专利名称：绿脓杆菌的ⅲ型分泌系统构成蛋白质pa1698的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对绿脓杆菌的III型分泌系统构成蛋白质PA1698的抗体和含有该抗体的药物组合物，绿脓杆菌感染症诊断剂，绿脓杆菌感染症治疗剂，和绿脓杆菌的检测试 剂盒。此外，本发明还涉及含有PA1698蛋白质或其肽作为抗原的疫苗组合物。
背景技术：
绿脓杆菌(铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))是广泛分布于土壤、水等 自然环境中的革兰氏阴性杆菌，其引起抵抗治疗的严重致命感染。绿脓杆菌的主要目标是 包括烫伤、器官移植或癌症患者在内的，一般被称为易感染宿主(compromised host)的生 物体防御功能衰弱的易感染性患者，绿脓杆菌是院内感染的主要病原菌。此外，由这种细菌 引起的肺部感染症对囊性纤维化患者是致命的。对这些患者主要施用具有抗绿脓杆菌活性 的抗菌剂，而众多病例则因绿脓杆菌耐药性而未能获得充分的治疗效果。另外，人们也早已 对绿脓杆菌的疫苗或抗体进行了研究。然而，直接使用该细菌灭活形式的方法具有缺点，即 必须根据绿脓杆菌的不同血清型制备不同类型的疫苗或抗体。在这种情况下，期待利用具有绿脓杆菌菌株间共同氨基酸序列的绿脓杆菌来源 的蛋白主动免疫或被动免疫来预防或治疗绿脓杆菌感染。作为将绿脓杆菌来源的蛋白质 应用于疫苗的实例，已知有外膜蛋白质OprF和OprI的部分融合的重组蛋白(日本特开第 245699/1996 号公报)和 IV 型菌毛蛋白(W02004/099250)。就以绿脓杆菌来源的蛋白质作为靶向的抗体药物，目前已经报道了，抗IV型 菌毛蛋白抗体(W02004/099250号公报)、抗PA1706 (或PcrV)抗体(US6309651号公 报和US6827935号公报)、抗PA5158抗体(W02007/049770号公报)、抗PA0427抗体 (W02007/114340 号公报)等。然而，在显示多样血清型的绿脓杆菌临床分离株间共同拥有的菌体来源的蛋白由 于可以作为“绿脓杆菌共同抗原”应用于预防、诊断或治疗绿脓杆菌感染症，因此一直是需 要的。由 PA1698(或 PopN)基因(Genebank 登录号 AF010150)编码的 PA1698 蛋白 质是构成绿脓杆菌的III型分泌系统的蛋白质(Journal ofBacteriology，2007，189， 2599-2609)。所谓III型分泌系统，是病原细菌使病原因子直接移行到宿主细胞质内时使 用的系统，由约30种蛋白质构成。这其中，已经报道了抗PA1706(或PcrV)抗体有防御感 染作用(US6309651号公报、US6827935号公报)。然而，并不知道PA1698蛋白质在株间发生何种程度变异，没有使用该蛋白质或部 分肽作为疫苗的成分的例子，也没有使用由该蛋白质或部分肽产生的抗体作为感染治疗药 或诊断剂的例子。
发明内容
本发明的课题在于提供具有实质上预防或治疗绿脓杆菌感染能力的抗体和疫苗组合物，它们能够应对来自绿脓杆菌感染患者的临床分离株的多样性本发明人为了解决上述课题，试图从绿脓杆菌的外膜蛋白质中探寻新的有用的 “绿脓杆菌共同抗原”，进行了各种研究，结果通过基因芯片(GeneChip)分析发现，编码绿脓 杆菌的III型分泌系统构成蛋白质PA1698(又名PopN)蛋白质的基因无论是否存在人血 清，都稳定地表达(实施例1)。此外，还对93株绿脓杆菌临床分离株实施了基因分析，令人 惊奇的是，PA1698蛋白质在约70%的临床分离株中氨基酸序列完全保守，余下的约30%的 临床分离株中也只发现1、2处氨基酸变异(实施例2)。此外，还确认了，通过免疫PA1698 重组蛋白质获得的抗体与PA1698蛋白质结合(实施例7 9)、该抗体呈现细胞损伤性抑制 作用(实施例10)、该抗体在绿脓杆菌感染模型小鼠中呈现高防御感染效果(实施例11和 12)。也就是说，本发明发现，绿脓杆菌的III型分泌系统构成蛋白质PA1698蛋白质作 为绿脓杆菌共同抗原是有用的，针对该抗原的抗体与绿脓杆菌结合，能够对绿脓杆菌感染 发挥优异的防御效果，从而完成了本发明。本发明更详细的是，涉及以下的发明。<1>与绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质结合的抗体或其功能片段。