鉴别离子通道调节剂的方法

专利名称：鉴别离子通道调节剂的方法
鉴别离子通道调节剂的方法优先权本申请要求2007年7月11日提交的U. S.系列号60/949，142的权益，其全部内容结合到本文中作为参考。
背景技术：
在制药和生物技术工业中，特别是在心、肺和胃肠道健康领域中，离子通道构成其中最大的一类治疗靶标。涉及调节离子流入和流出细胞的蛋白质的治疗靶标对患者健康具 有引人注目的作用。检测化合物调节离子通道靶标的能力可以是困难和费时的。膜片箝测 定法是一种对离子通道调节剂的生物作用非常敏感的测定法。然而，膜片箝测定法复杂且 对试验化合物的处理量低。其它测定离子通道活性的方法需要在细胞上重组表达离子通道或部分离子通道 和/或使用荧光或放射性标记物。当这些方法有用时，所述方法限定于使用仅靶向小部分 通道功能的药物。此外，重组离子通道作用不可能与其在天然细胞中的作用一致。本发明方法可允许亲代(非重组)细胞系的有效高处理量、无标记物筛选，而对可 能用作药物的试验化合物具有特异性应答的细胞无需处理。发明概述在一实施方案中，本发明提供一种鉴别离子通道拮抗剂或激动剂的方法。该方法 包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点和第二位点上，然后将试 验试剂施加到第一位点上。将一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位点 上。测定第一位点的比色共振反射光学第一峰的波长值(PWV)和测定第二位点的第二PWV。 如果第一和第二 PWVs相同或类似，则试验试剂为离子通道的拮抗剂或激动剂。如果第一和 第二 PWVs不同，则试验试剂不是拮抗剂或激动剂。在将细胞施加到第一位点之后、在将试 验试剂施加到第一位点之后、将细胞施加到第二位点之后、将已知的离子通道拮抗剂或激 动剂施加到第二位点之后，或其组合之后，将细胞培养一段时间。PWV采用带有约2微米-约 200微米下限像素大小透镜的扫描仪测定。比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位 点和第二位点可以是一种容器的内表面，该容器选自微量滴定孔(microtiter well)、微量 滴定板、试管、陪替氏培养皿、微流槽(microfluidic channel)和微阵列(microarray)。所 述细胞、试验试剂和离子通道拮抗剂或激动剂可不包含检测标记物。该方法可在约25、30 或37摄氏度的温度下进行。本发明的另一实施方案提供一种鉴别离子通道调节剂的方法。该方法包括将细胞 施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点，并将试验试剂和已知的细胞离子通 道拮抗剂或激动剂施加到第一位点上。测定第一位点的第一PWV。将细胞施加到比色共振 反射光学生物传感器表面的第二位点，并将一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加 到第二位点上。测定第二位点的第二 PWV。如果第一和第二 PWVs不相同，则试验试剂为离 子通道的调节剂。如果第一和第二 PWVs相同或类似，则试验试剂不是离子通道的调节剂。 在将细胞施加到第一位点之后、在将试验试剂施加到第一位点之后、将细胞施加到第二位 点之后、将已知的离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位点之后，或其组合之后，将细胞培养一段时间。PWV采用带有约2微米-约200微米下限像素大小透镜的扫描仪测定。比色 共振反射光学生物传感器表面上的第一位点和第二位点可以是一种容器的内表面，该容器 选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、陪替氏培养皿、微流槽和微阵列。所述细胞、试验试剂 和离子通道拮抗剂或激动剂可不包含检测标记物。该方法可在约25、30或37摄氏度的温 度下进行。 本发明另一实施方案提供一种鉴别离子通道调节剂的方法。该方法包括将细胞施 加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点，并测定第一位点的第一 PWV。将试验试 剂施加到第一位点上。测定第一位点的第二 PWV。测定第一个值，其中第一个值是第一 PWV 和第二 PWV之间的差值。将第一个值与对照试验相比较，其中对照试验包括将细胞施加到 比色共振反射光学生物传感器表面的第二位点，并测定第二位点的第三PWV。将一种已知的 细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位点上。测定第二位点的第四PWV。测定第二个 值，其中第二个值是第二位点的第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一和第二个值相 同或类似，则试验试剂是离子通道的调节剂。如果第一和第二个值不相同，则试验试剂不是 离子通道的调节剂。本发明的又一实施方案提供一种鉴别离子通道调节剂的方法。该方法包括将细 胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点，然后将试验试剂施加到第一位点 上。测定第一位点的第一PWV。将一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第一位 点上。测定第一位点的第二 PWV。测定第一个值，其中第一个值是第一PWV和第二 PWV之间 的差值。