤16)可以在 不需要专门的UV光源和/或检测器的这样的实施方案中来实现。此外， 许多市售的和工业验证过的高速拣选装置是最有效的运行在电磁光谱 的可见光范围内。同样如上所述，因为RFP激励和发射波长主要的中 心处于电磁光谱的可见光范围中，因此拣选(步骤16)可以使用激励性 的和容易获得的装置作为目前用于更常规的质量拣选程序的附加物 (add-on)来完成。此外，RFP(并且特别地DsRed2)标记物对于使蛋白质 聚集最小化而言是最优的，因此标记物能够避免体内蛋白质聚集的问 题，蛋白质聚集会影响产品性能(即种子发育能力和/或产量)以及产生潜在不利的环境影响，这与产品管理的原则是背道而驰的。
在一些实施方案中，步骤12可以包含将RFP标记物与可以插入到 种子或者一组种子中的一种或多种期望的特性DNA序列相结合。例 如，遗传工程化的植物和/或种子可以包含令人感兴趣的有益特性例如 具有杀虫(pesticidal)和/或灭虫(insecticidal)活性的 一种或多种基因表达 的肽，例如价毒性蛋白质(描述在例如US专利No.5277905; 5366892; 5747450; 5723756; 5859336; 5593881; 5625136; 5689052; 5691308; 5188960; 6180774; 6023013; 6218188; 6342660; 6114608;和7030295 中；US公开专利No : US20040199939和US20060085870 ; WO2004086868;和Geiser等人(1986)Ge"e 48: 109)和Cry 34和Cry 35 种类的价晶体蛋白质(参见例如Schnepf等人(200》 ^^/.Em^o".M/cTO&o/. 71: 1765-1774)，和植物杀虫蛋白质(例如VIP1, VIP2或者VIP3种类的成员，参见例如US专利No.5849870; 5877012; 5889174; 5990383; 6107279; 6137033; 6291156; 6429360;以及US 专利申请公开 No :US20050210545 ;US20040133942 和 US20020078473),血凝素(Van Damme等人(1994) /7a"f Mo/.S/o/. 24: 825， pentin(描述在US专利No.5981722中)，脂酶(脂质酰水解酶，参 见例如公开在US专利No.6657046和5743477中的那些)，来自链霉菌 0^M/7fowyce力的胆固醇氧化酶，和源自致病杆菌属(J^wc^/^/Ww)和光 杆状菌属细菌物种，侧孢芽孢杆菌属(5頻'〃ws /a化n^pon^)物种，和球形芽孢杆菌属(5ac/〃ws s/ ^er/cw)物种的杀虫 蛋白质，等等。同样预期的是使用嵌合的(杂合)毒素(参见例如Bosch 等人(1994)所o/rec; "o/ogy 12: 915-918)。
遗传工程化的植物和/或其种子也可以包含具有多种期望特性组合 的一种或多种基因，其包括但不限于期望用于动物伺养的特性例如高 油基因(例如US专利No. 6232529);平衡的氨基酸(例如hordothionins (US专利No.5990389; 5885801; 5885802;和5703049);大麦高赖氨 酸(Williamson等人(1987)五,丄S/oc/zem. 165: 99-106;和WO98/20122) 和高蛋氨酸蛋白质(Pedersen等人(1986) /.C/zem. 261: 6279; Kirihara 等人(1988)Ge"e 71: 359;和Musumura等人(1989)12: 123));提高消化性(例如改性的存储蛋白质(US专利No.6858778);和 硫氧还蛋白(US专利No.7009087))。这样的植物还可以包含产生期望的
17200880021834.3 抗病特性的 一 种或多种基因(例如，伏马菌素脱毒(fumonisin detoxification)基因(US专利No.5792931);无毒和抗病基因(Jones等人 (1994) 266: 789; Martin等人(1993) 262: 1432; Mindri謹
等人(1994) CW/78: 1089)。
遗传改性的植物可以进一步包含一种或多种基因，其将一种或多 种形式的抗除草剂性能编码成例如草甘膦-N-(膦酰基(phosphono)甲基) 氨基乙酸(包括这样的除草剂的异丙胺盐的形式)。示例性抗除草剂基因 包括草甘膦N-乙酰基转移酶(GAT)和5-烯醇丙酮莽草酸酯 (5画enolpyruvylshikimate)-3-磷酸酯合酶(EPSPS)，包括公开在US专利申 请公开No: US20040082770,以及WO02/36782和WO03/092360中的 那些)。抗除草剂基因通常编码成对于除草剂不敏感的改性靶蛋白质或 者编码成在植物中的除草剂起作用之前，对该除草剂进行降解或者解 毒的酶。参见例如，DeBlock等人(1987) ￡M50 6: 2513; DeBlock 等人(1989)尸/a"f P/ywW. 91: 691; Fromm等人(1990)肌orec/mo/ogy 8: 833; Gordon画Kamm等人(1990)尸/""f Ce//2: 603;和Frisch等人(1995) 尸/"W Afo/.S/o/. 27: 405-9。例如，已经4吏用基因编码成变异体耙酶， EPSPS和乙酰乳酸合酶(ALS)而获得了抗草甘膦或者磺酰脲除草剂的 性能。已经通过使用细菌基因编码的草胺膦(Phosphinothricin)乙酰基转 移酶，腈水解酶(nitrilase)或者2,4-二氯苯氧基乙酸酯单氧酶(其解毒各 自的除草剂)而获得了抗草铵膦(glufosinate ammonium),溴苯腈 (Bromoxynil)和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-D)的性能。同样预期的是谷 氨酰胺合酶的抑制剂例如草胺膦(phosphinothricin)或者草铵膦(Basta) (例如bar基因)。