<2>根据<1>所述的抗体或其功能片段，其中绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质为以 下(i)或(ii)中所述的蛋白质(i)含有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；(ii)含有序列号2所示的氨基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了 1个或多个氨 基酸的氨基酸序列，且与由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白 质。<3>根据<1>所述的抗体或其功能片段，结合至绿脓杆菌表面。<4>根据<1>所述的抗体或其功能片段，具有抑制绿脓杆菌对人呼吸道上皮细胞 的细胞损伤活性的活性。<5>根据<1>所述的抗体或其功能片段，在绿脓杆菌感染的患者中具有抗菌活性。<6>根据<5>所述的抗体或其功能片段，在处于中性白细胞减少的状态的患者的 绿脓杆菌感染中具有抗菌活性。<7>根据<1>所述的抗体或其功能片段，与由以保藏号FERM BP-11055或FERM BP-11056保藏的杂交瘤产生的抗体的表位结合。<8> 以保藏号 FERM BP-11055 或 FERM BP-11056 保藏的杂交瘤。<9>能够用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，其包含含有能够 产生针对绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质的抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物，和 根据情况1种以上的药学上可允许的载体、稀释剂和/或佐剂。<10>根据<9>所述的疫苗组合物，其中所述绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质为以下 (i)或(ii)所述的蛋白质(i)含有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；(ii)含有序列号2所示的氨基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了 1个或多个氨 基酸的氨基酸序列，且与由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白 质。
<11>根据<9>所述的疫苗组合物，其中所述与绿脓杆菌相关的疾病是由绿脓杆菌 感染引起的全身感染疾病。<12>能够用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的药物组合物，其包含<1>_<7> 任一项所述的抗体或其功能片段和根据情况1种以上的药学上可允许的载体和/或稀释 剂。<13>根据权利要求<12>所述的药物组合物，其中所述与绿脓杆菌相关的疾病是 由绿脓杆菌感染引起的全身感染疾病。<14>绿脓杆菌感染症诊断剂，包含<1> <3>任一项所述的抗体或其功能片段。<15>绿脓杆菌的检测试剂盒，包含<1> <3>任一项所述的抗体或其功能片段。
用于实施发明的最佳方式
[抗体]本发明提供了识别绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质或其部分的抗体或其功能片 段。发现本发明的抗体结合的绿脓杆菌的PA1698蛋白质在无论血清型等如何的菌株间， 其氨基酸序列的保守性都极高(实施例2)。因此，作为本发明的抗体靶向的绿脓杆菌的 PA1698蛋白质优选是序列号2所示的氨基酸序列PAOl株来源的蛋白质、或含有序列号2所 示的氨基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列，且与由序 列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。氨基酸序列的取代、缺失、 插入或添加一般是1 2个氨基酸。典型的是1 2个氨基酸的取代。本发明的抗体优选通过以能够诱发抗体的量对实验动物施用(免疫)含有纯化的 PA1698蛋白质作为抗原的抗原组合物来获得。对从心脏或动脉采血并分离后获得的抗血清 进行纯化后，可以作为纯抗体使用。本发明的抗体包括以PA1698蛋白质作为抗原，对小鼠等哺乳动物免疫该抗原而 获得的多克隆抗体或单克隆抗体(包括产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤所产生的单克 隆抗体)，采用基因重组技术制造的嵌合抗体和人源化抗体，以及使用产生人抗体的转基因 动物等制造的人抗体。本发明的抗体作为药物施用给人时，从减少副作用的观点考虑，理想 的是人抗体。