将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第二位点，并测定第二位点的 第三PWV。将一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位点上。测定第二位点 的第四PWV。测定第二个值，其中第二个值是第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一和 第二个值不相同，则试验试剂是离子通道的调节剂。如果第一和第二个值相同或类似，则试 验试剂不是离子通道的调节剂。本发明的还一实施方案提供一种确证试验试剂为离子通道调节剂的方法。该方法 包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点，然后测定第一位点的第 一 PWV。将一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂和试验试剂施加到第一位点上。测定 第一位点的第二 PWV。测定第一个值，其中第一个值是第一 PWV和第二 PWV之间的差值。将 细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第二位点，并测定第二位点的第三PWVt^f 一种已知的细胞离子通道激动剂或拮抗剂施加到第二位点上，并测定第二位点的第四PWV。 测定第二个值，其中第二个值是第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一和第二个值不 相同，则确证试验试剂是离子通道的调节剂。如果第一和第二个值相同或类似，则试验试剂 不是离子通道的调节剂。本发明的再一实施方案提供一种确证试验试剂为离子通道调节剂的方法。该方法 包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点，并将一种已知的细胞离 子通道激动剂或拮抗剂和试验试剂施加到第一位点上。测定第一位点的第一 PWV。将细胞 施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第二位点，并将一种已知的细胞离子通道激动 剂或拮抗剂施加到第二位点上。测定第二位点的第二 PWV。如果第一和第二 PWVs不同，则 确证试验试剂为离子通道的调节剂。因此，本发明提供不使用重组细胞系过度表达离子通道蛋白或不使用检测标记物鉴别和证实离子通道调节剂的方法。发明详述
现已知数种类型的离子通道，包括例如电压门控钠通道、电压门控钙通道、钾通道 (如内向整流型钾通道、钙激活型钾通道、电压门控钾通道和双孔结构域钾通道)、瞬时受 体电位通道、精液阳离子通道、环核苷酸门控通道(如环核苷酸门控通道和超极化激活环 核苷酸门控通道)、双孔通道、配体门控通道和光门控通道。某些化学物和遗传疾病干扰正常离子通道功能并引起疾病和病症。可破坏离子 通道功能的化学物包括例如利多卡因、普鲁卡因、dedrotoxin、芋螺毒素、蛤蛘毒素、河豚毒 素。由离子通道亚单位突变或调解它们的蛋白质引起的遗传病包括例如儿童交替性偏瘫、 Bartter综合征、Brugada综合征、先天性高胰岛素血症、囊性纤维病、间歇性(印isodic)共 济失调、红斑性肢痛病、伴有发热性癫痫发作的全身性癫痫、高血钾(hyperkalemic)周期 性麻痹、低血钾(hypokalemic)周期性麻痹、长期QT综合征、恶性高热、偏头痛、重症肌无 力、先天性肌强直、神经性肌强直、非同源性(nonsyndromic)耳聋、先天性肌强直病、周期 性麻痹、色素性视网膜炎、罗马诺-沃德(Romano-Ward)综合征、短期QT综合征和Timothy 综合征。因此，研究者非常关注于可调节离子通道的药物的发现。本发明的一实施方案使用比色共振反射生物传感器且不需要结合放射性、比色 性或荧光性标记物，直接测定对离子通道调节剂实时出现时响应的细胞变化。当用试验 试剂、激动剂和拮抗剂探测细胞时，可检测细胞中的变化。然后使用高速设备，如BIND Scanner (例如比色共振反射生物传感器系统)和对应的定量数据算法，可实时测定细胞 变化。参见例如美国专利号6，951，715和美国专利公布号2004/0151626。通过结合这种方 法学、仪器操作和计算机分析，可以以无标记物方式实时方便地监测细胞变化。生物传感器本发明的生物传感器可以是比色共振反射生物传感器。参见例如Cunningham 等，“作为一种直接生物化学检测技术的比色共振反射法(Colorimetric resonant reflection as a direct biochemical assaytechnique)，，^专胃 1 禾口-Ml^II (Sensors and Actuators)B，第 81 卷，p. 316-328，Jan 52002 ；美国专利公布号 2004/0091397。比色共振 生物传感器不是表面等离子共振技术(SPR)生物传感器。SI^R生物传感器具有一薄的金属 层，如银、金、铜、铝、钠和铟。该金属必须具有传导带电子，其能够在适合的波长处使光共 振。暴露于光的SI3R生物传感器表面必须是纯金属。氧化物、硫化物和其它膜干扰SPR。比 色共振生物传感器不具有金属层，而是它们具有一高折光率材料的电解涂层，如Ti02。光栅基波导生物传感器在例如美国专利No. 5，738，825中有描述。光栅基波导生 物传感器包括波导膜和衍射光栅，其将一种入射光区导入波导膜中而产生一种衍射光区。 检测波导膜的有效折光指数的变化。其中必须将光波传送到该仪器内有效距离的仪器，如 光栅基波导生物传感器，缺乏本发明的空间分辨率。比色共振反射生物传感器在不使用荧光标记物、比色指示物或任何其它类型的检 测标记物或检测指示物的情况下，通过生物化学相互作用在生物传感器的表面上测定。