用于测量铊流入和流出的组合物和方法

专利名称：用于测量铊流入和流出的组合物和方法
用于测量铊流入和流出的组合物和方法交叉引用相关申请:本申请要求2007年10月15日提交的美国临时申请案60/979，958的优先权，其 公开内容以其全文通过引用合并入本文。发明背景 发明领域本发明涉及用于检测细胞中离子通道的活性的方法。该方法包括给细胞提供加样 缓冲液，加样缓冲液包含至少一种环境敏感性铊指示剂(例如，发光染料)和氯离子，以及 给细胞提供刺激缓冲液，其中刺激缓冲液包含铊。提供刺激缓冲液引起铊通过离子通道流 入细胞。在提供刺激缓冲液后，检测细胞中铊指示剂的发光(例如，荧光)，其中染料的发光 可在铊存在或不存在的情况下发生变化。
背景技术：
离子通道的高通量筛选(HTS)(例如，HCS)目前受到自动化膜片钳仪器的效率 限制。铊流入作为载有钙指示剂BTC AM酯的克隆细胞系中钾通道活性的替代指示剂的 用途现已被良好建立(Weaver 等人，Journal of Biomolecular Screening 2004 ；9 (8) 671-677)。迄今为止，用于监测离子通道的测定使用铊(I)，其选择性进入开放的钾通道 (Hille，J. Gen. Physiol. 1973 ；61 . 669-686)并且与BTC结合，从而给出钾通道活性的光学 读数。该方法可用于研究来自化合物文库的以HTS模式进行检测的药物对离子通道的活化 和/或抑制。然而，现有方法具有显著的缺点。即，氯化铊可溶性较差并且在大约4. 5mM或更高 的浓度下将从溶液中沉淀出来。因此，用于现有方法的缓冲液必须基本上不含氯化物，以防 止TlCl从溶液中沉淀出来(从而产生数据)。因此，现有方法需要清洗和除去培养物中的 缓冲液(细胞通常在其中生长)(例如，含氯化物的缓冲液)的额外的步骤。此外，由于此 类测定中不存在氯化物，因而所述测定有争议地被视为不接近生理状况。发明概述本发明涉及用于检测细胞中离子通道的活性的方法。该方法可用于测量铊通过离 子通道的流入或流出。通常，该方法包括给细胞提供加样缓冲液，加样缓冲液包含至少一种 环境敏感性铊指示剂(例如，发光染料，例如荧光染料)和氯化物(例如，氯离子)，和给细 胞提供刺激缓冲液，其中刺激缓冲液包含铊。加样缓冲液可包含生理浓度的氯离子。提供 刺激缓冲液可引起铊通过离子通道流入细胞。在提供刺激缓冲液后，检测细胞中染料的发 光(例如，荧光)，其中染料的发光可在铊存在或不存在的情况下发生改变。在一个方面，提供了用于检测细胞中离子通道的活性的方法。该方法包括a)提供 具有离子通道的细胞；b)给细胞提供加样缓冲液，加样缓冲液包含铊指示剂和生理浓度的 氯离子；c)给细胞提供刺激缓冲液，其中刺激缓冲液包含铊，并且其中提供刺激缓冲液引 起铊通过离子通道流入细胞；和d)检测铊指示剂。本发明的某些方法还包括定量检测到的 铊的水平。例如，铊的水平可通过测量响应铊流入的铊指示剂的至少一个光学性质(例如，强度、极性、频率或光密度)来测定。检测方法可以是光学显微镜检查、共聚焦显微镜检查、 荧光显微镜检查或分光光度法。在另一个方面，提供了用于检测细胞中离子通道的活性的方法，其包括a)将细胞 与加样缓冲液接触，其中细胞包含离子通道，并且其中加样缓冲液包含铊指示剂和生理浓 度的氯离子；b)给细胞提供刺激缓冲液，其中刺激缓冲液包含铊，并且其中提供刺激缓冲 液引起铊通过离子通道流入细胞；和c)检测铊指示剂。
在另一个方面，提供了用于检测细胞中离子通道的活性的方法，其包括a)用铊加 载细胞，其中细胞包含离子通道；b)给细胞提供溶液，所述溶液包含铊指示剂和生理浓度 的氯离子；c)刺激细胞的离子通道，例如以引起铊通过离子通道流出；和d)检测铊指示剂。 该方法还可包括清洗细胞以除去过量的铊。用于本方法的细胞的离子通道对于铊指示剂可 以是不可通透的。本发明的方法可用于分析各种类型的离子通道，包括钾离子通道，与受体连接的 离子通道、通道偶联受体和离子转运蛋白。离子通道可以是配体门控或电压门控的离子通 道、牵张激活阳离子通道(stretch-activated cation channel)或选择性或非选择性阳离 子通道。本发明的方法可用于分析各种类型的细胞，包括细菌、酵母、植物和动物细胞(例 如哺乳动物细胞)。细胞可以是神经元、心肌细胞、癌细胞、平滑肌细胞或永生化细胞。细胞 可包含钾通道。离子通道对于铊离子可以是可通透的。在另一个方面，本发明提供了包含铊指示剂的加样缓冲液。许多类型的铊指示剂 可用于实施本发明。铊指示剂可以是可与铊(例如，细胞内或缓冲液中(以检测铊的细胞 外水平)的铊)结合并且可具有在铊存在或不存在的情况下发生改变的光学特性的亲水性 或疏水性化合物。例如，铊指示剂，当与铊离子结合时可展示荧光的增加，或铊指示剂，当与 铊离子结合时可展示细胞内光密度的变化。铊指示剂可以是环境敏感性荧光染料或非荧光 化合物(例如，与铊结合以形成沉淀或有色产物的化合物，例如碘化物、溴化物和铬酸盐)。 铊指示剂可以是在铊敏感性测定中展示25%或更大的荧光强度变化的荧光化合物。在铊敏 感性测定(参见，实施例3)中检测为阳性并且可用于实施本发明的化合物包括对单价或二 价阳离子敏感的荧光化合物(例如，Zn2+或Ca2+指示剂)。在铊敏感性测定中检测为阳性 的示例性化合物可包括夹氧杂蒽部分(例如，FluoZin 1、FluoZin 2、FluoZin 3、FluoZin 4、Red Fluo-4FF> Magnesium GreeruPhen Green> RhodZin-3)
分(例如，BTC或APTRA-BTC或其衍生物或盐)；苯并呋喃部分(例如，Mag-Fura Red或其 衍生物或盐)；萘部分；或冠醚部分。铊指示剂可在铊离子存在的情况下展示荧光强度的减 弱(例如，ANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI、Phen Green、APTRA-BTC 或 Mag-FuraRed 或其衍生 物或盐)或可在铊离子存在的情况下展示荧光的增强(例如，Magnesium Green,Fluo-4FF, FluoZin-I或Flu0Zin-2、Rh0dZin-3或其衍生物或盐)。在一些实施方案中，铊指示剂可以 是 ANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI、Phen Green、Magnesium Green、Mag-Fura Red Fluo_4FF、 FluoZin-I 和 FluoZin-2、RhodZin-3 或其衍生物或盐。铊指示剂可包括乙酰氧甲基酯部分。例如，铊指示剂可以是选自ANTS、Fluo-4、 Fluo-3、PBFI、Phen Green、Magnesium Green、Mag-FuraRecU Fluo_4FF、FluoZin-I> RhodZin-3和FluoZin-2的化合物的乙酰氧甲基(AM)酯衍生物。
提供的方法可利用包含生理浓度的氯离子(例如，大于大约2mM ；或大约5mM至大 约20mM ；或大约20mM至大约IOOmM ；或大约50mM至大约150mM)的加样缓冲液。氯化物的 来源可以以盐例如NaCl或KCl的形式存在。 提供的方法可利用包含铊的刺激缓冲液。铊可以以盐的形式存在，所述盐在加样 缓冲液中可以是可溶解的。例如，铊盐可以是T12S04、T12C03、TlCl、T10H、TlOAc或T1N03。 刺激缓冲液可以以低于大约4. 5mM,或低于大约4. OmM,或低于大约3. OmM的浓度包含铊；或 铊浓度可在大约0. 1至大约2. OmM的范围内。在某些实施方案中，刺激缓冲液可以以大约 0. ImM至大约2mM的浓度包含铊(例如，铊离子)并且加样缓冲液可以以大约IOmM至大约 150mM的浓度包含氯离子。在其他实施方案中，铊的浓度可以是大约2mM至大约5mM并且加 样缓冲液以大约IOmM至大约150mM的浓度包含氯离子。在其他实施方案中，铊的浓度为大 约5mM至大约20mM并且加样缓冲液以大约IOmM至大约150mM的浓度包含氯离子。在给细胞提供加样缓冲液后任何选地可清洗细胞(例如，以去除过量铊指示剂)。 在某些实施方案中，不清洗细胞，并且可向加样缓冲液中加入猝灭剂。在该情况下，猝灭剂 可以是基本上不通透细胞的。猝灭剂的实例包括酒石黄、苋菜红、酸性红37、刚果红、台盼 蓝、亮黑或此类猝灭剂的组合。本发明的方法可包括用刺激物(例如结合离子通道的配体、通道偶联受体或电 刺激)刺激离子通道。刺激物可以是能够活化GIRK钾离子通道以允许铊流入的G蛋白 偶联受体激动剂。备选地，或此外，刺激物可以是尼古丁、乙酰胆碱、毒蕈碱(muscarine)、 carbamyline或GIRK钾离子通道激活剂。刺激物可以是或包括可引起离子通道去极化 的组合物(例如，离子载体、缬氨霉素或钾盐)或包括通道视紫红质、盐细菌视紫红质 (halorhodopsin)或量子点纳米晶(quantum dotnanocrystal)的组合物。在另一个方面，提供了用于检测细胞中离子通道的活性(例如，铊的流入或流出) 的试剂盒。某些试剂盒(例如，用于检测铊离子流入的试剂盒)可包括加样缓冲液，其中加 样缓冲液包含铊指示剂和生理浓度的氯离子；和刺激缓冲液，其中刺激缓冲液包含铊，并且 其中刺激缓冲液引起铊通过离子通道流入细胞。某些试剂盒(例如，用于检测铊离子流出 的试剂盒)可包括铊加样溶液，其中溶液包含铊；和包含铊指示剂和生理浓度的氯离子的 溶液(例如，缓冲液)。在另一个方面，用于检测细胞中离子通道的活性的溶液包含a)铊指示剂；b)生 理浓度的氯离子；和c)铊。溶液的铊浓度可以小于4. 5mM或为大约0. ImM至大约4mM ；或 为大约0. ImM至大约2mM。溶液的氯离子浓度是大约IOmM至大约150mM或大约50mM至大 约 150mM。本发明通过提供监测离子通道的方法(其中至少一些缓冲液包含生理浓度的氯 离子)解决了与现有的铊流入和流出测定相关的问题。附图概述