转基因植物和/或种子也可以包含一种或多种基因，该基因产生了 期望用于加工或者加工产品例如下面的产品的特性改性油(例如脂肪 酸去饱和酶基因(US专利No.5952544; 6372965));改性淀粉(例如ADPG 焦磷酸化酶(pyrophosphorylases)(AGPase),淀粉合酶(SS)，淀粉支化酶 (SBE)和淀粉脱支化酶(SDBE));和聚合物或者生物塑料(例如US专利 No.5602321; P-酮碌u解酶，多羟基丁酸酯合酶，和乙酰乙酰基-CoA还 原酶(Schubert等人(1988)/^K^Wo/. 170: 5837-5847))。这样的植物还 可以包含一种或多种提供农艺特性的基因，例如雄性不育性(male sterility)(例如参见US专利No.5583210)，茎杆强度，开花时间，或者
18转变工艺特性例如细胞周期调节或者基因打靶(gene targeting)(例如 W099/61619, US专利No.6518487和6187994)。
在步骤14中，评价大样的种子存在还是不存在RFP标记物。在不 同的实施方案中，该步骤14可以包含视觉确定种子或者一组种子中存 在还是不存在RFP标记物。在一种示例性实施方案中，步骤14包含用 某种能量激励大样的种子，然后确定是否存在RFP标记物。用于照亮 种子的某种能量(和/或激励可以存在于其中的RFP标记物)的波长可以 基本上处于可见光电磁光镨中(即波长范围为基本上大约500nm-基本 上大约580nm)。在一些实施方案中，作为步骤14的一部分所发射的某 种能量可以表现出基本上在大约550nm的峰。在一些实施方案中，步 骤14可以进一步包含才企测至少部分由该激励步骤所形成的发射，其中 该发射的波长范围可以是基本上大约500nm-基本上大约600nm。在一 些实施方案中，步骤14所形成的发射可以表现出基本上在大约580nm 的峰。
不同的评价装置可以用来在步骤14进行测量。例如评价装置可以 包括但不限于市售的光学种子拣选器，例如由Satake-USA所制造的 ScanMaster II种子拣选器。虽然在正常的使用中，种子拣选器可以用 来评价和拣出食品大样中的污染物例如石头，玻璃，土壤，损坏的食 品，模子/霉(mold)和其他外来材料，本发明的一种示例性实施方案改 进了种子拣选器来在大样中评价和拣选表达结合到已经插入种子或者 一组种子中的期望特性DNA序列上的荧光蛋白的种子。
如图8通常所示，这样的光学种子拣选器可以包括专门的显示系 统54，其在一些实施方案中可以包含(l)照明装置54a(例如诸如灯泡)， 其发射所选择的具体频率的电磁能(表征此处所述的"某种能量")来照 亮和由此"激励"RFP标记物，和(2)所用的滤波器54b，其可以用来过滤 RFP标记的种子所发射的能量(即"发射")，以使得显示系统的照相机 54c(或者其他图像传感装置)可以辨别表达RFP标记物的种子。
为了完成这个任务，在本发明的一种方法实施方案中，评价步骤 14可以包含使用至少一种图像传感装置54c来评价种子的RFP标记物 的存在，图像传感装置54c被配置来区分一定范围的正常种子发射和 来自RFP标记物的发射。如此处所述的，这样的图像传感装置54c可 以包含市售的颜色拣选器装置的部件。此外，在一些实施方案中，图像传感装置54c可以包含CCD装置和/或CMOS装置，这些装置被配 置来检测来自RFP标记的转基因和/或另外的遗传改性的种子的发射。
如图8所示，在一些实施方案中，作为评价步骤14的一部分而使 用的评价装置可以进一步包含基本上布置在图像传感装置54c(例如 CCD)和含有感兴趣的遗传因子的种子之间的至少一个滤波器54b。该 至少一个滤波器54b可以配置来使得来自红色荧光蛋白标记物的发射 通过到图像传感装置54c。例如，在一些实施方案中，滤波器54b可以 包含带通滤波器，其配置来使得这样的电磁能通过，该电磁能的波长 基本上等于目标的发射波长(即，由被照亮的和随后激励的RFP标记物 (例如诸如DsRed2)所发射的能量的发射波长)。该发射然后可以用图像 传感装置54c进行检测，该传感装置54c可以进一步配置来将所述的发 射转化成基本上"白色，，的光。因此，图像传感装置可以基于存在还是不 存在RFP标记物，来将每个种子基本上分配成二进制值，其中含有感 兴趣的遗传因子的种子(用相对"明亮的"RFP标记物进行标记)被标记 成"正的"(并由此偏转和/或以其它方式导入一个或多个"+"容器56。不 包含感兴趣的遗传因子的种子，或者其他微粒碎片(其可以被转化为"暗 的，，或者"负的"结果)可以降落和/或以其它方式导入一个或多个"-"容器 58中。如图8所示，图像传感装置54c(或者显示系统54的其他部件) 可以联通到拣选装置55(其可以包含例如阀门装置和/或压缩空气喷气 装置)，该拣选装置55被配置来将"正的"(即含有感兴趣的遗传因子的 种子(图像传感装置54c可以将其检测为"白色"或者"明亮的"种子))导 入一个或多个"+"容器56,以响应从图像传感装置54c或者从显示系统 54的其他处理部件所接收的二进制正的或者"1"信号。拣选装置55还 可以被配置来将"负的"(即不含有感兴趣的遗传因子的种子或者微粒碎 片(图像传感装置54c可以将其检测为"暗的"种子))导入到一个或多个 "-，，容器58,以响应从图像传感装置54c或者从显示系统54的其他处 理部件所接收的二进制负的或者"0"信号。虽然图8所示的系统50被
过i示系^部件54a, 5:b,::，但是应当理解系统50也可以是基本 上水平定向的，并且可以包含一个或多个加压的气动导管和/或传输路 径，其配置来引导样品的单个种子通过不同的显示系统部件54a， 54b, 54c,随后导入拣选装置55中，该拣选装置55可以被配置来将含有感兴趣的遗传因子的种子转移到相应的"+"容器56中，和将不含感兴趣 遗传因子的种子转移到相应的"-"容器58中，以响应从一种或多种显示 系统54部件和/或控制器所接收的信号。
如此处所述，本发明的一些实施方案可以利用多个补充标记物(例 如多种荧光蛋白标记物)来高亮显示大样的种子中相应的多个另外的感 兴趣的遗传因子的存在和/或不存在。例如，如此处所述，本发明不同 的实施方案可以使用补充标记物，该补充标记物可以包括^旦不限于 黄色荧光蛋白；黄色/橙色荧光蛋白；橙色荧光蛋白；橙色/红色荧光蛋 白；红色/橙色荧光蛋白；红色荧光蛋白；青色荧光蛋白；和这样的补 充标记物的组合。通常参考图1，这样的实施方案可以包含步骤12, 该步骤用于将多个补充标记物中的一种或多种与大样的至少一些含有 相应的多个另外的感兴趣的遗传因子的种子相结合。 一些这样的实施 方案可以进一步包含步骤14和随后的步骤16,步骤14用于使用评价 装置来评价大样的至少一个种子存在还是不存在该多个补充标记物， 步骤16用于基于存在还是不存在该多个补充标记物，来拣选含有多个 另外的感兴趣的遗传因子的种子。