生 物传感器表面包含一种光学结构，将其设计成当用校准和/或白光照射时，仅反射窄谱带 波长(“共振光栅效应”)。将该窄波长谱带描述为波长“峰”。当将例如生物材料等材料沉 积于所述生物传感器表面或从中移出时，“峰波长值”(PWV)变化。使用读数器照明带有校准和/或白光的生物传感器表面上的不同位点，并收集反射光。将收集的光聚集到波长分光计内以检测PWV。通过将所述结构(生物传感器上侧)结合到一种无底微量滴定板筒的底部，可将 生物传感器结合于标准一次性使用的实验室元件内，如微量滴定板内。生物传感器结合到 通常实验室格式药筒内符合现有的微量滴定板处理装置(如混合器、培养箱和液体分配 器)的相容性。还可将比色共振反射生物传感器结合到例如微流性、巨流性或微阵列设备 内(参见例如美国专利号7，033，819、美国专利号7，033，821)。可用本领域熟知的方法使用 比色共振反射生物传感器(参见例如分子生物学方法(Methods of Molecular Biology)， 由 Jun-Lin Guan 编辑，Vol. 294，Humana Press, Totowa, New Jersey)以监测细胞行为变化 或对暴露于一或多种细胞外试剂缺乏的这些变化。比色共振反射生物传感器包括次波长(subwavelength)结构性的表面(SWS)，并 是一种非传统类型的衍射视轴，其能模拟薄膜涂层的作用(Peng&Morris，“二维光栅中的 共振散身寸(Resonant scattering fromtwo-dimensional gratings) " J. Opt. Soc. Am. A, Vol. 13，No. 5，p. 993，May 1996 ；Magnusson, &Wang，“滤光器的新原理(New principle foroptical filters) Appl. Phys. Lett. ,61, No. 9, p. 1022，8 月，1992 ；Peng&Morris，“二 维光栅衍射中共振异常的实验论证(Experimentaldemonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensionalgratings)，，，Optics Letters, Vol. 21, No. 8, p. 549，4月，1996)。SWS结构包含一维、二维或三维光栅，其中与入射光波长相比，光栅周期 小，使得除反射和透射零阶外，无衍射级允许扩散。不支持侧向引导型模式的传播。而且， 该传导型模式的共振效应出现在任何光子进入该生物传感器结构点的大约3微米的高度 集中区域内。比色共振反射生物传感器的反射和透射光可通过将分子(例如特异性结合的物 质或结合配体或两者)加入到生物传感器的上表面上而进行调节。所加入的分子增加入射 辐射通过所述结构的光路长度，并由此改变将发生最大反射或透射之处的波长。在一实施方案中，当用白光和/或平行光照射时，将比色共振反射生物传感器设 计为反射单一波长或窄谱带波长(“共振光栅效应”)。光可从顶部或底部照射生物传感器。 当将物质放置在生物传感器的表面上时，反射波长由于显示在生物传感器上的光的光径变 化而位移。检测系统由例如光源和分光计组成，光源通过例如一种光纤探针照射正入射的小 斑点，分光计通过例如也在正入射处的第二个光纤探针收集反射光。由于在激发/检测系 统和生物传感器表面之间未出现物理性接触，因此不需要特殊的偶联棱镜，并且可很容易 地调节生物传感器以适于任何常规使用的测试平台，包括例如微量滴定板。单一的分光计 读数可在数毫秒内进行，因此可能快速测量平行发生在生物传感器表面上的大量的分子相 互作用，并实时监测反应动力学。比色共振反射生物传感器包括例如由高折光率材料组成的光栅、支持光栅的基层 和任选固定在基层光栅相对表面上的一或多种特异性结合的物质或衔接物。高折光率材料 比基底层具有更高的折光率。参见例如美国专利号7，094，595 ；美国专利号7，070, 987。任 选有一覆盖层覆盖光栅表面。在一实施方案中，光栅的折光率可小于任选的覆盖层的折光 率。将光栅用一高折光率的电解膜覆盖，该电解膜可由包括例如硫化锌、二氧化钛、氧化钽、氮化硅和二氧化硅的物质组成。具有光学特征的光栅的横断层面可包含任何周期性重复功能，例如“方波”。光栅还可包含一种重复构型的形状，其选自线型(一维)、方形、圆形、椭 圆形、三角形、梯形、正旋波、卵形、矩形和六边形。本发明的比色共振反射生物传感器还可 包含由例如塑料或环氧树脂组成的光栅，其覆盖有高折光率的材料。选择层厚度(即覆盖 层、生物学材料或光栅)以实现对顶部表面上附加分子的共振波的敏感性。选择光栅周期 以实现在所要求波长下的共振。线性光栅(即一维光栅)具有共振特性，其中将照射光偏振定向垂直于光栅周期。 比色共振反射生物传感器还可包含例如一种二维光栅，如六角形排列的空穴或正方形。也 可使用其它形状。线性光栅与六角形排列的光栅具有相同的间距(Pitch)(即高和低折光 率区域之间的距离)、周期、层厚和材料特性。然而，为共振偶合成光学结构，光必须被偏振 垂直于光栅条(grating lines)。因此，必须将用其垂直于线性光栅的偏振轴定向的偏振滤 光片插入到照射光源和生物传感器表面之间。由于照明光源的仅一小部分被正确极化，因 此与六角形光栅相比，其需要较长的积分时间来收集等量的共振反射光。光栅还可包含例如一种“踏级(stepped) ”模式，其中在较低折光率覆盖层中埋入 一单个、固定高度的高折光率区域。高和低折光率的交替区域提供一种平行于生物传感器 顶部表面的光波导。本发明的比色共振反射生物传感器在基底层的光栅对面的表面上还可包含一覆 盖层。