图1描述了用在四环素诱导型启动子的控制下的hERG钾离子通道基因转染的细 胞的铊流入。用hERG基因转染并且用四环素进行诱导以促进hERG基因表达的细胞显示了 铊流入。未进行诱导的转染细胞未显示铊流入(底部的曲线)。图 2 描述 了使用 FLUXOR Thallium NW 检测试剂盒(InvitrogenCorporation， Carlsbad, CA)在96孔板中测量的hERG活性。
发明详述在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限定于特定的组合物或方法步骤。应 当指出，如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文明确地指出，否则单数形式 “a”、“an”和“the”包括复数所指物。还应理解，术语“大约”，当用于描述数值时，除非上下 文明确地指出，否则应当包括直至该数值的士 15%的范围。
本发明涉及用于检测细胞中离子通道的活性的方法。如本文中所使用的，术语“细 胞”意指一个或多个细胞。细胞可以存在于任何环境中，只要加样和刺激缓冲液可应用于细 胞。在一个实施方案中，细胞存在于体外环境中，并且使用熟知的细胞培养技术进行方法。 在更特定的实施方案中，细胞存在于细胞培养悬浮液中。在另一个特定实施方案中，细胞存 在于细胞贴壁培养物中。可对任何细胞实施本发明的方法，只要细胞具有/表达铊可通透的离子通道。离 子通道的实例包括但不限于钾离子通道、与受体连接的离子通道例如GIRK，和通道偶联受 体例如GPCR，以及离子转运蛋白例如谷氨酸盐转运蛋白。细胞可以通常具有或表达离子通 道，或可通过使用熟知的转染和转化技术将离子通道导入细胞。提供了用于测定表达天然 水平的离子通道的细胞(例如，非工程改造的细胞)和用于测定已由实施者修饰(例如，工 程改造)从而包含离子通道的细胞的方法。该方法不限于特定类型的离子通道，只要通道对于铊是可通透的。因此，可用于 本发明的方法的离子通道的类型包括但不限于配体门控或电压门控的、牵张激活阳离子通 道、选择性或非选择性阳离子通道。配体门控的非选择性阳离子通道的类型包括但不限于乙酰胆碱受体、谷氨酸盐受 体例如AMPA、红藻氨酸盐(kainate)和NMDA受体、5-羟色胺-门控受体-通道、ATP-门控 (P2X)受体-通道、烟碱型乙酰胆碱-门控受体-通道、香草素受体、兰诺定(ryanodine)受 体-通道、IP3受体-通道、由细胞内cAMP原位激活的阳离子通道和由细胞内cGMP原位激 活的阳离子通道。电压门控的离子通道的类型包括但不限于Ca2+、K+和Na+通道。可外源或内源表 达通道。可在天然或工程改造的细胞系中稳定或瞬时表达通道。K+ 通道的类型包括但不限于 KCNQl (KvLOTl)、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5、HERG, KCNEl (IeK、MinK)、Kvl. 5、Kir3. l、Kir3. 2、Kir3. 3、Kir3. 4、Kir6. 2、SUR2A、R0MK1、Kv2. 1、 Kvl. 4、Kv9. 9、Kir6、SUR2B、KCNQ2、KCNQ3、GIRKl、GIRK2、GIRK3、GIRK4、hlKl、KCNAl、SURl、 Kvl. 3、hERG、细胞内钙激活的K+通道、大鼠大脑(BK2)、小鼠大脑(BKl)等。另外的离子通道 描述于 Conley,E. C.禾口 Brammer,W. J. , The Ion Channel,Factsbook IV,Academic Press, London, UK, (1999)中，其通过引用合并入本文。Na+通道的类型包括但不限于大鼠大脑I、II和III、人II等。Ca2+通道的类型包括但不限于人钙通道Ql、α2、β和/或Y亚基、兰诺定受体 (RyR)和肌醇1，4，5-三磷酸受体(IP3k)、兔骨骼肌α ！亚基、兔骨骼肌α 2亚基、兔骨骼肌P 亚基、兔骨骼肌Y亚基等。本发明的方法还可用于间接测量通道偶联受体和信号转导系统的活性。可通过受 体亚基与离子通道例如GPCR β-γ亚基与GPCR偶联K+通道例如GIRK之间的相互作用或 通过调节离子通道活性的信使分子例如钙、脂质代谢物或环核苷酸的浓度的改变来调节通道活性。
因此，本发明提供了用于监控、检测和/或测量细胞内事件(已知其引起离子通道 的通透性的变化)的活动的方法。细胞内活动可包括但不限于蛋白质磷酸化或去磷酸化、 转录的上调或下调、内部钙的流入或流出、细胞分裂、细胞凋亡、受体二聚化等。因此，如果 需要，此类细胞内事件的测量或检测还可用作离子通道的间接检测或测量。此外，G蛋白偶联受体也可用于本发明。G蛋白偶联受体的实例包括但不限于毒 蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)、肾上腺素能受体、血清素受体、多巴胺受体、血管紧张素受体、 腺苷受体、缓激肽受体、亲代谢型兴奋性氨基酸受体(metabotropic excitatory amino acidreceptor)等。本发明的另一种类型的间接测定包括测定受体的活性，所述受体，当被激活时，导 致细胞内环核苷酸例如cAMP、cGMP的水平发生变化。例如，一些多巴胺受体、血清素受体、 亲代谢型谷氨酸盐受体和毒蕈碱乙酰胆碱受体的激活导致细胞质的cAMP或cGMP水平的升 高或降低。此外，已知一些环核苷酸门控的离子通道例如视杆光感受器细胞通道和嗅觉神 经元通道在通过结合cAMP或cGMP而活化后对阳离子是可通透的。因此，根据本发明的方 法，由环核苷酸活化的光感受器或嗅觉神经元通道的量的变化引起的细胞质离子水平的变 化可用于确定受体的功能，所述受体，当被激活时，引起cAMP或cGMP水平的变化。在一个 实施方案中，在加入受体激活性化合物之前，向细胞中加入升高或降低细胞内核苷酸水平 的试剂例如毛喉素。例如，如果已知或怀疑受体的激活导致环核苷酸水平的降低，那么在测 定中可在向细胞中加入受体激活性化合物之前，向细胞中加入已知升高细胞内核苷酸水平 的毛喉素。用于该类型的测定的细胞可通过用编码离子通道例如hERG的DNA和编码通道偶 联受体(当被激活时，其引起细胞质中环核苷酸水平的变化)的DNA共转染宿主细胞来产生。用于本发明的受体包括但不限于毒蕈碱受体例如人M2、大鼠M3、人M4、人M5等。 其他受体包括但不限于神经元烟碱型乙酰胆碱受体例如人a2、人Ci3和人β2、人Ci5、亚 型大鼠α 2亚基、大鼠α 3亚基、大鼠α 4亚基、大鼠α 5亚基、鸡α 7亚基、大鼠β2亚基、大 鼠β 3亚基、大鼠β 4亚基、大鼠α亚基的组合、大鼠NMDARl受体、小鼠NMDA el受体、大 鼠NMDAR2A、NMDAR2B和NMDAR2C受体、大鼠亲代谢型mGluRl受体、大鼠亲代谢型mGluR2、 mGluR3和mGluR4受体、大鼠亲代谢型mGluR5受体等。其他受体包括但不限于肾上腺素能 受体例如人β 、人α 2、仓鼠β 2等。其他受体包括但不限于多巴胺受体、血清素受体和血 清素受体，例如，人D2、哺乳动物多巴胺D2受体、大鼠多巴胺受体、人5HTla、血清素5HT1C 受体、人5HT1D、大鼠5HT2、大鼠5HTlc等。术语“离子通道”还包括离子转运蛋白。离子转运蛋白的实例包括但不限于神经 递质离子转运蛋白，例如多巴胺离子转运蛋白、谷氨酸盐离子转运蛋白或血清素离子转运 蛋白、钠-钾ATP酶、质子-钾ATP酶、钠/钙交换蛋白和钾离子-氯离子共转运蛋白。可用于本发明的方法的细胞的类型包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞 和动物细胞。可用于本发明的动物细胞的实例包括但不限于昆虫细胞、鸟细胞和哺乳动物 细胞。可使用本发明的方法检查的细胞的其他实例是神经元、心肌细胞、癌细胞、平滑肌细 胞等。在某些实施方案中，细胞可以是永生化细胞。