在一些这样的实施方案中，评价步骤14可以包含使用至少一种图
像传感装置54来评价种子的至少一种的该多个补充标记物的存在，传 感装置54被配置来区分一定范围的正常种子发射和来自多个补充标记 物中的一种或多种的至少一种发射。如此处所述，在一些实施方案中， 图像传感装置54可以包含CCD装置或者CMOS装置。如图8通常所 示，用于进行评价步骤14的评价装置可以包含专门的显示系统54,其 在一些实施方案中可以包含(l)照明装置54a(例如诸如灯泡)，其发射 所选择的具体频率的电磁能(表征此处所述的"某种能量")来照亮和由 此"激励"RFP标记物，和(2)所用的滤波器54b，其可以用来过滤RFP 标记的种子所发射的能量(即"发射")，以使得显示系统的照相机54c(或 者其他图像传感装置)可以辨别表达RFP标记物的种子。在一些实施方 案中，其中多个补充标记物(例如，其每个可以表现出特有的发射频率) 被用来"标记"种子中可能存在的相应的多个另外的遗传因子，滤波器 54b可以包含基本上布置在图像传感装置54c和含有感兴趣的遗传因子 的种子之间的至少一个可调滤波器。该至少一个可调滤波器54b可以 配置来使得来自多个补充标记物中的一种或多种的至少一种发射选择性的通过到图像传感装置54c。在这样的实施方案中，可调滤波器54c 可以使得评价装置选择性的拣选在种子样品中可能存在的多个不同的 感兴趣的遗传因子。在一种示例性实施方案中，滤波器装置54c可以 包含VariSpecTM液晶可调滤波器(LCTF),其市售自马萨诸塞州Wobum 的CRI， Inc.。在一些这样的实施方案中，在顺序通过评价装置54的 过程中，滤波器54b可以被"调谐"来连续的传感和拣选种子，该传感和 拣选是基于具有一种具体感兴趣遗传因子(其例如对应于多个补充标记 物之一和/或基本的RFP)的种子的"正"发射的。
图2表示了一种示意图，其代表了根据一种示例性实施方案的另 外一种示例性系统50，该系统可用于从大样的种子中区分含有感兴趣 的遗传因子的种子。在该示例性实施方案中，系统50是一种改进的市 售种子拣选器。大样A的种子被装入料斗52中，该种子的至少一些已 经通过将编码荧光蛋白的结合的DNA序列插入到期望的特性DNA序 列中来进行遗传转化。料斗52被配置来将大样A的种子漏到(funnel) 单独的斜道53上，设计该斜道的尺寸大小来适应通过显示系统54进 行加工的具体的体积。来自每个斜道53的种子在重力作用下落下通过 显示系统54。在该示例性实施方案中，显示系统54包含照明装置、至 少一种传感装置、和控制器，该控制器被配置来控制照明和传感装置。
在该示例性的实施方案中，照明装置包含使用灯泡的光源，该光 源被配置来发射照亮RFP标记物的波长光谱的电磁辐射。在其他实施 方案中，该光源可以是任何的光源，其允许图像传感装置辨别RFP标 记物。同样的，在不同的实施方案中，光源和标记物可以成对的，来 提高显示系统辨别标记物存在的能力。该示例性实施方案包括多个带 有滤波器(即，红色带通滤波器)的CCD照相机，该照相机被配置来增 强照明和帮助辨别RFP标记物的存在。虽然其他实施方案可以使用较 少的照相机，但是该示例性实施方案允许种子落下通过显示系统54来 从前后进行观察。在其他实施方案中，可以使用任何的配置来辨别RFP 标记物存在的显示系统54，包括但不限于CCD装置，CMOS装置和其 他显示传感器。
图1的步骤16涉及基于存在还是不存在标记物，来拣选含有感兴 趣的遗传因子的种子。该拣选功能是通过拣选装置来进行的。在图2 所示的示例性实施方案中，拣选装置55包含许多单个的气动喷射器，
22该喷射器发射受控的空气流(例如诸如"气刀")，其被配置来在种子通过
拣选装置时，拣选表现出RFP标记物的种子。将表现出RFP标记物的 种子拣选到容器56中，在所述的图中用"+"符号进行标识。不包含标 记物的种子落入容器58中，在所述的图中用"-"符号进行标识。虽然图 中未示出，但是，在其他实施方案中，包含在"-"容器58中的种子可以 通过料斗52重新发送，以使得这些种子连续的通过系统50。以这样的 方式，任何的鉴别为没有表现出标记物的种子可以在 一 次或多次连续 通过系统50的过程中进行鉴别。
上述方法允许加工大量的种子，该种子的一部分包括了标记物， 该标记物与包括期望特性的遗传转化的种子相结合。但是在其他实施 方案中，大样可以包括不同的种子，该种子具有与不同的期望特性相 结合的不同的标记物，或者包括这样的种子，该种子包括与不同的期 望特性相结合的大于一种的标记物。虽然上述示例性实施方案可以适 应这些情形，但是在其他情形中，有利的是在逐个种子(seed-by-seed) 的基础上来评价种子。结果，在不同的实施方案中，在评价种子的一 种标记物或者一组标记物(该标记物结合有一种期望的特性或者一组特 性)存在还是不存在之前，本发明考虑了从大样中单颗化种子。
图3表示系统100，该系统使用上面的根据本发明一种实施方案的 方法。该图中所示的系统100包括了用于从大样中单颗化种子的单颗 化装置的一种示例性实施方案，该装置包含了与真空源操作相连的多 个伸长的中空结构。具体的，该示例性实施方案的系统100包括了料 斗102,大样A的种子可以放入该料斗中。转鼓104位于料斗102的 邻近。该转鼓104包括多个伸长的中空结构106,该中空结构延伸到转 鼓104的基本上中空的内部，其与真空源(未示出)相连。真空源在转鼓 104的内部产生了一个负压区域，并且作为结果，伸长的中空结构106 的远端产生了离散的负压区域。如该图所示，转鼓104在邻近料斗102 的开口端旋转。料斗102这样来配置，以将种子朝着该开口端推进， 并邻近转鼓104。转鼓104在所示的方向上旋转，以使得伸长的中空 结构106经过邻近该转鼓104的大样A的一部分种子。当该伸长的中 空结构106旋转通过大样A时，位于伸长的中空结构106远端的离散 的负压区吸引了单个的种子101。对每个伸长的中空结构106远端的尺 寸进行这样的配置，以使得每个中空结构106远端的离散负压区吸引单个的种子101。如该图所示，当伸长的中空结构106旋转通过料斗 102的开口端时，单个种子101附着到伸长的中空结构106的远端。当 鼓104在所示的方向上连续的旋转时，种子101朝着传送带IIO移动。 旋转驱动元件112在所示的方向上驱动着传送带110。在不同的实施方 案中，可以调整驱动元件112的速度来优化下游的种子101的评价和 拣选。