当存在覆盖层时，可将一或多种特异性结合的物质固定在光栅覆盖层对面的表面上。 覆盖层优选包含一种具有比包含光栅的材料更低折光率的材料。覆盖层可由例如玻璃(包 括旋制玻璃(SOG))、环氧树脂或塑料组成。例如，满足生物传感器折光率要求的各种聚合物可用作覆盖层。可使用S0G，原因 是其良好的折光率、易于处理和采用丰富的玻璃表面活化技术，用特异性结合物质迅速激 活。当生物感受器表面的平坦度不是一具体系统设置的问题时，可直接将SiN/玻璃的光栅 结构用作传感表面，可采用与玻璃表面上相同的方式进行活化。在光栅上没有平面化覆盖层时，也可获得共振反射。例如，生物传感器可仅含有一 种基底层，其覆盖有高折光率材料的结构性薄膜层。在不使用平面化覆盖层下，外周介质 (如空气或水)填充光栅。因此，将特异性结合的物质固定于光栅所有表面之上的生物传感 器上，该光栅暴露于特异性结合物质上，而非仅仅在上表面之上。一般来说，本发明的比色共振反射生物传感器使用包含各偏振角度光的白色光和 /或平行光照射。对于生物传感器光栅中重复特征的偏振角的定向将确定共振波长。例如， 由一套重复线段和空间组成的“线形光栅”(即一维光栅)生物传感器具有两个可产生单独 共振反射的光学偏振。垂直于所述线段偏振的光被称为“S-偏振”，而平行于所述线段偏振 的光被称为“P-偏振”。入射光的S和P组成同时存在于未滤过的照明光束中，并且各自产 生单独的共振信号。一般可将生物传感器设计为仅最优化一种偏振的特性(S-偏振)，并且 未最优化的偏振很容易通过偏振滤波片除去。为除去偏振依存性，以使各偏振角产生相同的共振反射光谱，可使用由一套同心 环组成的备选生物传感器结构。在该结构中，各同心环的内径和外径之间的差等于光栅周 期的大约一半。各连续的环具有比前一个环的内径大于约一个光栅周期的内径。同心环形 式延伸覆盖一单个传感器的位置_如一排点或微量滴定板孔。各个单独的微点阵点或微量滴定板孔在其中具有单独的居中的同心环形式。这样结构的所有偏振方向都具有相同的横 断层面。必须准确照射在同心环结构的中心以保持偏振的独立性。同心环结构的光栅周期 比共振反射光的波长小。该光栅周期约为0.01-约1微米。光栅深度约为0. 01-约1微米。在另一实施方案中，将空穴或位置(posts)的阵列安排在非常接近于上述的同心 环结构处，而不需要照射光束集中于格栅的任何特定的位置。这种阵列形式通过以等角度 从三个方向入射在表面上的三激光束的光学干涉自动产生。在这种形式中，空穴(或位置) 被集中于紧密填充的六角形的阵列的角落。所述空穴或位置还可存在于各六角形的中心。 这种空穴或位置的六角形格栅具有三个偏振方向，其“看”相同的横断层面。因此，使用任 何偏振角度的光，该六角形格栅结构提供等同的共振反射光谱。由此不需要偏振滤波片移 除不需要的反射信号组成。空穴或位置的周期可为大约0.01微米-约1微米，且其深度或 高度可为约0.01微米-约1微米。
检测系统可包含直接照射比色共振反射生物传感器的比色共振反射生物传感器 光源，和检测生物传感器中反射光的检测器。在一实施方案中，通过使用滤光镜使得仅有超 过确定阈值的阳性结果触发检测，可将读出装置简化。通过测定本发明比色共振反射生物传感器的各不同位置的共振波长的位移，可确 定那个特殊位置在其上放置有例如生物材料。可使用位移范围确定例如试验样本中结合配 体的量和一或多种特异性结合物质和试验样本的结合配体之间的化学亲和力。可将比色共振反射生物传感器照射2或更多次。第一次测量可确定例如在所述生 物传感器上无生物材料或在表面上带有细胞的生物传感器的一或多个不同位置的反射光 谱。第二、三、四或另外的测量可确定将例如一或多种细胞、试验试剂、离子通道激动剂或离 子通道拮抗剂施加到生物传感器之后或者孵育期或清洗步骤之后的反射光谱。可使用这些 两或多次测量之间峰波长的差别例如测定生物传感器上存在的细胞或细胞量，或者细胞上 试验试剂、离子通道激动剂或离子通道拮抗剂的活性。另外，该照射方法可控制生物传感器 表面上的小的缺陷，其可导致带有峰共振波长轻微变化的区域。该方法还可控制生物传感 器上细胞物质的浓度或密度的变化。生物传感器表面可通过例如物理吸附或通过化学结合，将一或多个细胞固定在生物传感器上。细 胞可以是非粘附细胞或粘附细胞。细胞可天然表达一或多种离子通道或一或多种离子通道 成分。或者，细胞可重组性表达一或多种离子通道或一或多种离子通道成分。细胞可以是 哺乳动物细胞，如人体细胞。细胞可通过例如下列特异性结合物质而特定结合到生物传感器表面，如核酸、肽、 蛋白溶液、肽溶液、包含选自组合化学库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、 单链抗体(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' )2片段、Fv片段、小有机分子、病毒、聚合物或生物试 样，其中将特异性结合的物质固定在生物传感器表面，而结合配体在细胞的表面。或者，不 论细胞类型是常规粘附性的或非粘附性的，细胞可在生物传感器表面生长并任意粘附，而 不必直接固定在生物传感器的表面。可将细胞以一种一或多个不同位置的阵列方式排列在生物传感器表面上，该表面 位于多孔板的一或多个孔内，并包含一或多个多孔板或微阵列的表面。所述细胞阵列包含 在微孔板内生物传感器表面上的一或多个细胞，使得表面包含一或多个不同的各自带有不同细胞或带有不同量细胞的位置。例如一阵列可包含1、10、100、1，000、10，000或100,000