提供了测定细胞中离子通道的活性的方法，所述方法可用于检测铊(例如，铊离 子)通过细胞的离子通道的流入或流出。在一个方面，提供了测定铊通过离子通道的流入 的方法。一般地，评估铊流入的方法包括将细胞(或细胞的溶液)与包含铊指示剂和生理 浓度的氯离子的加样缓冲液接触。然后将包含铊的刺激缓冲液加入细胞以使铊通过离子通 道流入细胞。在刺激细胞后，铊指示剂的检测提供了关于离子通道的活性的信息。在某些 实施方案中，检测铊指示剂的光学特性。
为了进行本发明的方法，给细胞提供加样缓冲液。用于本发明的加样缓冲液包含 环境敏感性试剂和氯离子。如本文中所使用的，“环境敏感性试剂”是其中化合物的至少一 个特性(例如，光学特性)响应其邻近的环境的一个方面而发生变化的化合物，例如染料。 特别地，用于本发明的试剂的至少一个光学特性应当对铊浓度敏感。因此，在一个方面，环 境敏感性试剂可以是铊敏感性试剂。“铊敏感性试剂”或“铊指示剂”，如本文中使用的，是 具有至少一个光学特性的化合物例如染料，其中所述化合物的至少一个特性(例如，光学 特性)响应铊(例如，铊离子)的存在或不存在而发生变化。加样缓冲液还可包含另外的成分，例如但不限于血清白蛋白、转铁蛋白、L-谷氨酰 胺、脂质、抗生素、β-巯基乙醇、维生素、矿物质、ATP和相似的组分可存在。加样缓冲液还 可包含至少一种有机离子转运的抑制剂，例如但不限于苯溴马隆、丙磺舒、别嘌呤醇、秋水 仙素和磺吡酮(8111打即71^2016)。可存在的维生素的实例包括但不限于维生素4、81、82、83、 Β5、Β6、Β7、Β9、Β12、C、Dp D2、D3、D4、D5、Ε、生育三烯酚、K1和K2。促进铊指示剂的溶解的另外的 成分例如表面活性剂(例如，可从BASF Corporation, Mount Olive，NJ获得的聚氧化烯基 醚，例如 PLUR0NIC F127，P85 等)或 P0WERL0AD (可从 Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA获得)可包含在加样缓冲液中。本领域技术人员可确定用于给定的培养物的矿物质、维 生素、ATP、脂质、必需脂肪酸等的最佳浓度。补充物的浓度可以例如是大约0. 001 μ M至大 约ImM或更大。提供的补充物的浓度的特定实例包括但不限于大约0.005 μ M、0. 01 μ Μ、 0. 05 μ Μ、0· 1 μ Μ、0· 5 μ Μ、1· 0 μ Μ、2· 0 μ Μ、2· 5 μ Μ、3· 0 μ Μ、4· 0 μ Μ、5· 0 μ Μ、10 μ Μ、20 μ Μ、 ΙΟΟμΜ等。还可以以多种可能的制剂(包括制备的并且以100 μ M至IOmM的浓度使用的水 可溶形式或碱可溶形式)使用用于帮助和保持染料载入细胞的试剂例如丙磺舒。铊敏感性试剂用作铊穿过细胞膜的流动的指示剂，并且足够敏感以使至少一个光 学特性响应细胞质中铊离子浓度的变化而产生可检测的变化。可产生可检测的信号的铊敏 感性试剂的类型包括但不限于荧光化合物和非荧光化合物。可用于实施本发明的铊指示剂包括对单价离子或二价离子具有敏感性的化合物。 例如，铊指示剂可具有对单价离子例如Li+、Na+、K+、Rb+ Ag+、Au+的敏感性或对二价离子例如 Zn+2、Ca+2、Mg2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Fe2+ 和 Ni2+ 的敏感性。测定和/或待评估的离子通道的类型在确定使用哪种铊指示剂中可以是很重要 的因素。对于某些应用，可能需要对铊具有高敏感性的铊指示剂。然而，在其他应用中，可 能使用较低敏感性的铊指示剂。提供了对铊离子具有不同敏感性的铊指示剂。在某些实施方案中，铊指示剂具有对铊(I)离子的敏感性。化合物对铊(I)离子 的敏感性可以以许多不同的方法估量。一个方法是使用基于荧光的敏感性测定。通常，铊 敏感性测定可包括，以给定的浓度将本文中所描述的化合物与不同量的铊离子在缓冲液中 组合，和监测作为不断增加的铊离子浓度的函数的化合物的荧光强度的变化。可使用实施例3中描述的铊敏感性测定来估量铊敏感性。铊敏感性化合物通常在低铊浓度(例如，小 于4. 5mM的浓度)下具有较大的荧光强度变化。在浓度为5mM或更低的铊存在的情况下具 有25%或更大的荧光强度变化的铊指示剂被认为是对铊特别敏感的，并且可用于本文中描 述的测定方法中。
多种类型的化合物具有对铊的敏感性并且可用于实施本发明。在本发明的一个实 施方案中，铊敏感性试剂是荧光化合物(例如，荧光染料)。可使用基本上任何可被载入细 胞的铊敏感性荧光化合物。在一个特定的实施方案中，选择化合物以检测低浓度的铊离子 (例如，小于4.5mM)。化合物在与铊结合后可展示一个或多个荧光特性的变化。例如，某些 化合物的荧光强度可在与铊结合后增强。备选地，某些化合的荧光强度可在与铊结合后减 弱。如本文中描述的，铊与化合物(例如，荧光化合物)的结合可通过任何方式、与化 合物的任何部分发生，和通过离子或非离子相互作用而发生。在某些实施方案中，铊指示剂 是结合铊(I)离子从而在其荧光特性上产生变化的化合物。响应铊的结合而在一个或多个其荧光特性上展示变化的任何化合物可用于实施 本发明。示例性铊指示剂包括基于夹氧杂蒽的荧光化合物。基于夹氧杂蒽的化合物包括例 如荧光素或对甲氨基酚(rhodol)或罗丹明。在某些实施方案中，铊指示剂是夹氧杂蒽衍生 物。在其他实施方案中，铊指示剂是对甲氨基酚衍生物。在其他实施方案中，铊指示剂是罗 丹明衍生物。可用于实施本发明的基于夹氧杂蒽的示例性化合物包括在一个或多个芳香族 碳上被卤素例如氟取代的荧光素或对甲氨基酚。示例性氟取代的夹氧杂蒽(例如，氟化的 荧光素和对甲氨基酚化合物)包括例如美国专利6，162，931和Gee等人，Cell Calcium ； 2002,31 (5) :245-51中描述的那些。下列列表提供了可从其衍生铊指示剂并且可按照本文 中描述的方法使用的氟化的夹氧杂蒽的特定实例6-氨基-9- (2-羧基-3，4，5，6-四氟苯基)_3H_夹氧杂蒽_3_酮，6-氨基-9- (2，4- 二羧基苯基)-2-氟_3H_夹氧杂蒽_3_酮，6-氨基-9- (2，4- 二羧基苯基)_7_氟_3H_夹氧杂蒽_3_酮，4'，5'-双((二(羧甲基)氨基)甲基)_2'，7' -二氟荧光素(2'，7' -二 氟钙黄绿素)，4'，5'-双((二(羧甲基)氨基)甲基)_2'，7' - 二氟荧光素，乙酰氧甲基酯 (2'，7' - 二氟钙黄绿素AM)，4_(羧甲基)硫-5，6，7_三氟荧光素，6_(羧甲基)硫-4，5，7-三氟荧光素，4-(羧甲基)硫-2' ,5,6,7,7'-五氟荧光素，6-(羧甲基)硫-2' ,4,5,7,7' _五氟荧光素，9-(4-羧基-2-磺苯基)-2'，7' - 二氟荧光素，4' ,5' -二氯-2' ,7' -二甲氧基_4，5，6，7-四氟荧光素_5_羧酸2'，7' -二氯 _4，5，6，7-四氟荧光素，1'，8' _ 二氟荧光素，2' ,7' _ 二氟荧光素，2'，7' -二氟荧光素二乙酸酯，
4' ,5' _ 二氟荧光素，2'，7' -二氟-6-羟基-3H-夹氧杂蒽-3-酮，2' ,7' -二氟荧光素-5-羧酸，