所谓“人抗体”，是所有区域为人来源的抗体。本发明的人抗体可以采用本领域 技术人员公知的方法制造(例如，可以参照Intern. Rev. Immunol，1995，13，65-93 ;J. Mol. Biol，1991，222，581-597 ；特开平10-146194号公报、特开平10-155492号公报、特许 2938569号公报、特开平11-206387号公报、特表平8-509612号公报、特表平11-505107号 公报等)。“人源化抗体”，是只将小鼠抗体的抗原结合部位(CDR ；互补决定区)的基因序列 移植到人抗体基因中(CDR移植)的抗体。本发明的人源化抗体可以采用本领域技术人员 公知的方法制造(例如，可以参照EP239400、W090/07861号公报等)。“嵌合抗体”是将某种抗体的可变区和与其异种的抗体的恒定区连接的抗体。具体 可以通过，对小鼠免疫抗原，从该小鼠单克隆抗体的基因中切出与抗原结合的抗体可变部 位(V区域)，与人骨髓来源的抗体恒定部位(C区域)基因结合来制备。本发明的嵌合抗体 可以采用本领域技术人员公知的方法制造(例如，可以参照特开平8-280387号公报、美国 专利第4816397号公报、美国专利第4816567号公报、美国专利第5807715号公报等)。
本发明的单克隆抗体可以采用本领域技术人员公知的方法制造(可以参照 例如 Antibodies A LABORATORY MANUAL Ed Harlow, DavidLane Cold Spring Harbor Laboratory 1988、单克隆抗体实验手册(1987)讲谈社、富山朔二等人编、单克隆抗体杂交 瘤和ELISA(1987)讲谈社、岩崎辰夫等人编等)。本发明的多克隆抗体还可以采用本领域技 术人员公知的方法制造。本发明的“功能片段”，是指抗体的一部分(部分片段)，特异性识别本发明的蛋白 质的部分。具体可以列举，Fab、Fab，、F(ab，)2、可变区片段(Fv)、二硫键结合的Fv、单链抗 体(scFv)、和它们的聚合物等。本发明的抗体，可以在绿脓杆菌感染的治疗或诊断中使用，或者作为研究用试剂 使用。这种抗体包括识别PA1698蛋白质且结合至绿脓杆菌表面的抗体。作为结合至绿脓 杆菌表面的优选抗体，进行实施例8中记载的完整细胞ELISA试验时，其吸光度显著高于对 照。在纯化IgG级分的情形时，其优选吸光度在0.3以上，更优选在0.5以上，进一步优选 在0. 8以上 ，进一步更优选在1. 0以上(例如1. 2以上、1. 4以上)。在本发明的抗体应用于绿脓杆菌感染的方案中，提供了在绿脓杆菌感染的患者中 具有抗菌活性的抗体或其功能片段。这种方案中，作为特别优选的抗体，可以列举针对含有 序列号2所示的氨基酸序列或具有1个或多个保守取代的序列号2所示氨基酸序列的蛋白 质的抗体或其功能片段。一旦，在特别指定了对绿脓杆菌具有抗菌活性的抗体的情况下，本领域技术人员 通过指定该抗体识别的肽区域，可以制备出与该区域结合，并显示出相同活性的各种抗体。 作为这样的抗体的优选例子，可以列举与以FERM BP-11055或FERM BP-11056的保藏号进 行了保藏的杂交瘤所产生的抗体的表位结合的抗体。绿脓杆菌感染的患者，可以是例如经各种药剂给药或放射线治疗等，处于中性白 细胞减小状态的患者。通过本发明的抗体，对容易发展成重症感染的这种患者也能发挥效 果，这点是有利的。另外，感染患者的绿脓杆菌，可以是多药耐性绿脓杆菌。本发明的抗体， 对通常使用的抗生物质无法治疗的多药耐性绿脓杆菌所感染的患者，也能够显示出有效 性。此外，在弥漫性泛细支气管炎(DPB)或囊性纤维化病(CF)等慢性呼吸道感染病 中，呼吸道上皮细胞的粘液(粘蛋白)过度分泌引起呼吸道堵塞，这成为预后不良的重要原 因。绿脓杆菌是慢性呼吸道感染的主要病原菌。本发明的抗体，由于能够抑制绿脓杆菌对 人呼吸道上皮细胞的细胞损伤活性，因此在慢性呼吸道感染的治疗中也能够发挥效果。作 为优选抗体，在进行实施例10中所述的实验时，人呼吸道上皮细胞的细胞死亡的抑制率在 10%以上，更优选15%以上，进一步优选20%以上。作为这种抗体，可以列举例如以FERM BP-11055、FERM BP-11056保藏的杂交瘤所产生的抗体。此外，本发明还提供了产生上述本发明的抗体的杂交瘤。作为优选的杂交瘤，可 以列举于2008年10月31日提交到独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心 (〒305-8566，日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)进行保藏的保藏号为FERM BP-11055 的杂交瘤(1698-1)、FERM BP-11056 的杂交瘤(1698-2)。