在邻近传送带110的位置上，偏转板108(或者备选地，在一些实 施方案中，压缩空气源，被配置来将单个种子与伸长的中空结构106 分开)将种子IOI从伸长的中空结构106远端偏转到传送带110上。在 该示例性实施方案中，偏转板108在伸长的中空结构106远端和它们 所携带的种子101之间接触，以使得该负压区域临时封闭，来从伸长 的中空结构106的远端有效的释放种子101。因此，将种子101沿着传 送带110进行单颗化(singulated)。在不同的实施方案中，转鼓104可以 具有单个的放射状图案的伸长的中空结构106，或者如该图所示，它可 以具有 一 连串放射状图案排列的伸长的中空结构10 6 。
显示系统114和拣选系统115表示在转鼓的下游。如上所述，显 示系统114包含照明装置、至少一种传感装置、和控制器，该控制器 被配置来控制照明和传感装置。在该示例性实施方案中，照明装置包 含使用灯泡的光源，其被配置来发射与照亮荧光蛋白标记物相匹配的 波长光谱的电磁辐射。该示例性实施方案包括多种CCD照相机和滤 波器，其配置来增强照明和帮助辨别标记物的存在。种子101是通过 拣选系统被拣选到"+"容器116和"-"容器118中。在该示例性实施方案 中，使用一连串的机械偏导器和/或阀门(参见例如图8的元件55),基 于标记物存在还是不存在来拣选单颗化的种子的图案。将含有标记物 的种子拣选到"+"容器116中；不包含标记物的种子拣选到"-"容器118 中。虽然图中未示出，但是，在其他实施方案中，包含在"-"容器118 中的种子可以通过料斗102重新发送，以使得这些种子连续的通过系 统100。以这样的方式，任何的鉴别为没有表现出标记物的种子可以在 一个或多个连续通过系统100的过程中进行鉴别。
图4表示了另外一种示例性实施方案的单颗化，评价和拣选系统 200，其使用根椐本发明一种实施方案的方法。在该示例性实施方案中， 振动阶梯化碗202(stepped bowl)被配置来从大样A中单颗化种子，并且使该单颗化的种子201通过排出孔206，该排出孔可以位于例如接近系统200的阶梯化碗202的上部外围之处。例如，在一些实施方案中，该系统可以包括市售的种子计数器(例如Seedburo 801 Count-A-PakTM振动计数器装置，由伊利诺斯州芝加哥的Seedburo Equipment Company生产)。在这样的实施方案中，可以将大样A的种子201装入系统200的阶梯化石宛202中，这样当该阶梯化石宛202振动时，种子201可以沿着轨道204(其界定在阶梯化碗202的台阶上)的外围排成一列纵队，并且朝着排出孔206前进，并且通过出口斜道207排出到传送带210上。如上所述，传送带210是通过旋转驱动元件212来驱动的，其在所示的方向上驱动传送带210。在不同的实施方案中，可以调整驱动元件212的速度来优化下游的种子201的评价和拣选。
显示系统214和拣选系统215表示在石宛202的下游。如上所述，显示系统214包含照明装置、至少一种传感装置、和控制器，该控制器被配置来控制照明和传感装置。在该示例性实施方案中，照明装置包含使用灯泡的光源，其被配置来发射与照亮焚光蛋白标记物相匹配的波长光语的电磁辐射。 一种示例性实施方案包括多种CCD照相机和滤波器，其配置来增强照明和帮助辨别标记物的存在。种子201是通过拣选系统215被拣选到"+"容器216和"-"容器218中。在该示例性实施方案中，基于标记物存在还是不存在，将一连串的机械偏导器用于单颗化的种子201。在该示例性实施方案中，将含有标记物的种子拣选到"+"容器216中，不包含标记物的种子拣选到"-"容器218中。虽然图中未示出，但是，在其他实施方案中，包含在"-"容器218中的种子201可以通过料斗202重新发送，以使得这些种子连续的通过系统200。以这样的方式，任何的鉴别为没有表现出标记物的种子可以在 一 个或多个连续通过系统200的过程中进行鉴别。
图5表示了根据本发明实施方案的另外一种示例性系统300,其用于单颗化，评价和基于存在还是不存在标记物来拣选种子。该示例性实施方案包括料斗302，该料斗接收大样A的种子，并将该种子供给到圆盘304上。在该示例性实施方案中，料斗302包括门303，其基于重力来使得一定量的种子301受控的释放到圆盘304上。圆盘304通过轴杆305操作相连到发动机(未示出)上，来使得圆盘304在所示的方向上进行旋转。圓盘304还包括一系列的沿着圓盘304的外围306分布的种子门308。种子门308被配置来接收单个种子301,该种子301已经在圓盘304旋转引起的离心力作用下，被推向圆盘304的外围306。在该示例性实施方案中，门308是可控的，来使得每个门308可以打开来释放单个种子301。出口斜道307位于邻近圆盘304的外围306之处。在该示例性实施方案中，当门308邻近出口斜道307时，可以对每个门308进行单独控制来打开和释放单个种子301。在接近出口斜道307时，由门308所释放的种子301通过出口斜道307移动，并且存放在传送带310上。如上所述，传送带310是通过旋转驱动元件312来驱动的，其在所示的方向上驱动传送带310。在不同的实施方案中，可以调整驱动元件312的速度来优化下游的种子301的评价和拣选。结果，种子301沿着传送带310单颗化。类似地如上所述，显示系统314和拣选系统315表示在旋转圓盘304的下游，用于基于标记物存在还是不存在来评价和拣选种子301。