2'，7' -二氟荧光素-5-羧酸二乙酸酯，2'，7' -二氟荧光素-5-羧酸二乙酸酯，乙酰氧甲基酯，2' ,7' -二氟荧光素-6-羧酸，2' ,7' -二氟荧光素-5-磺酸，2' ,7' -二氟荧光素-6-磺酸，2' ,7' -二甲氧基_4，5，6，7-四氟荧光素，2' ,7' -二甲氧基_4，5，6，7-四氟荧光素-5-羧酸，5-十二烷酰基氨基-2' ,7' _ 二氟荧光素，2'-氟荧光素，4'-氟荧光素，2' ,4,5,6,7,7' _ 六氟荧光素，2' ,4,5,6,7,7'-六氟荧光素二乙酸酯，1,2,4,5,7,8-六氟_6_羟基_9_ (五氟苯基)_3H_夹氧杂蒽_3_酮，6-羟基-9- (2-硫代-3，4，5，6-四氟苯基)_3H_夹氧杂蒽_3_酮，2' ,4' ,5' ,7'-四溴 _4，5，6，7_ 四氟荧光素，2' ,4' ,5' ,7'-四氟荧光素，2'，4'，5'，7'-四氟荧光素 _5_ 羧酸，2' ,4' ,5' ,7'-四氟荧光素二乙酸酯，4，5，6，7_四氟荧光素，4，5，6，7_四氟荧光素二乙酸酯，4，5，6，7-四氟荧光素-2' ,7' -二丙酸，4，5，6，7-四氟荧光素-2'，7' _ 二丙酸，乙酰氧甲基酯，或2' ,4' ,5' ,7'-四碘 _4，5，6，7_ 四氟荧光素。具有对铊的敏感性的基于夹氧杂蒽的化合物还包括可商购获得的化合物例 如 FluoZin 1、FluoZin 2、FluoZin 3、Fluo_4FF、MagnesiumGreen、RhodZin—3 禾口 Phen Green (全都可从 Invitrogen Corporation, Carlsbad，CA 获得)。在另一个方面，提供了包括香豆素部分的铊指示剂。基于香豆素的铊指示剂的代 表性实例包括例如BTC或其衍生物(例如，APTRA-BTC)。在另一个方面，提供了包括苯并呋喃部分的铊指示剂。基于苯并呋喃的铊指示剂 的代表性实例包括例如Mag-Fura Red或其衍生物(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)。在另一个方面，提供了包括萘部分的铊指示剂。基于萘的铊指示剂的代表性实例 包括例如 ANTS(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)。在另一个方面，提供了包括冠醚部分的铊指示剂。基于冠醚的铊指示剂的代表性 实例包括例如 PBFI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)。尽管不要求铊结合铊指示剂化合物的特定部分，但本发明的特定铊指示剂可包括离子络合部分(ion-complexing moiety) 0离子络合部分的代表性实例包括冠醚，包括二 芳基二氮杂冠醚；1，2_双-(2-氨基苯氧基乙烷)-N，N，N' , N'-四乙酸(BAPTA)的衍生 物；2-羧基甲氧基-苯胺-N，N- 二乙酸(APTRA)的衍生物；2-甲氧基-苯胺-N，N- 二乙酸 的衍生物以及基于吡啶基的和菲咯啉金属离子螯合剂。铊敏感性 试剂可以是亲水性的或疏水性的。可进一步衍生本文中描述的任何铊敏 感性化合物以包括增加化合物的亲水性或疏水性的部分。例如，可衍生化合物以将其转化 成更疏水的形式，该形式能够更容易地穿过细胞膜。例如，可通过将细胞与包含染料或染料 的可透过膜的衍生物的加样缓冲液接触来将铊敏感性荧光试剂载入细胞。还可通过使用染 料的更加疏水的形式促进细胞的染料载入。对于某些应用，可能期望提供具有可切割的疏水性部分的铊指示剂。例如，具有可 切割的疏水性部分的铊指示剂可容易地通过细胞膜进入细胞。进入细胞后，所述部分可被 细胞内的试剂(例如，酶)切割，从而产生疏水性较低的化合物，其保持截留在细胞内。可 切割的部分可以是易于被酶(例如，酯酶、脂肪酶、磷脂酶等)切割的任何部分。代表性可 切割部分包括例如疏水部分例如乙酰氧甲基(AM)酯。在一些实施方案中，铊指示剂可以是 以乙酰氧甲基酯(AM)的形式存在的染料，其在天然状态下比染料的未修饰形式更疏水，并 且能够更容易得多地穿过细胞膜。当染料的乙酰氧甲基酯形式进入细胞时，酯基被细胞溶 质酯酶除去，从而将染料截留在细胞溶质中。在某些实施方案中，铊指示剂是基于夹氧杂蒽的化合物(例如，氟化的夹氧杂蒽 例如氟化的对甲氨基酚或荧光素)的AM酯衍生物。在某些实施方案中，铊指示剂是基于香 豆素的化合物的AM酯衍生物。在某些实施方案中，铊指示剂是基于苯并呋喃的化合物的AM 酯衍生物。在某些实施方案中，铊指示剂是基于萘的化合物的AM酯衍生物。在某些实施方 案中，铊指示剂是基于冠醚的化合物的AM酯衍生物。铊指示剂可以以盐的形式存在。“盐”是指化合物的可接受的盐，所述盐来源于本 领域内熟知的多种有机和无机抗衡离子，并且包括例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐和四烷 基铵盐；和当分子包含碱性官能度时，有机或无机酸的盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、 甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐和草酸盐。可用于实施本发明的铊指示剂盐的代表性实例包括 具有抗衡离子例如Na+、K+、NH4+和NR4+的那些。可使用本领域技术人员熟知的方法将本文 中描述的化合物的盐制备为盐。还应理解，可使用一种以上的铊指示剂(例如，两种或多种 铊指示剂的组合)实施本发明。用于本发明的铊指示剂的光学特性可以是化合物的任何光学特性，只要所述特性 可响应铊而发生变化。发光(例如，荧光)染料的光学特性的实例包括但不限于强度、频率 和极性。在一个特定实施方案中，检测或测量染料的强度。铊指示剂的荧光强度可在铊离子存在的情况下增强或减弱。在上文所列的铊敏 感性荧光试剂(例如，ANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI, PhenGreen, Magnesium Green、BTC、 APTRA-BTC、Mag-Fura Red、Fluo_4FF、FluoZin-1 和 FluoZin-2)中，ANTS、Fluo-4、Fluo-3、 PBFI、Phen Green、APTRA_BTC和Mag-Fura Red在铊离子存在的情况下显示荧光强度减弱。 Magnesium Green、RhodZin-3、BTC、Fluo_4FF、FluoZin-I 和 FluoZin-2 在铊离子存在的情 况下显示荧光增强。在其中使用荧光铊敏感性试剂的一个特定实施方案中，可通过使用足够量的细胞外猝灭剂除去过量的荧光化合物。如本文中使用的，“猝灭剂”是指吸收由荧光铊指示剂发 射的能量而不再发射荧光能量的光子还原剂(photon-reducing agent)。细胞外猝灭剂的 使用消除了对从细胞清洗未载入的铊敏感性荧光试剂的需要。细胞外猝灭剂不必是可透过 细胞的，并且可以是具有可容易地与铊敏感性荧光试剂的荧光分开的荧光的光吸收荧光化 合物。细胞外猝灭剂的吸收光谱显著地吸收铊敏感性荧光试剂的发射。细胞外猝灭剂必须 是阻止它们进入细胞的化学组合物，并且一般说来，猝灭剂应当带电荷或是非常大的化合 物。取决于它们的光吸收特性，细胞外猝灭剂的浓度范围可在μΜ至mM浓度之间。可使 用的细胞外猝灭剂的类型包括但不限于酒石黄和苋菜红(amaranth)、酸性红37、刚果红、 台盼蓝、亮黑或此类猝灭剂的混合物。猝灭剂描述于Sigma-Aldrich Handbook of Dyes, Stains, and Indicators(Floyd G.Green,1990, St. Louis, Missouri, USA)中。本发明还提供了对铊浓度敏感的非荧光试剂的用途。在一个实施方案中，本发明 提供了使用铊敏感性试剂，其为非荧光化合物，所述化合物与铊离子结合或反应以形成可 形成沉淀的产物或形成有色的产物，从而引起受试混合物的光密度的可检测的变化。此类 化合物包括但不限于碘化物、溴化物和铬酸盐。当铊敏感性试剂是非荧光化合物时，可在加入铊离子和加入通道调节剂之前，期 间和之后利用例如分光光度计记录吸光度。将碘化物、溴化物或铬酸盐离子载入表达离子 通道和/或受体的细胞。用例如缓冲盐溶液清洗细胞。铊至细胞内的转运引起光密度信号 的增强或减弱。铊离子顺着其浓度梯度通过开放的通道，并且可导致细胞内光密度的变化， 从而产生记录的信号。离子通道的活化增加了铊离子的流入速率，这可以导致例如沉淀或 有色产物的增加的形成；而抑制减少了铊离子的流入速率，这可以导致例如沉淀或有色产 物形成的无变化或极小的变化。通常，如果没有铊离子与非荧光化合物反应，则光密度保持 相同。因此，如果阻断离子通道，铊离子流入被抑制，则检测到光密度的极小变化或检测不 到其变化。加样缓冲液还可包含氯化物(例如，氯离子)。在本发明的一个实施方案中，加样 缓冲液包含可检测量的氯化物。在另一个实施方案中，加样缓冲液不含氯化物。在某些实 施方案中，加样缓冲液基本上不含氯离子(例如，低于2mM)。在其他实施方案中，加样缓冲 液包含低于ImM的氯离子。本发明提供的一个有利方面是允许在用铊刺激细胞之前在加样 缓冲液和细胞培养基中使用氯化物。一般地，缓冲液中氯化物的来源通常来自NaCl或KCl 盐，但如果存在的话，氯化物可来自任何来源。氯化物，如果存在于缓冲液例如加样缓冲液 或清洗缓冲液中，事实上可以是任何浓度，因为本发明的方法不依赖于氯化物的不存在。因 为氯离子不干扰测定，所以含有生理相关浓度的氯化物的缓冲液可用于本发明的实施。“生 理相关浓度”是指为生物体的健康或正常机能的特征或与其相符的浓度。在某些实施方案 中，加样溶液的氯化物浓度大于大约2mM。