[疫苗组合物]绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质可以作为蛋白质抗原使用，含有这种抗原的抗原组合物可以用作用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗。因此，本发明提供了含有能够产生针对绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质的抗体的抗原组合物的疫苗组合物。这里的 “抗原组合物”，可以是以蛋白质抗原作为唯一构成要素的组合物，也可以是还含有其它成 分的组合物。根据本发明，能够制造用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，该 组合物含有上述抗原组合物和根据情况1种以上药学上可允许的载体、稀释剂和/或佐剂。本发明的疫苗组合物中可以使用的载体基于施用模式和途径和实际的标准药物 制剂进行选择，有载体蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白 (HSA)、钥孔虫(，〃 7力、)来源的血蓝蛋白(KLH 钥孔虫戚血蓝蛋白)等)、溶解剂(例 如乙醇、聚山梨酸酯、CremophorEL(注册商标)等)、等渗剂、防腐剂、抗氧化剂、赋形剂(例 如乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露醇、麦芽糖、磷酸氢钙、轻质无水硅酸、碳酸钙等)、结合剂 (例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、阿拉伯胶等)、润 滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、氢化油等)、稳定剂(例如乳糖、甘露醇、麦芽糖、聚山梨酸酯、 Macrogol、聚氧乙烯氢化蓖麻油等)等。如有需要，还可以添加甘油、二甲基乙酰胺、70%乳 酸钠、表面活性剂或碱性物质(例如氢氧化钠、乙二胺、乙醇胺、碳酸氢钠、精氨酸、葡甲胺、 三氨基甲烷等)等。作为载体蛋白质的具体例子，可以使本发明的肽与公知的KLH溶液(Calbiotec公 司制，每毫升50%甘油溶液溶解125mg)偶联，以增强本发明疫苗组合物的抗原性。在本发明疫苗组合物中使用的稀释剂基于施用模式和途径和实际的标准药物制 剂而选择，可以列举，例如，水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、碳酸氢盐溶液等。在本发明疫苗组合物中使用的佐剂基于施用模式和途径和实际的标准药物制剂 而选择，可以列举，例如，霍乱毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、脂质体或免疫刺激性复合 体(ISC0M :immunostimulating complex)等。施用可以根据具有绿脓杆菌感染风险的施用对象的年龄、体重、性别和总体健康 状态而不同，但是施用可以通过经口施用和非经口施用(例如静脉施用、动脉施用、局部施 用)的任一途径来实施，但优选非经口施用。用于经口施用和非经口施用的剂型及其制备 方法是本领域技术人员众所周知的，其可以通过将本发明的抗原组合物与药学上允许的上 述载体等混合等方式，按照常规方法来制造。用于经口施用的剂型，可以列举固体或液体剂 型，具体为溶液剂、片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等。用于非经口施用的剂型可以列举溶液剂、 混悬剂、软膏剂、乳膏剂、栓剂、眼药剂、滴鼻剂和滴耳剂等。经口施用时，还可以添加香味剂 和着色剂。若需要本发明制剂的持续释放，则可以添加生物可降解聚合物(例如聚-D，L-丙 交酯共乙交酯、聚乙交酯等)作为增容基质(见例如美国专利5，417，986号公报、美国专利 4，675，381号公报、美国专利4，450，150号公报))。合适的药物载体和稀释剂等以及为了使用它们所需的医药上所需物质记载在 Remington' s Pharmaceutical Sciences 中。本发明疫苗组合物的施用量，由本发明人基于例如疫苗抗原的类型、本发明的抗 原是否与佐剂组合施用、与本发明抗原共同施用的佐剂的类型、施用模式和频率以及希望 的效果(例如预防或治疗效果)而确定，并且通常以每个成人每次Iyg-IOOmg的剂量施用本发明的疫苗组合物。当本发明疫苗与佐剂一起施用时，剂量可以通常是每个成人每次施 用Ing-Img剂量。