或以上的不同位置。因此，多孔板或微阵列的各孔可在其中带有与多孔板的其它孔分开的一或多种不同位置的阵列，其可使在一多孔板上处理多个不同的样本。与同一微量滴定板 的任何其它微量滴定孔中发现的阵列相比，任何一孔内的阵列可以相同或不同。将细胞固定于生物传感器表面还可通过结合例如下列功能连接基团受到影响镍 基、氨基、醛基、酸基、链烷基、链烯基、链炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸 基、硝基、腈基、碳水化合物基、硫醇基、有机磷酸基、脂基、磷脂基或留基(Steroid)。另外， 将细胞固定在生物传感器表面可通过物理吸附、化学结合、电化学结合、静电结合、不活泼 或活泼粘附分子、疏水性结合或亲水性结合以及免疫捕获方法进行。使得表面能够细胞吸 附和/生长的涂布表面的方法对细胞培养领域的技术人员来讲是熟知的，并可包含用下列 物质或其衍生物涂布生物传感器，包括但不限于聚-D-赖氨酸、纤连蛋白、肌动蛋白、整联 蛋白、粘附素、钙粘着蛋白、胶原、人血清、胎牛血清、小牛血清、层粘连蛋白或其它物质。在本发明的一个实施方案中，可将生物传感器用例如下列连接基团涂布，如镍基、 氨基、醛基、酸基、链烷基、链烯基、链炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、 硝基、腈基、碳水化合物基、硫醇基、有机磷酸基、脂基、磷脂基或留基。例如，可使用胺表面 附着在几种类型的连接基团分子上，并且可使用醛表面直接结合蛋白质，而不需要另外的 连接基团。可使用镍表面结合具有结合了组氨酸(“his”)标记物的分子。带有镍_活化表 面的“his-标记的”分子的检测方法在本领域是熟知的(Whitesides，Anal. Chem. 68，490， (1996))。可将连接基团和特异性结合物质固定在生物传感器的表面，使得各孔在其中都固 定有相同的连接基团和/或特异性结合物质。另外，各孔可包含不同组合的连接基团和/ 或特异性结合物质。细胞可特异性地或非特异性地结合到固定在生物传感器表面上的连接基团或特 异性结合物质上。另外，生物传感器表面可不带有连接基团或特异性结合物质，且细胞可非 特异性结合到生物传感器表面。将一或多种特异性结合物质或连接基团固定在生物传感器上，使得特异性结合物 质或连接基团不能通过漂洗过程冲洗掉，并且使得试验样本中其结合的细胞不受到生物传 感器表面的阻碍。为用于各种类型微阵列和生物传感器，已实施几种不同类型的表面化学 策略，将特异性结合物质共价性附加在例如玻璃或聚合物上。制备使之包含结合一或多 种特异性结合物质的恰当官能团的生物传感器表面，是生物传感器制造过程的一个整体部 分。可通过物理吸附(即不使用化学连接基团)或化学结合(即使用化学连接基团) 以及电化学结合、静电结合、疏水性结合和亲水性结合，将一或多种特异性细胞附着在生物 传感器表面上。化学结合可使特异性结合物质在生物传感器表面产生较强的附着，并提供 表面结合分子确定的定位和形态。可基本上按固定于玻璃上所述的操作，将特异性结合物质固定于塑料、环氧树脂 或高折光率材料之上。但是，可排除酸冲洗步骤，其中该处理会破坏特异性结合物质被固定 于其上的材料。生物传感器的使用方法
技术领域：
本发明的一实施方案提供一种鉴定离子通道调节剂的方法。离子通道调节剂对离 子通道的功能活性具有影响。对功能活性的作用包括阻断或抑制离子通道的活性。该阻断 或抑制作用可在离子通道刺激物存在或对该刺激物响应时发生。或者，调节剂可增强或增 加离子通道的功能活性。该增强作用可在阻断离子通道的分子存在或对该分子响应时发 生。本发明方法可使用重组细胞，但是本发明方法不需要重组过表达的离子通道蛋白质或 亚单位的细胞。可将细胞应用在比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位点。可将细 胞固定于生物传感器上或者可仅使细胞在生物传感器表面上生长。可在本发明方法的任何 步骤，任选将细胞在生物传感器表面上孵育约1、5、10、30分钟或以上或者约1、2、5、24、48、 36小时或以上。所述测定法在约25、30或37°C (或者在约25_37°C之间的任何温度范围) 的温度下进行。在本发明的一个实施方案中，提供一种鉴定离子通道拮抗剂或激动剂的方法。该 方法包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点和第二位点上。可在 将第一组细胞施加到第一位点的同时或较早或较晚的时间，将细胞施加到第二位点上。这 些细胞与施加到第一位点的细胞组可以是相同类型的细胞或不同的细胞。在将细胞施加到 第一位点之前、在将细胞施加到第一位点同时或者将细胞施加到第一位点之后，将试验试 剂施加到第一位点上。向第二位点上加入一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂。在将 细胞施加到第二位点之前、在将细胞施加到第二位点的同时或者将细胞施加到第二位点之 后，将已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位点上。测定第一位点的比色共振 反射光学第一峰波长值(PWV)和测定第二位点的比色共振反射光学第二PWV，其中如果第 一和第二 PWVs相同或类似，则试验试剂为离子通道的拮抗剂或激动剂。如果第一和第二个 值彼此在约Inrn或更小值之内，则第一和第二个值相同或类似。如果第一和第二 PWVs基本 上不同(即第一和 第二 PWVs差别大于约lnm、2nm、3nm、4nm或以上)，则试验试剂不是拮抗 剂或激动剂。另外，在任何步骤之前或之后或该方法加入之前或之后，可测定多个额外的 PffVs之一，并与任何其它PWV比较。在本发明另一实施方案中，提供一种鉴定离子通道拮抗剂或激动剂的方法。该方 法包括将细胞施加到第一位点上。