在某些实施方案中，加样溶液的氯化物浓度大于 大约5mM。在某些实施方案中，加样溶液的氯化物浓度大于大约10mM。在其他实施方案中， 加样溶液的氯化物浓度为大约5mM至大约20mM。在其他实施方案中，加样溶液的氯化物浓 度大于大约20mM至大约lOOmM。在其他实施方案中，加样溶液的氯化物浓度为大约50mM至 大约150mM。在一些实施方案中，加样缓冲液以大约IOmM至大约150mM的浓度包含氯化物。 在其他实施方案中，加样缓冲液以大约50mM至大约150mM的浓度包含氯化物。在其他实施 方案中，加样缓冲液以大约75mM至大约125mM的浓度包含氯化物。在其他实施方案中，加样缓冲液以大约IOOmM至大约125mM的浓度包含氯化物。还可使用其他浓度的氯化物，其 中本领域技术人员可容易地确定可接受的氯化物的水平。在给细胞提供加样缓冲液后，将刺激缓冲液加入细胞以刺激铊移入或移出细胞。 刺激缓冲液应当包含铊。刺激缓冲液是活化离子通道、通道偶联受体或离子转运蛋白的溶液(例如，激动 剂)。一些离子通道/转运蛋白可具有组成型活性，从而可不需要除了铊离子示踪剂外的 “刺激物”。对于需要刺激物的通道，该刺激物可以是配体(结合通道或通道偶联受体并且 活化其的分子(激动剂))。刺激物也可以是电压门控通道的膜电位的变化。通常电压门控 通道通过使用电极的直接电刺激或通过使用包含离子组合物(所述组合物将引起去极化) 的刺激溶液(例如高外部钾)来活化。此外，铊离子还可用作电压门控通道的刺激物。在 该情况下，铊离子可用作“示踪剂”和去极化刺激物。在流入测定中，可在即将加入刺激之 前，期间或之后加入铊离子。本发明的方法可使用刺激缓冲液，其基于方法中使用的离子通道、通道偶联受体 或离子转运蛋白的类型来选择。选择合适的刺激溶液和离子通道、通道偶联受体或离子转 运蛋白激活剂在本领域技术人员的能力之内。在一个实施方案中，刺激缓冲液包括不包含 活化离子通道的试剂(从而离子通道、通道偶联受体或离子转运蛋白基本上保持在静息状 态)的缓冲液。在该实施方案中，刺激溶液包含不活化目的离子通道、通道偶联受体或离子 转运蛋白，但当向细胞中加入调节剂以起始测定时促进离子通道、通道偶联受体或离子转 运蛋白的活化的试剂。选择用于与电压依赖性离子通道例如N-型钙离子通道或KCNQ2通道一起使用的 刺激溶液依赖于离子通道对细胞膜的静息电位的敏感性。对于使用此类电压依赖性离子通 道的方法，刺激溶液可包含用于使膜去极化的激活剂，例如离子载体、缬氨霉素等。刺激缓冲液(其经选择用于与一些电压依赖性离子通道一起使用，以通过细胞膜 的去极化来进行活化作用)以使装有细胞的孔中的钾离子的终浓度在大约10_150mM的范 围内(例如50mM KCl)的浓度包含钾盐。此外，电压依赖性离子通道还可通过电刺激或光 活化的刺激物来刺激，例如量子点纳米晶或在细胞表面上表达的光敏离子通道的光激发就 是这样的情况。选择用于与通道偶联受体和配体门控离子通道一起使用的刺激缓冲液取决于已 知激活此类受体的配体。例如，已知烟碱型乙酰胆碱受体被尼古丁或乙酰胆碱激活；类似 地，毒蕈碱乙酰胆碱受体可通过加入毒蕈碱或氨甲酰胆碱来激活。用于与此类系统一起使 用的刺激缓冲液可包含尼古丁、乙酰胆碱、毒蕈碱或氨甲酰胆碱。在某些实施方案中，刺激 物是能够激活GIRK钾离子通道以允许铊流入的G蛋白偶联受体的激动剂。在其他实施方 案中，刺激缓冲液可包含可引起离子通道去极化的组合物。去极化组合物可包括例如试剂 例如离子载体、缬氨霉素或钾盐。细胞膜的去极化可通过使用细胞表面上的光激活的离子 通道例如通道视紫红质或盐细菌视紫红质或光激活的量子点纳米晶来实现。刺激缓冲液中的铊可以以任何形式存在，但其主要以盐的形式存在，从而提供了 铊离子。在某些实施方案中，铊的来源是盐。用于在本发明的方法中使用的铊溶液的铊盐 包括水溶性的铊盐，例如但不限于T12S04、T12C03、TlCl、T10H、T10Ac、TlNO3盐等。在某些实 施方案中，铊盐可溶于加样缓冲液。
刺激缓冲液中的铊可以以非常低的浓度存在，因为本发明的铊指示剂对于非常低 浓度的铊敏感。因为铊可以以低浓度存在，因此铊离子可在本文中描述的缓冲液中保持可 溶而无论氯化物的浓度如何。通常，刺激缓冲液中的铊(例如，铊离子)以低于大约4.5mM 的浓度存在。在某些实施方案中，铊浓度可以低于大约4. OmM。在其他实施方案中，铊浓度 可以低于大约3.0mM。在其他实施方案中，铊浓度可以是2. 5mM或更低。在某些实施方案 中，铊(例如，铊离子)的浓度可以是大约0. ImM至大约2mM，并且加样缓冲液以大约IOmM 至大约150mM的浓度包含氯离子。在某些实施方案中，铊(例如，铊离子)的浓度可以是大 约0. ImM至大约4mM，并且加样缓冲液以大约IOmM至大约150mM的浓度包含氯离子。本发 明的某些方法使用具有浓度为大约ImM至大约IOmM的铊的刺激缓冲液和以大约IOmM至大 约150mM的浓度包含氯离子的加样缓冲液。在其他实施方案中，铊的浓度可以是大约2mM 至大约5mM并且加样缓冲液以大约IOmM至大约150mM的浓度包含氯离子。在其他实施方 案中，铊以大约5mM至大约20mM的浓度存在并且加样缓冲液以大约IOmM至大约150mM的 浓度包含氯离子。在其他分开的实施方案中，加样缓冲液以大约50mM至大约150mM的浓度 包含氯离子，并且铊(例如，铊离子)的浓度可以是大约0. ImM至大约2mM;或大约0. ImM至 大约4. OmM ；或大约ImM至大约IOmM ；或大约2mM至大约5mM ；或大约5mM至大约20mM。铊 和氯化物的其他浓度也可用于本发明的方法。在另一个方面，提供了包括铊指示剂、加样缓冲液(其包含铊指示剂和生理浓度 的氯离子)和铊(例如，铊离子)的溶液。溶液中铊浓度通常小于4. OmM，但溶液也可包含 更高水平的铊。例如，溶液的铊浓度可在大约0. ImM至大约20mM的范围内。例如，溶液的铊 浓度可以是大约0. ImM至大约2mM ；或大约0. ImM至大约4. OmM ；或大约ImM至大约IOmM ； 或大约2mM至大约5mM ；或大约5mM至大约20mM。溶液的氯化物的浓度可以是大约150mM 或更低并且可以在大约IOmM至大约150mM、或大约50mM至大约150mM、或大约IOOmM至大 约150mM的范围内。在一个实施方案中，铊浓度低于4. OmM并且氯离子浓度为50mM至大约 150mM。铊指示剂以足以检测铊离子的存在的量存在于溶液中。铊敏感性试剂和铊离子转运入细胞内后，环境敏感性试剂的信号增强或减弱。铊 离子沿着它们的浓度梯度移动通过开放的通道并且改变细胞内的染料荧光的强度，从而导 致记录的信号。离子通道的活化增加了铊离子的流入速率(从而导致铊敏感性荧光化合物 的荧光的变化)，而抑制减少了铊离子的流入速率(从而导致铊敏感性荧光试剂的荧光无 变化或极小的变化)。通常，如果无铊离子与其结合，荧光保持不变。在本发明的方法中检测或测量环境敏感性试剂的至少一个光学特性。如之前提及 的，如果使用荧光染料，可测量或检测荧光染料的任何光学特性以测定铊流入或流出。荧光 染料的光学特性的实例包括但不限于荧光染料的发光的强度、极性和频率。如果非荧光染 料用作检测试剂，则待检测的试剂的光学特性也可以是强度、极性和频率。在本发明的一个 特定方面，当例如试剂与铊反应在细胞本身内形成产物或沉淀(其可增加细胞本身的光密 度)时，测量或检测试剂的光学特性包括测量细胞本身的光密度。如果使用荧光染料，则可利用检测荧光信号的装置例如但不限于分光光度计、显 微镜等来测量铊敏感性试剂的荧光。在一个特定的实施方案中，使用标准96孔板读数器 检测和/或测量染料的荧光。另一个类型的装置是荧光成像板读数器，例如FLira装置 (MolecularDevices Corp.，Sunnyvale, CA)，其中在加入铊离子和加入候选离子通道、通道偶联受体或离子转运蛋白调节剂之前、期间和之后以达到IHz的速度记录荧光。用于非贴 壁细胞的装置的实例包括FLira装置和流式细胞仪(Becton-Dickinson)。用于检测或测量 试剂的光学特性的装置和方法的更多实例包括但不限于光学显微镜检查、共聚焦显微镜检 查和荧光显微镜检查。在本发明的一个实施方案中，测定通道偶联受体的活性，其中受体的激活起始随 后的细胞内事件(其导致离子通道活性的调节)。本发明还提供了用于鉴定调节离子通道、通道偶联受体或离子转运蛋白的活性的 化合物的方法。在本发明的测定中基本上任何化合物可用作潜在的调节剂。在特定的实施 方案中，可将候选化合物溶于水性或有机(例如基于DMSO的)溶液中。