图6表示了根据本发明一种示例性实施方案的仍然另外的示例性系统400，其用于单颗化，评价和基于存在还是不存在标记物来拣选种子。在该示例性实施方案中，料斗402被配置来接收大样A的种子。料斗402是可振动的，并且可以包括通向开口 403的向前的斜度(pitch),以使得来自大样A的种子以一个受控的速率离开该开口 403。倾斜装置404位于邻近料斗402的开口 403之处。该倾斜装置包括位于邻近料斗402的开口 403之处的第一端405,和位于高度低于第一端405之处的第二端407。该示例性实施方案的倾斜装置包括至少一个被配置来形成通道的凹槽406，其使得从料斗402出来的种子排列成单行的单个种子401。在该示例性实施方案中，凹槽406是v形的，但是在其他实施方案中，凹槽406可以是任何的其他形状，例如u形，其被配置来使得种子排列成单行的单个种子401。排列在倾斜装置404的凹槽406中的种子401在重力作用下被推向倾斜装置404的第二端407。传送带410位于倾斜装置404的第二端407以下来接收在重力作用下从倾斜装置404的第二端407落下的单个种子401。如上所述，传送带410包括旋转驱动元件412，其在所示的方向上驱动传送带410。在不同的实施方案中，可以调整驱动元件412的速度来优化下游的种子401的评价和拣选。结果，种子401沿着传送带410进行单颗化。类似地，如上所述，虽然未示出，但是显示系统和拣选系统(例如参见图8)位于倾斜装置的下游，用于基于标记物的存在还是不存在来评价和拣选种子。
如此处的示例性实施例所述，带有SatakeScanMaster(g)拣选系统的振动料斗402单颗化装置可以产生相当有效和准确的拣选结果。例如，使用这样的示例性系统，拣选步骤16可以包含以至少大约500个种子/分钟的速度来拣选种子，并且在一些实施方案中，该速度至少是大约750个种子/分钟。
前面仅仅说明了本发明示例性的实施方案如何从大样中区分含有感兴趣的遗传因子的种子。现在参考图7,表示了一种示例性电子装置(例如PC，膝上型电脑，PDA等等)的框图，该电子装置被配置来执行本发明示例性实施方案的方法，该方法用于区分含有感兴趣的遗传因子的种子。电子装置可以包括不同的工具来执行本发明示例性实施方案的一种或多种功能，包括此处更具体表示和描述的那些。但是，应当理解该电子装置可以包括可替代的工具来执行一种或多种同样的功能，而不脱离本发明的主旨和范围。如所示的那样，该电子装置通常可以包括工具，例如处理器，控制器740'等，其连接到存储器742,用于执行或者控制机构的不同功能。
该存储器可以包含易失性和/或非易失性存储器，并且典型的存储内容、数据等等。例如，该存储器典型的是存储这样的内容，该内容传输自和/或接收自所述的电子装置。同样作为例子，该存储器典型的
是存储应用软件，指令等等，用于处理器进行与本发明实施方案的电子装置的操作相关的步骤。具体的，存储器742可以存储用于应用和其他计算机程序的计算机程序代码。例如，在本发明的一种示例性实施方案中，除了别的以外，存储器可以存储计算机程序代码来用于进行下面的工作使用评价装置来评价大样的至少一些的种子存在还是不存在标记物，该标记物与大样的至少一些含有感兴趣的遗传因子的种子相结合，和基于存在还是不存在标记物来拣选含有感兴趣的遗传因子的种子。
除了存储器742之外，处理器740也可以连接到至少一种界面或者其他的用于显示、传输和/或接收数据、内容等的工具上。在这点上，该界面可以包括至少一种通讯界面746或者其他用于传输和/或接收数据、内容等的工具，以及至少一种用户界面，其可以包括显示器748和/或用户输入界面750。该用户输入界面依次可以包含任意的许多使得电子装置能够接收用户数据的装置，例如键盘、触摸屏、游戏杆或者其他输入装置。
如上所述以及如本领域技术人员将理解的那样，本发明的实施方案可以配置成方法和设备。因此，本发明的实施方案可以包含不同的工具，包括整套的硬件、整套的软件或者软件和硬件的任意组合。此外，本发明的实施方案可以采取计算机程序产品的形式，该程序产品
由计算机可读存储介质(例如图16的存储器742)和存储在该存储介质
上的计算机可读程序指令(例如计算机软件)组成。可以使用任何合适的
计算机可读存储介质，包括硬盘，CD-ROM,光学存储装置，或者》兹性存储装置。
已经参考了方法、设备(即系统)和计算机程序产品的框图和流程图，在上面对本发明示例性实施方案进行了描述。应当理解框图和流程图的每个框，以及框图和流程图的框的组合分别可以通过包括计算机程序指令的不同的工具来执行。这些计算机程序指令可以安装到通用计算机、专用计算机或者其他可编程数据处理设备上来产生一种机器，以使得在该计算机或者其他可编程数据处理设备上执行的指令产生用于执行流程图 一个或多个框中所规定的功能的手段。
这些计算机程序指令也可以存储在计算机可读存储器上，其可以命令计算机或者其他可编程数据处理设备以具体的方式来工作，以使得存储在该计算机可读存储器中的指令产生一种包括计算机可读指令的制品，用于执行流程图一个或多个框中所规定的功能。计算机程序指令也可以安装到计算机或者其他可编程数据处理设备上，来产生在该计算机或者其他可编程设备上执行的 一 系列操作步骤，来产生计算机执行的方法，目的是使得在该计算机或者其他可编程设备上执行的指令提供用于执行流程图 一个或多个框中所规定的功能的步骤。
因此，框图和流程图的框支持了用于执行所规定功能的工具的组合，用于执行所规定的功能和执行所规定功能的程序指令手段的步骤的组合。还应当理解框图和流程图的每个框，以及框图和流程图的框的组合，可以通过专用的硬件基计算机系统(该计算机系统执行了所规定的功能或者步骤)或者专用硬件和计算机指令的组合来执行。
下面的试验实施例仅仅是出于举例的目的来提供的，并非出于限制的目的。
28试验实施例
介智
生产荧光蛋白(FP)标记的种子，来用于不稔性(sterility)系统中和用于评价 一 种或多种所插入的基因对于产量的影响。将隔离的(segregating)种子群分离成含有感兴趣的遗传因子的那些(+)和不含有感兴趣的遗传因子的那些(-)是一个艰苦费力的过程。
启动了一个工程来开发一种自动拣选程序，其能够使用类似于图6所示的振动供料机来有效的分离FP+种子和FP-种子。
絲