这种剂量可以根据本发明人的决定按照需要重复施用数次。例如，可以 在实施初始接种后，接着进行间隔1周时间的后续3次加强接种。或者，可以使用相同的调 和剂，在首次免疫接种后第8 12周时进行加强注射，以及在第16-20周时进行第二次加 强注射[抗体的用途和药物组合物]与绿脓杆菌相关的疾病绿脓杆菌是因宿主抵抗力降低而造成致命后果的机会感染病原菌，而且，由于其 对抗生物质有抵抗性，因此也是医院内感染的主要病原菌。如稍后在实施例中显示，在巨 噬细胞功能因施用粘蛋白而降低的小鼠绿脓杆菌易感染性模型中，本发明的抗体确实具有 防御感染效果(实施例11)，另外在中性白细胞因施用一水合环磷酰胺而减少的小鼠绿脓 杆菌易感染性模型中，确认了本发明的抗体确实具有防御感染效果(实施例12)。此外，作 为本发明的抗体具有防御感染效果的理由之一，可以列举抑制绿脓杆菌导致的细胞损伤性 (实施例10)。因此，本发明的抗体对于与绿脓杆菌相关的疾病的预防或治疗有用。与绿脓杆菌相关的疾病，可以列举包括多药耐性绿脓杆菌在内的绿脓杆菌感染引 起的全身感染疾病，例如败血症、髓膜炎和心内膜炎等。还可以列举耳鼻科领域的中耳 炎和鼻窦炎；呼吸器官科领域的肺炎、慢性呼吸道感症、导管感染症；外科领域的术后腹膜 炎、术后胆道等发炎的术后感染症；眼科领域的眼睑脓肿、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜 脓肿、全眼球炎、眼眶感染；泌尿器官科领域的包括复杂的泌尿道感染症的泌尿道感染症、 导管感染症和肛周脓肿等。此外，还可以列举包括重度烧伤和呼吸道烧伤在内的烧伤、褥疮 感染症、囊性纤维化等。本发明提供了与绿脓杆菌相关的疾病的预防方法或治疗方法，其包括对包括人在 内的哺乳类施用预防上或治疗上有效量的本发明的抗体的工序。绿脓杆菌感染症诊断剂如稍后在实施例中所示，已经证实本发明的抗体与绿脓杆菌结合(实施例8)。这 些结果提示，本发明的抗体能够检测绿脓杆菌的存在。因此，本发明的抗体可以用作绿脓杆 菌感染症诊断剂。此外，本发明还提供了采用本发明的抗体的绿脓杆菌感染的诊断方法。本发明的诊断方法可以通过如下方式实施，即从包括具有绿脓杆菌感染风险的人 在内的哺乳动物中采集痰、肺洗出液、脓、泪、血液或尿等生物样本，然后将收集的样品与本 发明的抗体接触，判断是否发生抗原抗体反应。绿脓杆菌感染症诊断剂试剂盒根据本发明，提供了用于检测绿脓杆菌存在的试剂盒，其至少包含本发明的抗体。 本发明的检测试剂盒所含的抗体可以被标记。该检测试剂盒能够利用抗原抗体反应，检测 绿脓杆菌的存在。本发明的检测试剂盒，根据需要，还可以含有用于实施抗原抗体反应的各种试剂， 例如ELISA法等中使用的第二抗体、发色试剂、缓冲液、说明书和/或器具等。药物组合物 本发明的药物组合物或药剂可以以本发明的抗体作为有效成分来使用，优选可以以含有纯化的抗体组合物和任意成分如生理盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液等的组合 物的形式使用。本发明的药物组合物可以根据需要配制成液体或冷冻干燥的形式，此种药物组合 物可以任选地含有药学上允许的载体，例如稳定剂、防腐剂和等渗剂(isotonic agent)等。作为药学上允许的载体，在冷冻干燥制剂的情形时，可以列举甘露醇、乳糖、蔗糖、 人白蛋白等，在液状制剂的情形时，可以列举生理盐水、注射用水、磷酸盐缓冲液、氢氧化铝 等。但并不限于这些实例。施用可以根据施用对象的年龄、体重、性别和总体健康状态而不同，但是施用可以 通过经口施用和非经口施用(例如静脉施用、动脉施用、局部施用)中的任一种施用途径来 施用，优选是非经口施 用。药物组合物的施用量根据患者的年龄、体重、性别和总体健康状态、绿脓杆菌感染 症的程度和施用的抗体组合物的成分而不同。本发明的抗体组合物，静脉内施用时，通常是 对成人Ikg体重1日施用0. 1-lOOOmg，优选施用l-100mg。本发明的药物组合物优选事先施用至具有绿脓杆菌感染风险的患者。当制备为诊断剂时，可以通过采用适合此目的的任意手段以任意剂型获得。例如 测定腹水、含有目的抗体的培养液或经纯化抗体的抗体滴度并且以PBS(含有生理盐水的 磷酸缓冲液)等适度地稀释，并且随后对其添加作为防腐剂的0.1%叠氮钠等。或者，测定 吸附至乳胶等的本发明抗体的抗体滴度并且适度地稀释，并对其添加防腐剂再使用。前述 这样的与乳胶粒子结合的本发明抗体是作为诊断剂的优选剂型之一。在这种情况下，适宜 的树脂材料例如聚苯乙烯、聚甲基苯乙烯、聚丁二烯等是作为乳胶而适用的。