本领域技术人员将 认识到，存在许多化合物的商业提供商，包括Sigma Chemical Co. (St. Louis,MO) ,Aldrich Chemical Co. (St. Louis,M0)>Sigma-Aldrich(St. Louis,M0)>Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs, Switzerland)等。因此如果离子通道被候选通道调节剂阻断并且铊流 入被抑制，则检测到极小的荧光变化或检测不到荧光变化。本发明还提供了用于检测铊通过离子通道的流出的方法。一般地，评估铊流出的 方法包括使用本领域技术人员已知的方法用铊装载含有离子通道的细胞。例如，可将细胞 与含有铊(例如，铊离子)的溶液(例如，缓冲液)组合，并且温育足以将铊载入细胞的时 间。可以任选地清洗载铊细胞以除去过量的铊。然后向细胞中加入包含铊指示剂和生理浓 度的氯离子的溶液，并刺激细胞的离子通道例如以引起铊通过离子通道的流动。可使用不 能透过离子通道的铊指示剂，这样指示剂不能进入细胞。在刺激细胞后，铊指示剂的检测提 供了关于离子通道的活性的信息。在某些实施方案中，检测铊指示剂的光学特性。流出测定(effluxassay)可使用与流入测定中相同的细胞，并且可用产生信号的 铊敏感性荧光试剂(如本文中所描述的)例如BTC进行装载。可用于所述流出测定的指 示剂的另外的实例包括但不限于Magnesium Green、Fluo_4FF、FluoZin-I或FluoZin-2、 RhodZin-3、ANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI、Phen Green 或 Mag-Fura Red 或其衍生物或盐。 将细胞与铊接触以装载细胞。一个实施方案提供了将细胞与铊离子接触大约15分钟。可 清洗细胞以除去过量铊离子，并使用与流入测定中使用的相同的检测信号变化的仪器例 如 FluorometricImage Plate Reader (FLIPR)(Molecular Devices Corp. , Sunnyvale, California, USA.)进行测定。通过加入许多配体中的任一种，或通过改变细胞的膜电位， 例如通过改变钾浓度来刺激测定通道打开，以允许离子通过离子通道流出。例如，流出可导 致BTC的荧光减弱。其他化合物例如对照化合物可与流入测定中使用的相同。除了如上所 述用铊离子预装载细胞，并且清洗细胞除去过量铊离子外，在本发明的方法中使用与用于 流入测定的条件相同的条件。在本文中提供的铊流入和流出测定中，铊指示剂可以是本文中描述的任何化合 物。在某些实施方案中，铊指示剂是在铊敏感性测定中展示25%或更大的荧光强度变化的 荧光化合物，如实施例3中所描述的。某些对单价和二价阳离子(例如Zn2+或Ca2+)敏感 的铊指示剂在铊敏感性测定中检测为阳性，其特别适用于本发明的基于荧光的铊流入和流 出测定。此类荧光铊指示剂的代表性实例包括具有夹氧杂蒽部分的化合物(例如，FluoZin 1、FluoZin 2、FluoZin 3、FluoZin 4、Red Fluo_4FF、Magnesium Green、Phen Green、 RhodZin-3或其衍生物或盐)；具有苯并呋喃部分的化合物例如Mag-Fura Red或其衍生物或盐；具有萘部分的化合物(例如，ANTS)或具有冠醚部分的化合物(例如，PBFI)。可在某 些情况下使用用乙酰氧甲基酯部分取代的基于荧光夹氧杂蒽、苯并呋喃、萘和冠醚的化合 物(例如，以将化合物保留在细胞内)。取于铊的形式和存在的氯离子的量，可能期望使用 包括香豆素部分的荧光铊指示剂(例如，BTC或APTRA-BTC或其衍生物或盐)。在一个方面，提供了用于检测细胞中离子通道的活性的方法，该方法包括a)提 供具有离子通道的细胞；b)给细胞提供加样缓冲液，所述加样缓冲液包含铊指示剂和生理 浓度的氯离子(例如，大约50mM至大约150mM) ；c)给细胞提供刺激缓冲液，其中刺激缓冲 液包含铊，并且其中提供刺激缓冲液引起铊通过离子通道流入细胞；和d)检测铊指示剂。 铊浓度可低于大约4. 5mM。用于本方法的铊指示剂可以是包含夹氧杂蒽部分的荧光化合物 (例如，FluoZin 1、FluoZin 2、FluoZin3、FluoZin 4、Red Fluo_4FF、Magnesium Green、 Phen Green、RhodZin-3或其衍生物或盐)。备选地，铊指示剂可以是包含苯并呋喃部分的 荧光化合物，例如Mag-Fura Red或其衍生物或盐；包含萘部分的荧光化合物(例如，ANTS) 或包含冠醚部分的荧光化合物(例如，PBFI)。在另一个方面，提供了用于检测细胞中离子通道的活性的方法，该方法包括a) 用铊装载细胞，其中细胞包含离子通道；b)给细胞提供溶液，所述溶液包含铊指示剂和生 理浓度的氯离子(例如，大约50mM至大约150mM) ；c)刺激细胞的离子通道以引起铊通过 离子通道流出；和d)检测铊指示剂。在装载后，细胞中铊浓度可以低于大约4. 5mM。用于 本方法的铊指示剂可以是包含夹氧杂蒽部分的荧光化合物(例如，FluoZin UFluoZin 2、 FluoZin 3> FluoZin 4> Red Fluo_4FF、MagnesiumGreen、Phen Green、RhodZin-3 或其衍生 物或盐)。备选地，铊指示剂可以是包含苯并呋喃部分的荧光化合物，例如Mag-Fura Red或 其衍生物或盐；包含萘部分的荧光化合物(例如，ANTS)或包含冠醚部分的荧光化合物(例 如，PBFI)。本发明的方法还可适合于高通量筛选方法，从而能够大规模筛选候选离子通道调 节剂。高通量筛选测定是已知的，并且利用微量滴定板或皮_、纳_或微_升阵列。通过在微量滴定板等上实施本发明的方法，可使用表达目的离子通道、离子通道 和通道偶联受体或离子转运蛋白的完整细胞来进行本发明的高通量方法。可在贴壁或非贴 壁条件下培养细胞。向细胞中加入靶化合物作为预处理，然后向细胞中加入刺激缓冲液，并 例如检测荧光。可检测的信号变化表示板上特定孔中的通道调节剂的作用。设计本发明的测定以允许大化学文库的高通量筛选，例如通过使测定步骤自动 化并且向测定提供来自任何合适来源的候选调节化合物。在自动化测定中，在固体支持 物(例如微量滴定板上的微量滴定版式(microtiter format))上平行进行的测定是熟知 的。用于检测和/或测量光学检测中的变化的自动化系统和方法也是熟知的(美国专利 6，171，780 ；5，985，214 和 6，057，114)。本发明的高通量筛选方法包括提供包含大量潜在的治疗性调节化合物的组合文 库(Borman, S，C. & E. News, 1999，70 (10)，33-48)。组合化学文库的制备和筛选对于本领域 技术人员来说是熟知的。组合化学文库是通过使用化学合成或生物合成组合许多化学构建块(chemical building block)例如试剂而产生的不同化合物的集合。例如，线性组合化学文库，例如多 肽文库，可通过以几乎每一种可能的方式组合一组氨基酸至给定的化合物长度(即，多肽化合物中的氨基酸数目)来形成。可通过这样组合混合化学构建块来合成数百万种化合 物。本发明还提供了用于检测细胞中离子通道的活性的试剂盒。在一个特定的实施方 案中，试剂盒包括染料、可包含氯化物的测定缓冲液和刺激缓冲液。可将缓冲液的单独的成 分和染料冷冻干燥或以一些其他脱水形式贮存，其中可将组分水合入原液或工作液。本发 明的试剂盒实际上可包含上文所示或本文中其他地方描述的组分的任何组合。用于检测细 胞中离子通道的活性(例如，铊流入)的一个示例性试剂盒包括a)包含铊指示剂和生理 浓度的氯离子的加样缓冲液；和b)包含铊的刺激缓冲液，其中刺激缓冲液引起铊通过离子 通道流入细胞。用于检测细胞中离子通道的活性(例如，铊流出)的另一个示例性试剂盒 包括a)包含铊(例如，铊离子)的铊加载溶液；和b)包含铊指示剂和生理浓度的氯离子 的溶液(例如缓冲液)。如本领域技术人员将认识到的，本发明的试剂盒提供的组分将随试 剂盒的期望的用途而变化。因此，可设计试剂盒以进行本申请中所示的各种功能，并且相应 地改变此类试剂盒的组分。上文中已提供了本发明的详细描述，给出下列实施例用于举例说明本发明的目 的，其不应当解释为对本发明或权利要求的范围的限定。
实施例
实施例1
铊流入测定
下列是可用于本发明的一些方法的组分的实例。
组分A:
每瓶=FluoZin-IAM 酉旨(Invitrogen) 1-20 μ g
冻干并贮存于一次性使用的15mL小瓶中
组分B :5X测定缓冲液=Ix 25mL
每瓶50%体积IOX HBSS12. 5mL
10% 体积 IM HEPES2. 5mL
40%体积水IOmL
组分C :5X不含氯化物的刺激缓冲液Ix 25mL
每瓶700mM葡糖酸钠3. 82g
12. 5mM葡糖酸钾73mg