与Satake ScanMaster 系统一起对振动供料机(例如参见图6)进行评价，来评定在本发明一些实施方案中的拣选速度和准确度。已知的是人工需要花费大约30分钟来拣选3500个麦粒。用于单颗化的装备有振动供料机(例如参见图6)的FP-辨别性ScanMaster⑧(例如参见图8)表现出能够在大约2-3分钟内拣选相同的样品。因此，本发明实施方案的该基本上自动的方法将拣选时间降低了大约90%。不幸的是，该ScanMaster⑧颜色拣选器在单次过程中仅仅能够从50: 50混合物中除去90-95%的FP种子。在这个方法中，显著数目的FP-种子与FP+种子一起混入到应当纯净的FP+样品中。这种性能水平因此表明在某些方法实施方案中可能需要一些手工拣选来实现期望的纯度水平。
例如，如果典型的生产试验样品包含4000个麦粒(50。/()FP-和50%FP+),则需要大约40分钟来拣选该FP种子。这是一种50个种子/分钟的拣选速率。如果使用本发明的基本上自动的实施方案来拣选同样的样品，则需要小于30秒来产生95%纯度的FP+种子样品。对于2000个麦粒FP+样品而言，这里将有大约100个FP-麦粒需要手工除去。如果该手工拣选速率是50种子/分钟，则达到近乎100%纯度的FP+种子样品的实际时间将是大约2分钟。此外，如果一种样品手工拣选，而另一种使用FP拣选器进行拣选，则该样品的实际拣选时间将是大约2分钟。这产生了分离FP+种子和FP-种子所需时间的15倍的降低。
如果使用自动的再拣选功能(即通过该拣选程序将样品重新分发返回，来用于一个或多个另外的过程)，则从初始样品中回收99%的FP+种子是可能的，而不必手工再拣选该FP-部分。这样的再拣选方法将500g的种子样品的循环时间延长了 15秒。假定将花费2分钟来拣选
29FP+部分，它可以有利的例行再拣选样品，特别是小的样品，来尽可能多的回收FP+种子。
如上所述，焚光蛋白的表达沿着种子的表面区域可以是非均匀的。结果，本发明还提供了 一种从大样中区分含有标记物(该标记物与感兴趣遗传因子相结合)的种子的方法，该方法使用电磁能发射装置(其配置来激励该种子的大部分表面区域)和/或使用评价装置(其配置来接收来
自该种子大部分表面区域的发射)。图9表示了根据本发明一种实施方
案的系统的非限定性示意图，该系统带有真空鼓单颗化装置，电磁能
发射装置和评价装置。具体的，图9表示了系统500，其包括了单颗化装置的一种示例性实施方案，该装置包含了与真空源操作相连的多个伸长的中空结构，用来从大样中单颗化种子。具体的，该示例性实施方案的系统500包括了料斗502,大样A的种子可以放入该料斗中。转鼓504位于料斗502的邻近。该转鼓504包括多个伸长的中空结构506,该中空结构延伸到转鼓504的基本上中空的内部，其与真空源(未示出)相连。真空源在转鼓504的内部产生了负压区域，并且作为结果，伸长的中空结构506的远端产生了离散的负压区域。如该图所示，转鼓504在邻近料斗502的开口端旋转。料斗502这样来配置，以将种子朝着该开口端推进，并邻近转鼓504。转鼓504在所示的方向上旋转，以使得伸长的中空结构506经过邻近该转鼓504的大样A的一部分种子。
当该伸长的中空结构506旋转通过大样A时，位于伸长的中空结构506远端的离散的负压区吸引了单个的种子501。对每个伸长的中空结构506远端的尺寸进行这样的配置，以使得每个中空结构506远端的离散负压区吸引单个的种子501。如该图所示，当伸长的中空结构506旋转通过料斗502的开口端时，单个种子501附着到伸长的中空结构506的远端。当鼓504在所示的方向上连续的旋转时，偏转板508(或者备选地，在一些实施方案中，压缩空气源被配置来将单个种子与伸长的中空结构506分开)将种子501从伸长的中空结构506远端偏转到传送带510上。在该示例性实施方案中，偏转板508在伸长的中空结构506远端和它们所携带的种子501之间接触，以使得该负压区域临时封闭，来从伸长的中空结构506的远端有效的释放种子501。
如图9通常所示，系统500还可以包括专门的显示系统554，其在一些实施方案中可以包含(l)电磁能发射装置，例如照明装置554a， 其发射所选择的具体频率的电磁能来照亮和由此"激励"标记物，和(2) 评价装置，例如图像传感装置554c，其可以识别表达标记物的种子。 在不同的实施方案中，本发明可以包括电磁能量发射装置(其配置来激 励该种子的大部分表面区域)和/或评价装置(其配置来接收来自该种子 大部分表面区域的发射)。在所述的实施方案中，系统500包括一对照 明装置554c,其配置来共同的激励种子的大部分表面区域。以这种方 式，图像传感装置554c可以评价种子的大部分表面区域，来确定存在 还是不存在标记物。
在所述的实施方案中，图像传感装置554c可以进一步配置来将该 发射转换成基本上"白色"的光。因此，该图像传感装置可以基于存在还 是不存在标记物，来将每个种子基本上分配成二进制值，其中含有感 兴趣的遗传因子的种子(用相对"明亮的"标记物进行标记)被标记成"正 的"(并由此偏转和/或以其它方式导入一个或多个"+"容器556。不包含 感兴趣的遗传因子的种子，或者其他微粒碎片(其可以被转化为"暗的" 或者"负的"结果)可以降落和/或以其它方式导入 一 个或多个"-"容器 558中。如图9所示，图像传感装置554c(或者显示系统554的其他部 件可以与偏转板508保持联通，其也可以包括导板565，该导板可以旋 转来将"正的"(即含有感兴趣的遗传因子的种子(图像传感装置554c可 以将其检测为"白色"或者"明亮的"种子))导入一个或多个"+"容器 556,以响应从图像传感装置554c或者从显示系统554的其他处理部 件所接收的二进制正的或者"1"信号。导板565还可以被配置来将"负
554c可二将其ii为"暗的"种子))导入到-一个或多个"-"容器558^以响 应从图像传感装置554c或者从显示系统554的其他处理部件所接收的 二进制负的或者"O"信号。
许多不同的构造可以用于从大样中区分含有标记物的种子，该标 记物与感兴趣的遗传因子相结合，其使用电磁能发射装置(其配置来激 励该种子的大部分表面区域)和/或使用评价装置(其配置来接收来自该 种子大部分表面区域的发射)。另外一种非限定性的例子通常表示在图 10中，其描述了一种拣选系统600,该系统包^r专门的显示系统654, 其在一些实施方案中可以包含(l)电磁能发射装置，例如照明装置654a,其发射所选择的具体频率的电磁能来照亮和由此"激励"标记物，
和(2)评价装置，例如图像传感装置654c,其可以辨别表达标记物的种
子。在所述的实施方案中，系统600包括一对照明装置654a(其配置来