可测定第一位点的PWV。将试验试剂施加到第一位点上。 如果要求，可将细胞和试验试剂孵育一段时间。可对第一位点测定第二次PWV。可计算第一 个值，其中第一个值是第一 PWV和第二 PWV之间的差值。可将第一个值与对照试验相比较。 对照试验可包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第二位点。如果要求， 可将细胞孵育一段时间。可在将第一组细胞施加到第一位点的同时或较早或较晚的时间， 将这些细胞施加到第二位点上。这些细胞与施加到第一位点的细胞组可以是相同类型的细 胞或不同的细胞。可测定第二位点的第三PWV。将一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动 剂施加到第二位点上。如果要求，可将细胞孵育一段时间。可测定第二位点的第四PWV。可 测定第二个值，其中第二个值可以是第二位点的第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一 和第二个值相同或类似，则试验试剂为离子通道的调节剂。如果第一和第二个值彼此在约 Inm或更小值之内，则第一和第二个值相同或类似。如果第一和第二 PWVs基本上不同(即 第一和第二 PWVs差别大于约lnm、2nm、3nm、4nm、5nm或以上)，则试验试剂不是拮抗剂或激 动剂。由于检测(interrogating)所述细胞的无标记生物传感器方法对细胞无破坏性，因 此可将细胞处理一次以上以寻找数分钟、数小时或数天内的差别。
本领域目前有很多已知的离子通道拮抗剂或激动剂。一小部分实例包括钙通道 阻滞剂(如尼索地平、硝苯地平、尼卡地平、苄普地尔、依拉地平、尼莫地平、非洛地平、氨 氯地平、地尔硫草和维拉帕米)、钾离子通道调节剂(参见例如US 20050267089)、Na+离 子通道调节化合物(参见例如US 6，576，791)，还可参见US 7, 101,877 ；US 7，057，053、 US 20070004718 ；US 20060199848、US 20060135536、US20050192208、US 20050026993、US 20040029937、US 20030008906。比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位点和第二位点可以是一种容器的内表面，该容器选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、陪替氏培养皿、微流通道和微阵列。本 发明测定法中的所述细胞、试验试剂和离子通道拮抗剂或激动剂不必包含检测标记物。本发明的另一实施方案提供一种鉴定离子通道调节剂的方法。可将细胞施加到比 色共振反射光学生物传感器表面的第一位点上。将试验试剂和一种已知的细胞离子通道拮 抗剂或激动剂施加到第一位点上。可以以任何次序或者同时，将所述细胞、试验试剂和已知 的细胞离子通道拮抗剂或激动剂加到传感器表面上。可测定第一位点的第一 PWV。将细胞 施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第二位点上。可在将第一组细胞施加到第一位 点的同时或较早或较晚的时间，将细胞施加到第二位点上。这些细胞与施加到第一位点的 细胞组可以是相同类型的细胞或不同的细胞。向第二位点上加入一种已知的细胞离子通道 拮抗剂或激动剂。可以以任何次序或者同时，将所述细胞和已知的细胞离子通道拮抗剂或 激动剂施加于生物传感器表面上。测定第二位点的第二 PWV。如果第一和第二 PWVs不同， 则试验试剂为离子通道的调节剂。如果第一和第二个值差别大于约lnm、2nm、3nm、4nm、5nm 或以上，则第一和第二值不同。如果第一和第二 PWVs相同或类似，则试验试剂不是离子通 道的调节剂。如果第一和第二个值彼此在约Inm或更小值之内，则第一和第二个值相同或 类似。在本发明另一实施方案中，提供一种鉴定离子通道调节剂的方法。该方法包括将 细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点上，将试验试剂施加到第一位点 上，并测定第一位点的第一 PWV。可以以任何次序或者同时，将所述细胞和试验试剂施加到 第一位点上。然后向第一位点上施加于一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂，并测定 第一位点的第二 PWV。确定第一个值，其中第一个值是第一 PWV和第二 PWV之间的差值。或者，所述方法还包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位 点上，将一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第一位点上，并测定第一位点的 第一 PWV。可以以任何次序或者同时，将所述细胞和已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施 加到第一位点上。然后向第一位点上施加入试验试剂，并测定第一位点的第二PWV。确定第 一个值，其中第一个值是第一 PWV和第二 PWV之间的差值。将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第二位点上。可在将第一组细 胞施加到第一位点的同时或较早或较晚的时间，将这些细胞施加到第二位点上。这些细胞 与施加到第一位点的细胞组可以是相同类型的细胞或不同的细胞。可测定第二位点的第三 PWV。