9mM葡糖酸钙96. 7mg
5mM葡糖酸镁51. 7mg
IOOmM HEPES2. 5mL IM
水22. 5mL
组分D 浓缩的(125mM) K2SO4)容液Ix 20mL
每瓶125mM硫酸钾435mg
水20mL
组分E 浓缩的(50mM) Tl2SO4)容液Ix 20mL
每瓶50mM硫酸铊505mg
水20mL组分F: 100X Ix ImL每瓶PLURONICF12720_100mgPLURONIC P855_20mg水ImL将包含离子通道的细胞培养至大约75%汇合并且处于对数生长期中。然后使用 熟知的细胞培养技术和缓冲液收获细胞，将其以例如2xl05个细胞/孔的密度再涂板至96 孔板中。细胞可包含内源离子通道，或可对细胞进行工程改造以包含特定类型的离子通道。 转染和/或转化细胞以表达特定类型的蛋白质的方法在本领域内是熟知的并且不必在本
文中重复。为了制备加样缓冲液，将一瓶组分A温热至室温，向加样缓冲液中加入IOOuL组 分F以溶解染料并且携带其穿过质膜进入细胞。在涡旋上述混合物后，加入2mL组分B，5x HBSS (Hank' s缓冲盐溶液)，然后加入8mL H2O0接着，在96孔板中从细胞吸走细胞培养基，并用IOOuL加样缓冲液/孔进行替换。 遗留在孔中的培养基将在染料进入细胞前促进染料水解。在装载后，遮蔽微量培养板以免受直接光照射，并且在室温下温育60至120分钟。 在加样缓冲液中进行相似的时间后，在测定的板之间进行最佳比较。在温育细胞的同时，按照下列制备含有25mM K2SO4和IOmM Tl2SO4的刺激缓冲液 将2mL水与ImL组分C(5X不含氯化物的缓冲液)、ImL组分D (125mM K2SO4)、ImL组分E (50mM Tl2SO4)组合。该配方将产生刺激缓冲液，其以1 5稀释入微量培养板中，从而产生终浓 度IOmM的游离钾离子和终浓度4mM的游离铊⑴离子。然后，设置“化合物板”并进行测定。首先，将刺激缓冲液倒入槽器(trough)以分 配入化合物板。通过使用8通道移液器，每化合物板列加入150ul刺激缓冲液，用于以25uL/ 分配覆盖4个微量培养板列。任选地，在加入刺激缓冲液后清洗细胞以除去细胞外的铊。然 而，可在使用或不使用清洗步骤(以除去过量铊)的情况下进行本发明的方法。然后，在分光光度计上读取荧光。用488nm处的光激发样品，在525nm处读取发射， 滤波片截断值为515nm。读取时间设置为90至300秒之间的任何时间，以5秒的间隔读数。实施例2用hERG离子通道转染的细胞的测定使用本发明的方法测定用hERG离子通道转染的细胞。在含有0. 5uM FluoZin-IAM 酯的测定缓冲液中装载细胞，然后用IX稀释度的刺激缓冲液(组分C，包含25mM K2SO4和 IOmM Tl2SO4)刺激细胞。“对照”是tet-刺激的hERG 293T Rex细胞，“无tet”迹线(trace) 是未经刺激以表达hERG的细胞。将刺激物以25uL的体积递送至细胞(加至IOOuL以进 行5倍稀释)。在该特定的实施例中，细胞上铊的终浓度为大约4mM。图1显示用hERG离 子通道转染的并且使用本发明的方法测定的细胞的吸光度曲线(以dF/F作为时间的函数 进行作图)。图 2 描述了使用 FLUXOR Thallium NW检测试剂盒(InvitrogenCorporation, Carlsbad, CA)在96孔板中测量的用hERG离子通道转染的细胞(四环素诱导的和无四环 素诱导的)的hERG活性(钾离子刺激的时间由箭头显示)。实施例3
铊敏感性测定提供了评估化合物对铊⑴的敏感性的测定。可将对铊⑴具有足够的敏感性的 化合物用作铊指示剂用于测量铊通过离子通道的流入和流出。在IOmM HEPES缓冲液，pH 7. 4中制备10 μ M的荧光化合物溶液。通过在化合物的最大激发波长上激发来测量最大荧 光发射强度。在分光荧光计中的比色杯中或在荧光微量培养板读数器中的微量培养板的孔 中进行测量。向荧光化合物溶液中加入不断增加量的硫酸铊的贮存水溶液(stock aqueous solution)，从而铊(I)的终浓度为0、5、10、50、100、500、1000和200(^]\1。在每一次加入硫 酸铊溶液后，测量荧光强度，并将其与在铊(I)不存在的情况下获得的强度相比较。在整个 铊(I)的浓度范围内，25%或更大的总体荧光强度变化表明，化合物具有足够的铊(I)敏感 性，其有待在用于测量铊通过离子通道的流入和流出的测定中进一步评估。在本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开案、美国专利申请、外国专 利、外国专利申请和非专利公开案以其全文通过引用合并入本文。如果需要，可对实施方案 的方面进行改动以使用不同专利、申请和公开案的概念来提供另外的实施方案。根据上述描述，可对实施方案进行这些或其他改变。总地来说，在下列权利要求 中，使用的术语不应当解释为将权利要求限定于本说明书和权利要求书中公开的特定实施 方案，而应当解释为包括所有可能的实施方案以及针对其赋予这样的权利要求的等价物的 全部范围。因此，权利要求书不受公开内容限制。
2权利要求
用于检测细胞中离子通道的活性的方法，该方法包括a)提供具有离子通道的细胞；b)给所述细胞提供加样缓冲液，所述加样缓冲液包含铊指示剂和生理浓度的氯离子；c)给所述细胞提供刺激缓冲液，其中所述刺激缓冲液包含铊，并且其中提供所述刺激缓冲液引起铊通过离子通道流入细胞；和d)检测所述铊指示剂。
2.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂在细胞内与铊结合。
3.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂具有在铊存在或不存在的情况下发生变化的 光学特性。
4.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂是当与铊离子结合时展示荧光的增强的化合物。
5.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂是当与铊离子结合时展示细胞内光密度的变 化的化合物。
6.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂是疏水性的。
7.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂是亲水性的。
8.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂包括乙酰氧甲基酯部分。
9.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂是环境敏感性荧光染料。
10.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂是非荧光化合物。
11.权利要求10的方法，其中所述铊指示剂与铊结合以形成沉淀或有色产物。
12.权利要求10的方法，其中所述铊指示剂是选自碘化物、溴化物和铬酸盐的离子。
13.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂在铊离子存在的情况下展示荧光强度的减弱。
14.权利要求13的方法，其中所述铊指示剂是ANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI,Phen Green、APTRA-BTC 或 Mag-Fura Red 或其衍生物或盐。
15.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂在铊离子存在的情况下展示荧光的增强。
16.权利要求15的方法，其中所述铊指示剂是MagnesiumGreen、Fluo-4FF、FluoZin_l 或FluoZin-2、RhodZin-3或其衍生物或盐。
17.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂是在铊敏感性测定中展示25%或更大的荧 光强度变化的荧光化合物。
18.权利要求17的方法，其中所述铊指示剂是对单价或二价阳离子敏感的荧光化合物。
19.权利要求18的方法，其中所述铊指示剂是Zn2+或Ca2+指示剂。
20.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂包含夹氧杂蒽部分。
21.权利要求20的方法，其中所述铊指示剂是FluoZin1、FluoZin2、FluoZin 3、 FluoZin 4、Red Fluo-4FF> Magnesium Green、PhenGreen、RhodZin-3 g胃tiL$ife。