共同的激励种子的大部分表面区域)和一对图像传感装置654c(其配置 来共同的接收来自种子大部分表面区域的发射)。以这种方式，图像传
感装置654c可以评价种子的大部分表面区域，来确定存在还是不存在 标记物。
类似于上面所述，图10的评价装置654c(或者显示系统654的其 他部件)可以联通到拣选装置655(其可以包含例如阀门装置和/或压缩 空气喷气装置)，该拣选装置655被配置来将"正的"(即含有感兴趣的遗 传因子的种子(图像传感装置654c可以将其检测为"白色"或者"明亮的" 种子))导入一个或多个"+，，容器656,以响应从图像传感装置654c或者 从显示系统654的其他处理部件所接收的二进制正的或者"1"信号。 拣选装置655还可以被配置来将"负的"(即不含有感兴趣的遗传因子的 种子或者微粒碎片(图像传感装置654c可以将其检测为"暗的"种子))导 入到一个或多个"-，，容器658,以响应从图像传感装置654c或者从显示 系统654的其他处理部件所接收的二进制负的或者"0"信号。
在前述的说明书和相关的附图提出的教导的帮助下，本发明所属 领域的技术人员容易想到此处所阐明的本发明的许多的改进和其他实 施方案。所以，应当理解本发明不限于所公开的具体的实施方案，并 且所述的改进和其他实施方案目的是包括在附加的权利要求的范围 内。虽然此处使用了具体的术语，但是它们是通用的和仅仅说明性含 义的，目的并非用于限制。
权利要求
1.一种从大样中区分含有感兴趣的遗传因子的种子的方法，该方法包含将红色荧光蛋白标记物与大样的至少一些含有感兴趣的遗传因子的种子相结合；使用评价装置来评价该大样的至少一些种子存在还是不存在该红色荧光蛋白标记物；和基于存在还是不存在该红色荧光蛋白标记物来拣选含有感兴趣的遗传因子的种子。
2. 根据权利要求1的方法，其进一步包含将多个补充标记物与大样的至少一些含有相应的多个另外的感兴趣的遗传因子的种子相结合；使用评价装置来评价该大样的至少 一个种子存在还是不存在该多个补充标记物；和基于存在还是不存在多个补充标记物来拣选含有多个另外的感兴趣的遗传因子的种子。
3. 根据权利要求2的方法，其中该多个补充标记物选自黄色荧光蛋白；黄色/橙色荧光蛋白；橙色荧光蛋白；橙色/红色荧光蛋白；红色化皇色荧光蛋白；红色荧光蛋白；青色荧光蛋白；及其组合。
4. 根据权利要求1的方法个种子/分钟的速度来拣选种子。
5. 根据权利要求1的方法个种子/分钟的速度来拣选种子。
6. 根据权利要求1的方法，其中当用波长为基本上大约500nm-基本上大约580nm的某种能量进行激励时，该红色荧光蛋白标记物是可辨别的，该某种能量具有基本上在大约550nm的峰。
7. 根据权利要求1的方法，其中所述的评价步骤包含其中该拣选步骤包含以至少大约500其中该拣选步骤包含以至少大约750用某种能量来激励该含有感兴趣的遗传因子的种子；和检领'j至少部分由该激励步骤所形成的发射，该发射的波长范围是基本上大约500mn-基本上大约600nm,该发射具有基本上在大约580nm的峰。
8. 根据权利要求1的方法，其中该评价装置包含种子颜色拣选器。
9. 根据权利要求1的方法，其中所述的评价步骤包含使用至少一种图像传感装置来评价种子的标记物的存在，该至少 一种图像传感装置被配置来区分一定范围的正常种子发射和红色焚光蛋白标记物的发射。
10. 根据权利要求2的方法，其中所述的评价步骤包含使用至少一种图像传感装置来评价种子的标记物的存在，该至少一种图像传感装置被配置来区分一定范围的正常种子发射和来自该多个补充标记物中的一种或多种的至少一种发射。
11. 根据权利要求9的方法，其中该图像传感装置是CCD装置或者CMOS装置。
12. 根据权利要求9的方法，其中该评价装置进一步包含基本上布置在图像传感装置和含有感兴趣的遗传因子的种子之间的至少一个滤波器，该至少 一 个滤波器被配置来使得来自红色荧光蛋白标记物的发射通过到图像传感装置。
13. 根据权利要求10的方法，其中该评价装置进一步包含基本上布置在图像传感装置和含有感兴趣的遗传因子的种子之间的至少一个可调滤波器，该至少 一个可调滤波器被配置来使得至少一种来自该多个补充标记物中的一种或多种的发射选择性的通过到图像传感装置。
14. 根据权利要求1的方法，其中拣选步骤包含将所拣选的单个种子分发到至少一个容器中，该容器仅仅包括存在红色荧光蛋白标记物的种子或者仅仅包括其中不存在红色荧光蛋白标记物的种子。
15. 根据权利要求1的方法，其进一步包含使用单颗化装置从大样中单颗化单个种子。
16. 根据权利要求15的方法，其中该单颗化步骤包含使用多个与真空源操作相连的伸长的中空结构来单颗化单个种子。
17. 根据权利要求15的方法，其中该单颗化步骤包含在料斗中接收该大样，并且振动该料斗，来沿着倾斜的螺旋形斜坡推进单个种子，并且通过被配置成允许一次通过一个种子的间隙。
18. 根据权利要求15的方法，其中该单颗化步骤包含在料斗中接收该大样；将种子从料斗供给到可旋转盘；和旋转该可旋转盘，目的是通过施加离心力来将种子分布到该可i走转盘的外围。
19. 根据权利要求15的方法，其中该单颗化步骤包含在料斗中接收该大样；振动该大样，以使得种子倾向于朝着料斗的开口移动；从该料斗开口将种子分配到包含至少一个凹槽的倾斜装置，来在该凹槽中形成成行的单个种子；和通过重力将单个种子从该倾斜装置存放到传输装置上。
20. —种计算机程序产品，其用于区分大样的含有感兴趣的遗传因子的种子，该种子具有与至少一些该含有感兴趣的遗传因子的种子相结合的红色焚光蛋白标记物，所述的计算机程序产品包含计算机可读存储介质，该介质具有存储于其中的计算机可读程序代码指令，该指令包含第一组指令，其用于使用评价装置来评价大样的至少一些种子存在还是不存在红色荧光蛋白标记物；和第二组指令，其用于基于存在还是不存在红色荧光蛋白标记物来拣选含有感兴趣的遗传因子的种子。
21. 根据权利要求20的计算机程序产品，其中该大样的至少一部分种子包含了多个另外的感兴趣的遗传因子，该遗传因子与相应的多个补充标记物相结合，该计算机程序产品进一步包含第三组指令，用于使用评价装置来评价大样的至少一个种子存在还是不存在多个补充标记物；和第四组指令，用于基于存在还是不存在多个补充标记物来拣选含有多个另外的感兴趣的遗传因子的种子。