向第二位点上加入一种已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂。可测定第二位点的第 四PWV。确定第二个值，其中第二个值是第三PWV和第四PWV之间的差值。如果第一和第二 值不同，则试验试剂为离子通道的调节剂。如果第一和第二个值差别大于约lnm、2nm、3nm、 4nm、5nm或以上，则第一和第二值不同。如果第一和第二值相同或类似，则试验试剂不是离子通道的调节剂。如果第一和第二个值彼此在约Inm或更小值之内，则第一和第二个值相同或类似。在将细胞施加到第一位点之后、在将试验试剂施加到第一位点之后、在将已知的 离子通道拮抗剂或激动剂施加到第一位点之后、在将细胞施加到第二位点之后、在将已知 的离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位点之后，或者在测试期间的任何其它点上或其组 合之后，可将细胞培养一段时间。任选在将细胞加入到比色共振反射光学生物传感器表面之后；在加入试验试剂之 后；在加入离子通道拮抗剂或激动剂之后；或者在测试期间的任何其它点上，或其组合之 后，可将细胞培养一段时间。由于检测所述细胞的无标记生物传感器方法对细胞无破坏性， 因此也可将细胞处理一次以上以寻找数分钟、数小时或数天内的差别。本发明另一实施方案提供一种确证试验试剂是一种离子通道调节剂的方法，该方 法包括将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点上，并任选测定第一位 点的第一 PWV。将一种已知的细胞离子通道激动剂或拮抗剂施加到第一位点上；并将试验 试剂施加到第一位点上。可以同时将所述已知的离子通道激动剂或拮抗剂和试验试剂施 加到第一位点上，或者可将一种在另一种之前施加到第一位点上。可检测第一位点的第二 PWV，可确定第一个值，其中第一个值是第一 PWV和第二 PWV之间的差值。将细胞施加到比 色共振反射光学生物传感器表面的第二位点上。可在将第一组细胞施加到第一位点的同时 或较早或较晚的时间，将这些细胞施加到第二位点上。这些细胞与施加到第一位点的细胞 组可以是相同类型的细胞或不同的细胞。测定第二位点的第三PWV。向第二位点上加入一 种已知的细胞离子通道激动剂或拮抗剂，并测定第二位点的第四PWV。所述已知的细胞离子 通道激动剂或拮抗剂可与第一位点使用的那些相同，或者是一种不同的已知的离子通道激 动剂或拮抗剂。可确定第二个值，其中第二个值是第三PWV和第四PWV之间的差值。如果 第一和第二值不同，则确证该试验试剂为离子通道的调节剂。如果第一和第二个值差别大 于约lnm、2nm、3nm、4nm、5nm或以上，则第一和第二值不同。在将细胞施加入生物传感器之后、在施加入试验试剂之后、在施加入已知的离子 通道激动剂或拮抗剂之后，或在测定中的任何其它时间点处，或其组合之后，可将细胞培养 一段时间。本发明还可用于筛选化合物，以确保它们不以任何方式调节离子通道。目前的离 子通道药物具有很多未能预期、不良的作用。由于这些作用，已从市场上排除几种药物(例 如瑞泽林、Loronex、普瑞博思，盐酸右芬氟拉明胶囊剂(Redux)、胖的明(Pondimin)、息斯 敏、来贝拉地尔和特非那定制剂)。因此，本发明方法可用于鉴定离子通道的非调节剂以及 离子通道调节剂。对于本发明的各实施方案，可检测其出现时的离子通道调节作用或缺乏其作用， 因此防止发生评估时所需要使用的放射法、比色法、荧光法的标记物或显微镜检查法。可 以以非标记的方式，很方便地实时监测由于离子通道调节作用而出现的细胞变化。为实时 检测细胞的变化，设计了 BIND Biosensor 、BIND Reader 和 BIND Scanner (如一种比 色共振反射生物感受器系统)，并创立了对定量化数据的对应计算法。参见如美国专利号 6，951，715、美国专利申请公布号2004/0151626。本发明方法具有优越性，原因是它们不需要标记细胞或者试剂以用于显微或比色/荧光评估，它们允许对相同的细胞群进行实时的、连续的、多重独立的读数，所述方法快 速、所需要的试剂用量极少(包括体积和类型)、不需要重组细胞系、不需要机械处理细胞， 并且所述方法不需要使细胞流过计数器。
该无标记生物传感器方法对细胞无破坏性，使得可以在用或不用已知化合物或试 验化合物处理下，在一段长时间内连续或不间断地监测一种细胞或一组细胞。本发明方法 允许在很多天内对相同的细胞群进行实时的连续监测或多重独立的读出。可在正常培养环 境(适当介质下静止)下，在较长时间内方便并客观地定量细胞变化。还可将本发明的方 法与荧光标记协同使用，以从各细胞或细胞群中得到附加的、细胞内数据。通过在数个时间段测定一个位置的PWV，可监测细胞变化。或者，可在数个时间段 对承载细胞的受器(如微量滴定板孔)进行扫描。在本发明的一实施方案中，通过与一已 知的离子通道调节剂比较试验试剂的PWV图形，可鉴定试验试剂是否作为一种潜在的离子 通道调节剂。当将某种离子通道调节剂加入到某些细胞群中时，PWVs随时间呈现出一种特 定的模式。例如，将离子通道调节剂加入到细胞中后，PWV可能在一特定时间内增加，然后 降低。可将随时间呈现出相同PWV值的模式的试验试剂鉴定为一种潜在的离子通道调节剂 或调整剂。可将一或多种细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面上的位置处，如微量 滴定板孔中。受器指一种容器，并不是一种收集容器，如多孔滴定板(multiwell plate)。 检测该位置的比色共振反射光学峰波长值(PWV)。将一或多种细胞可孵育一段时间(如1 秒、30秒、1、2、5、10、20、30、45分钟，1、2、5、10小时或以上)。