22.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂包含香豆素部分。
23.权利要求22的方法，其中所述铊指示剂是BTC或APTRA-BTC或其衍生物或盐。
24.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂包含苯并呋喃部分。
25.权利要求24的方法，其中所述铊指示剂是Mag-FuraRed或其衍生物或盐。
26.权利要求1的方法，其中所述铊指示剂包含萘部分。
27.权利要求26的方法，其中所述铊指示剂包含冠醚部分。
28.权利要求1至27的任一项的方法，其中所述铊指示剂包含乙酰氧甲基酯部分。
29.权利要求1的方法，其中所述加样缓冲液的氯离子浓度大于大约2mM。
30.权利要求1的方法，其中所述加样缓冲液的氯离子浓度为大约5mM至大约20mM。
31.权利要求1的方法，其中所述加样缓冲液的氯离子浓度大于大约20mM至大约 IOOmM0
32.权利要求1的方法，其中所述加样缓冲液的氯离子浓度为大约50mM至大约150mM。
33.权利要求1的方法，其中氯离子的来源是NaCl或KCl。
34.权利要求1的方法，其中铊以盐的形式存在。
35.权利要求34的方法，其中铊盐可溶于所述加样缓冲液中。
36.权利要求34的方法，其中铊盐选自T12S04、T12C03、TlCl、T10H、TlOAc和T1N03。
37.权利要求1的方法，其中所述刺激缓冲液以低于大约4.OmM的浓度包含铊。
38.权利要求1的方法，其中所述刺激缓冲液以低于大约3.OmM的浓度包含铊。
39.权利要求1的方法，其中所述刺激缓冲液以大约0.1至大约2. OmM的浓度包含铊。
40.权利要求1至39的任一项的方法，其中所述刺激缓冲液以大约0.ImM至大约2. OmM 的浓度包含铊，并且所述加样缓冲液以大约50mM至大约150mM的浓度包含氯离子。
41.权利要求1至39的任一项的方法，其中所述刺激缓冲液以大约2.OmM至大约5. OmM 的浓度包含铊，并且所述加样缓冲液以大约50mM至大约150mM的浓度包含氯离子。
42.权利要求1的方法，其还包括定量铊的水平。
43.权利要求42的方法，其中定量铊的水平包括测量所述铊指示剂响应铊流入的至少 一个光学特性。
44.权利要求43的方法，其中所述铊指示剂的至少一个光学特性是强度、极性、频率或光笛、度。
45.权利要求1的方法，其中通过光学显微镜检查、共聚集显微镜检查、荧光显微镜检 查或分光光度法检测所述铊指示剂。
46.权利要求1的方法，其还包括在给细胞提供加样缓冲液后清洗细胞。
47.权利要求1的方法，其中所述方法不包括在给细胞提供加样缓冲液后清洗细胞。
48.权利要求47的方法，其还包括向加样缓冲液中加入猝灭剂。
49.权利要求48的方法，其中所述猝灭剂是基本上不通透细胞的。
50.权利要求48的方法，其中所述猝灭剂是酒石黄、苋菜红、酸性红37、刚果红、台盼 蓝、亮黑或其组合。
51.权利要求1的方法，其还包括用刺激物刺激离子通道。
52.权利要求51的方法，其中所述刺激物是结合离子通道的配体、通道偶联受体或电 刺激。
53.权利要求51的方法，其中所述刺激物是能够活化GIRK钾离子通道以允许铊流入的 G蛋白偶联受体激动剂。
54.权利要求51的方法，其中所述刺激物是尼古丁、乙酰胆碱、毒蕈碱、carbamyline或 GIRK钾离子通道激活剂。
55.权利要求51的方法，其中所述刺激物包含引起离子通道的去极化的组合物。
56.权利要求55的方法，其中所述组合物包含离子载体、缬氨霉素或钾盐。
57.权利要求55的方法，其中所述组合物包含通道视紫红质、盐细菌视紫红质或量子 点纳米晶。
58.用于检测细胞中离子通道的活性的方法，该方法包括a)用铊装载细胞，其中细胞包含离子通道；b)给细胞提供溶液，所述溶液包含铊指示剂和生理浓度的氯离子；c)刺激细胞的离子通道，从而引起铊通过离子通道的流出；和d)检测所述铊指示剂。
59.权利要求58的方法，其还包括清洗细胞以除去过量的铊。
60.权利要求58的方法，其中所述离子通道对于所述铊指示剂是不可通透的。
61.用于检测细胞中离子通道的活性的方法，该方法包括a)将细胞与加样缓冲液接触，其中所述细胞包含离子通道，并且其中所述加样缓冲液 包含铊指示剂和生理浓度的氯离子；b)给所述细胞提供刺激缓冲液，其中所述刺激缓冲液包含铊，并且其中提供所述刺激 缓冲液引起铊通过离子通道流入细胞；和c)检测所述铊指示剂。
62.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述离子通道选自钾离子通道、与受体连接 的离子通道、通道偶联受体和离子转运蛋白。
63.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述离子通道是配体或电压门控的离子通 道、牵张激活的阳离子通道、或选择性或非选择性阳离子通道。
64.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述细胞选自细菌细胞、酵母细胞、植物细胞 和动物细胞。
65.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
66.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述细胞包含钾通道。
67.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述细胞是神经元、心肌细胞、癌细胞或平滑 肌细胞。
68.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述细胞是永生化细胞。
69.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述离子通道对于铊离子是可通透的。
70.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述铊指示剂选自ANTS、Fluo-4、Fluo_3、 PBFI> Phen Green、Magnesium Green、Mag-Fura Red Fluo_4FF、FluoZin-1 禾口 FluoZin-2、 RhodZin-3或其衍生物或盐。
71.权利要求1-61的任一项的方法，其中所述铊指示剂是选自ANTS、Fluo-4、Fluo-3、 PBFI、Phen Green、Magnesium Green、Mag-Fura Red、Fluo_4FF、FluoZin-1、RhodZin-3 禾口 FluoZin-2或其盐的化合物的乙酰氧甲基(AM)酯衍生物。
72.用于检测细胞中离子通道的活性的试剂盒，该试剂盒包含a)加样缓冲液，其中所述加样缓冲液包含铊指示剂和生理浓度的氯离子；和b)刺激缓冲液，其中所述刺激缓冲液包含铊，并且其中所述刺激缓冲液引起铊通过离 子通道流入细胞。
73.用于检测细胞中离子通道的活性的试剂盒，该试剂盒包括a)铊加载溶液，其中所述溶液包含铊；和b)加样缓冲液，其中所述加样缓冲液包含铊指示剂和生理浓度的氯离子。
74.用于检测细胞中离子通道的活性的溶液，其包括a)铊指示剂；b)生理浓度的氯离子；和c),它。
75.权利要求74的溶液，其中所述溶液中铊浓度小于4.5mM。
76.权利要求74的溶液，其中所述溶液中铊浓度为大约0.ImM至大约4mM。
77.权利要求74的溶液，其中所述溶液中铊浓度为大约0.ImM至大约2mM。
78.权利要求74至77的任一项的溶液，其中所述溶液中氯离子浓度为大约IOmM至大 约 150mM。
79.权利要求74至77的任一项的溶液，其中所述溶液中氯离子浓度为大约50mM至大 约 150mM。
全文摘要
本发明涉及用于检测细胞中离子通道的活性的方法。该方法包括对具有离子通道的细胞提供加样缓冲液。加样缓冲液包含至少一种铊指示剂(例如，环境敏感性发光染料)和生理浓度的氯离子。该方法还包括给细胞提供刺激缓冲液，其中刺激缓冲液包含铊(例如，铊离子)。提供刺激缓冲液引起铊通过离子通道流入细胞。在提供刺激缓冲液后，检测细胞中染料的发光(例如，荧光)。染料的发光可在铊存在或不存在的情况下发生变化。本方法可用于测量铊通过离子通道的流入或流出。
文档编号G01N33/50GK101971024SQ200880117916
公开日2011年2月9日 申请日期2008年10月15日 优先权日2007年10月15日
发明者D·碧查姆, K·吉 申请人:生命技术公司