实施例本文中此后，本发明将按照用于促进理解本发明的实施例进行说明，然而，本发明 将不限于这些实施例。< 实施例 1 :GeneChipK 分析 >使用GeneChipK表达分析系统(Affymetrix公司制GeneChipK铜绿假单孢菌基因 组阵列)作为用于探索人血清添加培养基中表达的基因的方法。使用绿脓杆菌PAOl菌株， 在2种培养条件即0%、50%人血清添加Luria-Bertani (LB)培养基(Nacalai Tesque公司 制)(最终的LB培养基组成是均一的)中在37°C实施振荡培养直至吸光度在595nm处达到 1.0，使用RNeasy Protect Bacteria Mini试剂盒(QIAGEN GmbH公司制)，按所附文件的 方法，提取总RNA，并使用2100生物分析仪(Agilent Technologies公司制)定量。然后， 按照GeneChipK所附文件的方法进行实验。使用Microarray Suite 5. 0 (Affymetrix公司 制)分析基因表达数据，并且计算信号及检测。在此时，实施校正，使来自全部探针组的信 号的平均值是1000。实施了两次独立的实验。结果是，在任一培养条件下，无论添加的血清存在或不存在，将显示检测到转录产 物确定为作为持家蛋白的PA4761蛋白(DnaK或HSP70)是“存在”的，表明该基因表达 了。此外，确定作为与PA5158 (OpmG)和PA2019 (MexX)蛋白结合以构成药物排出泵的内膜 跨越蛋白并受到核糖体抑制剂例如四环素或氨基糖苷类抗生素诱导的PA2018蛋白(MexY) (J. Bacteriology, 2005,187, 5341-5346)在没有前述那些药物的这些条件下是“不存在”的，并且因此表明基因不表达。另一方面，在任一培养条件下，无论添加的血清存在或不存在，确定PA1698基因是“存在”的。由以上表明PA1698基因的确表达了，且提示其基因产物PA1698蛋白质可能稳定 地存在。<实施例2 分析临床分离株中的PA1698基因>所用菌株是分离自日本各地临床机构的多种类型临床材料的93株绿脓杆菌(明 治制果株式会社，贮藏于横滨研究所)，将这些菌株提供给试验。这些菌株源自血液、尿、痰、 脓、咽粘液等，基于绿脓杆菌研究会主办的分型研究委员会的决定(1975年)作出的血清学 分类，它们的血清型包括A群、B群、E群、G群、I群、M群等。(1)基因组DNA的制备93株临床分离的绿脓杆菌，于Mueller-Hinton培养基(BectonDickinson公司 制)中37°C培养过夜，再通过低速离心来收集。使用DNeasy组织试剂盒(QIAGEN GmbH公 司制)，根据随该试剂盒所附的文件中描述的方法，从获得的菌体中制备基因组DNA。(2)通过PCR方法扩增DNA片段以制备的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增了含有PA1698基因的区域。具体是， 基于绿脓杆菌PAOl菌株的基因组序列(NCBI数据库中登录号NC_002516)为基础，设计特 异性扩增PA1698基因的引物组(序列号3、序列号4)，按照Takara ExTaq(Takara bio株 式会社制)中所附说明书，使用GeneAmp PCR System 9700 (Applied BioSystems公司制)， 实施PCR。通过琼脂糖凝胶电泳确认了通过PCR扩增的DNA片段具有目的大小(1128个碱 基对)。(3)使用DNA测序仪分析多核苷酸序列PCR 产物使用 MultiScreen PCR 板(Millipore Corporation 公司制)纯化后， 提供给测序反应。以PAOl株的基因组序列(NC_002516)为基础，设计能够测序各PCR产 物的引物(序列号5 序列号7)，测序反应中使用BigDye Terminator vl. 1循环测 序试剂盒(Applied BioSystems公司制)。测序反应按所附的说明书，用GeneAmp PCR System 9700 (AppliedBioSystems公司制)实施。使用事先以水溶胀的S印hadex G_50Fine DNAGrade (Amersham Biosciences AB 公司制)所填充的 MultiScreen-HV 板(Millipore Corporation公司制)纯化测序反应产物后，使用AppliedBiosystems 3730 DNA分析仪 (Applied Biosystems公司制)分析多核苷酸序列。将经上述分析判明的临床分离株的多核苷酸序列转换成多肽序列，并与PAOl株 的多肽进行比较研究，结果发现了 PA1698蛋白质的全长序列中有15处变异(表1)。但是，我们确认约70%的临床分离株中氨基酸序列完全保守，剩下的约30%中只 有1、2处氨基酸变异，存在对所有绿脓杆菌都保守的区域。由此提示，绿脓杆菌的PA1698 蛋白质作为“绿脓杆菌共通抗原”是有用的。表1临床分离株中PA1698蛋白质的突变模式