22. 根据权利要求21的计算机程序产品，其中该多个补充标记物选自黄色荧光蛋白；黄色/橙色荧光蛋白；橙色荧光蛋白；橙色/红色焚光蛋白；红色/橙色荧光蛋白；红色荧光蛋白；青色荧光蛋白；及其组合。
23. 根据权利要求20的方法，其中用于拣选的第二组计算机指令包含以至少大约500个种子/分钟的速度来拣选种子。
24. 根据权利要求20的计算机程序产品，其中用于拣选的第二组计算机指令包含以至少大约750个种子/分钟的速度来拣选种子。
25. 根据权利要求20的计算机程序产品，其中当用波长为基本上大约500nm-基本上大约580nm的某种能量进行激励时，该红色荧光蛋白标记物是可辨别的，该某种能量具有基本上在大约550nm的峰。
26. 根据权利要求25的计算机程序产品，其中所述的第一组指令包含用某种能量来激励该含有感兴趣的遗传因子的种子；和检测至少部分由该激励步骤所形成的发射，该发射的波长范围是基本上大约500nm-基本上大约600nm,该某种能量具有基本上在大约580nm的峰。
27. 根据权利要求20的计算机程序产品，其中评价装置包含种子颜色拣选器。
28. 根据权利要求20的计算机程序产品，其中所述的第一組指令包含使用至少 一种图像传感装置来评价种子的标记物的存在，该至少一种图像传感装置被配置来区分一定范围的正常种子发射和红色荧光蛋白标记物的发射。
29. 根据权利要求21的计算机程序产品，其中所述的第三组指令包含使用至少一种图像传感装置来评价种子的标记物的存在，该至少一种图像传感装置被配置来区分一定范围的正常种子发射和来自该多个补充标记物中的一种或多种的至少 一种发射。
30. 根据权利要求28的计算机程序产品，其中该图像传感装置是CCD装置或者CMOS装置。
31. 根据权利要求28的计算机程序产品，其中该评价装置进一步包含基本上布置在图像传感装置和含有感兴趣的遗传因子的种子之间的至少一个滤波器，该至少一个滤波器被配置来使得来自红色荧光蛋白标记物的发射通过到图像传感装置。
32. 根据权利要求29的计算机程序产品，其中该评价装置进一步包含基本上布置在图像传感装置和含有感兴趣的遗传因子的种子之间的至少一个可调滤波器，该至少一个可调滤波器被配置来使得至少一种来自该多个补充标记物中的 一种或多种的发射选择性的通过到图像传感装置。
33. 根据权利要求20的计算机程序产品，其中所述的第二组指令包含将所拣选的单个种子分发到至少一个容器中，该容器仅仅包括存在红色荧光蛋白标记物的种子或者仅仅包括其中不存在红色荧光蛋白标记物的种子。
34. 根据权利要求20的计算机程序产品，其进一步包含用于控制单颗化装置的第五组指令，该单颗化装置被配置来用于从大样中单颗化单个种子。
35. 根据权利要求34的计算机程序产品，其中所述的第五组指令包含这样的一组指令，该指令使用多个与真空源操作相连的伸长的中空结构来单颗化单个种子。
36. 根据权利要求34的计算机程序产品，其中所述的第五组指令包含这样一组指令，该指令用于在料斗中接收该大样，并且振动该料斗，来沿着倾斜的螺旋形斜坡推进单个种子，并且通过被配置成允许一次通过一个种子的间隙。
37. 根据权利要求34的计算机程序产品，其中所述的第五组指令包含一组指令，其用于在料斗中接收该大样，将种子从料斗供给到可旋转盘，和旋转该可旋转盘，目的是通过施加离心力来将种子分布到该可旋转盘的外围。
38. 根据权利要求34的计算机程序产品，其中所述的第五组指令包含一组指令，其用于在料斗中接收该大样，振动该大样，以使得种子倾向于朝着料斗的开口移动，从该料斗开口将种子分配到包含至少一个凹槽的倾斜装置，来在该凹槽中形成成行的单个种子，和通过重力将单个种子从该倾斜装置存放到传输装置上。
39. —种区分大样中的含有感兴趣的遗传因子的种子的方法，该方法包含将标记物与大样的至少一些含有感兴趣的遗传因子的种子相结合；使用电磁能发射装置来激励该种子；使用评价装置来评价大样的至少一些种子存在还是不存在标记物^ 和基于存在还是不存在该标记物来拣选含有感兴趣的遗传因子的种子，其中该电磁能发射装置被配置来激励种子的大部分表面区域。
40. 根据权利要求39的方法，其中使用电磁能发射装置来激励种子包含使用至少 一种照明装置来激励种子，该照明装置被配置来照亮种子的大部分表面区域。
41. 根据权利要求40的方法，其中使用至少 一种照明装置来激励种子进一步包含使用两种或者多种排列的照明装置来共同的照亮种子的大部分表面区域。
42. 根据权利要求39的方法，其中评价大样的至少一些种子包含使用至少一种图像传感装置来评价大样的至少一些种子，该至少一种图像传感装置被配置来接收来自种子大部分表面区域的发射。
43. 根据权利要求42的方法，其中评价大样的至少一些种子进一步包含使用两种或者多种排列的图像传感装置来共同的接收来自种子的大部分表面区域的发射。
44. 根据权利要求39的方法，其进一步包含将一种或多个补充标记物与大样的至少一些含有相应的多个另外的感兴趣的遗传因子的种子相结合；使用评价装置来评价该大样的至少一个种子存在还是不存在补充标记物；和基于存在还是不存在补充标记物来拣选含有多个另外的感兴趣的遗传因子的种子。
45. 根据权利要求44的方法，其中该标记物和补充标记物选自绿色荧光蛋白；绿色/黄色荧光蛋白；黄色荧光蛋白；黄色/橙色荧光蛋白；橙色荧光蛋白；橙色/红色荧光蛋白；红色/橙色荧光蛋白；红色荧光蛋白；青色荧光蛋白；及其组合。
全文摘要
一种方法和计算机程序产品，其用于从大样中区分和拣选含有感兴趣的遗传因子的种子。在不同的实施方案中，本发明包含将标记物与该大样的至少一些含有感兴趣遗传因子的种子相结合，使用电磁能发射装置来激励该种子，使用评价装置来评价大样的至少一些种子存在还是不存在所述的标记物，该评价装置被配置成激励种子的大部分表面区域，和基于标记物存在还是不存在来拣选含有感兴趣遗传因子的种子。在其他实施方案中，该方法和计算机程序产品可以包含将红色荧光蛋白标记物与该大样的至少一些含有感兴趣遗传因子的种子相结合，使用评价装置来评价大样的至少一些种子的红色荧光蛋白标记物的存在，和基于红色荧光蛋白标记物的存在来拣选含有感兴趣遗传因子的种子。
文档编号G01N21/64GK101688843SQ200880021834
公开日2010年3月31日 申请日期2008年4月23日 优先权日2007年4月24日
发明者J·L·亨特, S·J·科拉克 申请人:先锋高级育种国际公司