在孵育前、孵育后，或在孵育前 和孵育后，可将一或多种试验试剂、离子通道激动剂和/或离子通道拮抗剂加入到一或多 种细胞中。可对该位置的比色共振反射光学PWV进行第二次测定。如果细胞中出现变化， 则将光的反射波长的变化与未出现变化的情形相比较。可将第一 PWV与第二 PWV相比较。 PWV变化可表明细胞中的变化。可测定若干时间段内的PWVs并进行比较。生物传感器位置上细胞的变化可通过生物传感器表面的PWVs测定，或者更多采 用下列利用透镜基光学或电子学电荷偶合装置(CCD)技术的仪器监测，如显微镜、数码相 机、常规照相机或其它显像设备(放大或非放大)。PffV变化可采用BIND读数器 、扫描仪或Cartridge读数器测定。在使用BIND读 数器⑧和Cartridge读数器时，可在约0. 0005-8小时内完成测试。测定PWV的扫描仪的透镜分辨率优选具有约2-约200、约2_约50或约2_约15 微米像素大小。本发明的测试可在少于约0. 25,0. 5,0. 75、1、2、3、4、5、6、7或8小时内完成。 即可以以一种时间有效的方式测定对所加入的试剂响应的细胞变化。本发明任何之处参考的所有专利、专利申请和其它的科学或技术著作均全文结合 到本发明中作为参考。在本文中未特别公开的任何一个或多个要素或一个或多个限制不 存在下，可实施本文中适当描述的本发明。因此，例如在本文的各种情况下，术语“包含”、 “基本由..·组成”和“包括”虽然保留其通常的含义，但其可由其它两个术语的任何一个代 替。已使用的术语和表示用作说明的术语且不构成限制，并且并不意味着排除使用所示和 所述特征的任何等同的这些术语或表达，但应认识到各种修饰都可能在要求保护的本发明 的范围之内。因此，应清楚的是虽然本发明通过各实施方案已被具体公开，但本领域技术人 员可利用本文公开的所述概念的任何特征、修饰和变更，并且认为这些修饰和变更都包括在本说明书和所附的权利要求书所限定的本发明范围之内。另外，当以马库什(Markush) 基团或可替代的其它基团说明本发明的特征和方面时，本领域技术人员将认为马库什(Markush)基团或其它基团的任何单个成员或亚组成员也说明本发明。
权利要求
一种鉴别离子通道拮抗剂或激动剂的方法，其包括(a)将细胞施加到比色共振反射光学生物传感器表面的第一位点和第二位点上；(b)将试验试剂施加到第一位点上；(c)将已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位点上；(d)测定第一位点的比色共振反射光学第一峰的波长值(PWV)和测定第二位点的第二PWV；其中如果第一和第二PWVs相同或类似，则试验试剂为离子通道的拮抗剂或激动剂；而其中如果第一和第二PWVs基本上不同，则试验试剂不是拮抗剂或激动剂。
2.权利要求1的方法，其中在将细胞施加到第一位点之后、在将试验试剂施加到第一 位点之后、在将细胞施加到第二位点之后、在将已知的离子通道拮抗剂或激动剂施加到第 二位点之后，或其组合之后，将细胞培养一段时间。
3.权利要求1的方法，其中PWV采用带有约2微米-约200微米下限像素大小的透镜 的扫描仪测定。
4.权利要求1的方法，其中比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位点和第二位 点是容器的内表面，所述容器选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、陪替氏培养皿、微流槽和 微阵列。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞、试验试剂和离子通道拮抗剂或激动剂不包含检 测标记物。
6.权利要求1的方法，其中该方法在约25、30或37摄氏度的温度下进行。
7.一种鉴别离子通道调节剂的方法，其包括(a)将细胞、试验试剂和已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到比色共振反射光 学生物传感器表面的第一位点上；(b)测定第一位点的第一PWV;(c)将细胞和已知的细胞离子通道拮抗剂或激动剂施加到比色共振反射光学生物传感 器表面的第二位点上；和(d)测定第二位点的第二PWV;其中如果第一和第二 PWVs不相同，则试验试剂为离子通道的调节剂，而其中如果第一 和第二 PWVs相同或类似，则试验试剂不是离子通道的调节剂。
8.权利要求7的方法，其中在将细胞施加到第一位点之后、在将试验试剂施加到第一 位点之后、在将已知的离子通道激动剂或拮抗剂施加到第一位点之后、在将细胞施加到第 二位点之后、在将已知的离子通道拮抗剂或激动剂施加到第二位点之后，或其组合之后，将 细胞培养一段时间。
9.权利要求7的方法，其中PWV采用带有约2微米-约200微米下限像素大小的透镜 的扫描仪测定。
10.权利要求7的方法，其中比色共振反射光学生物传感器表面上的第一位点和第二 位点是容器的内表面，所述容器选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、陪替氏培养皿、微流槽 和微阵列。
11.权利要求7的方法，其中所述细胞、试验试剂和离子通道拮抗剂或激动剂不包含检 测标记物。
12.权利要求7的方法，其中该方法在约25、30或37摄氏度的温度下进行。
全文摘要
本发明提供不使用重组细胞系过度表达离子通道蛋白或不使用检测标记物鉴别离子通道调节剂的方法。
文档编号G01N33/53GK101802611SQ200880107175
公开日2010年8月11日 申请日期2008年7月11日 优先权日2007年7月11日
发明者B·宾德, L·G·莱恩 申请人:Sru生物系统公司