权利要求
与绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质结合的抗体或其功能片段。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，其中绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质为以 下(i)或(ii)中所述的蛋白质(i)含有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；( )含有序列号2所示的氨基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了 1个或多个氨基酸 的氨基酸序列，且与由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，结合至绿脓杆菌表面。
4.根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，具有抑制绿脓杆菌对人呼吸道上皮细胞 的细胞损伤活性的活性。
5.根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，在绿脓杆菌感染的患者中具有抗菌活性。
6.根据权利要求5所述的抗体或其功能片段，在处于中性白细胞减少的状态的患者的 绿脓杆菌感染中具有抗菌活性。
7.根据权利要求1所述的抗体或其功能片段，与由以保藏号FERMBP-11055或FERM BP-11056保藏的杂交瘤产生的抗体的表位结合。
8.以保藏号FERMBP-11055或FERM BP-11056保藏的杂交瘤。
9.能够用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，其包含含有能够产生针 对绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质的抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物，和根据情 况1种以上的药学上可允许的载体、稀释剂和/或佐剂。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中所述绿脓杆菌来源的PA1698蛋白质为以 下(i)或(ii)所述的蛋白质(i)含有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质；(ii)含有序列号2所示的氨基酸序列中，取代、缺失、插入或添加了1个或多个氨基酸 的氨基酸序列，且与由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。
11.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中所述与绿脓杆菌相关的疾病是由绿脓杆 菌感染引起的全身感染疾病。
12.能够用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的药物组合物，其包含权利要求1-7 任一项所述的抗体或其功能片段和根据情况1种以上的药学上可允许的载体和/或稀释 剂。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述与绿脓杆菌相关的疾病是由绿脓杆 菌感染引起的全身感染疾病。
14.绿脓杆菌感染症诊断剂，包含权利要求1-3任一项所述的抗体或其功能片段。
15.绿脓杆菌的检测试剂盒，包含权利要求1-3任一项所述的抗体或其功能片段。
全文摘要
目的在于提供具有实质上预防或治疗绿脓杆菌感染能力的、能够应对绿脓杆菌感染患者来源的临床分离株的多样性的抗体和疫苗组合物。根据本发明，提供了针对绿脓杆菌的III型分泌系统构成蛋白质PA1698蛋白质或其肽的抗体以及含有这些蛋白质或肽的疫苗组合物。
文档编号G01N33/53GK101970468SQ20088012286
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月24日 优先权日2007年12月25日
发明者二宫智尚, 大塚圭子, 熊谷正志, 田中二朗, 赤羽宏友, 铃木贵久, 长曾宏 申请人:明治制果株式会社