用于进行cvd风险评估的生物化学标志物的制作方法

专利名称：用于进行cvd风险评估的生物化学标志物的制作方法
用于进行CVD风险评估的生物化学标志物本发明涉及检测对心血管疾病诊断目的和疾病发展预后有价值的生物化学标志 物的测定，其包括指示由发生动脉粥样硬化和斑块不稳定性所导致的心血管事件风险的生 物化学标志物。心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是世界范围内致病及死亡的首要原 因。目前，尚没有允许诊断并将患者归类为不同风险组以及允许诊断低风险患者的有效且 非介入性的诊断方法。诊断和预后工具主要由简单标志物的多变量分析构成，例如年龄、吸 烟情况和多种脂质和脂蛋白的浓度。CVD涵盖数种临床综合征，主要有心绞痛、心肌梗死(冠状动脉栓塞)和中风。所 有这些综合征通常都是复杂动脉粥样硬化的后遗症。动脉粥样硬化开始于童年阶段的内膜增厚，并发展成为动脉内膜中的脂肪条纹， 这些病变分别表征为I型和II型。脂肪条纹是动脉粥样硬化发展过程中最早的宏观可见病 变，其在所有种族和社会的几乎所有人类中发生。在非致病状态下，内皮细胞(endothelial cell, EC)对白细胞的粘附性相互作用有抗性。但是，动脉粥样化形成过程中动脉壁中促 炎症细胞因子以及积累的氧化脂蛋白的作用引发粘附分子的表达，例如主动脉EC表面上 的细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule, ICAM)-1和血管细胞粘附分子 (vascular cell adhesion molecule，VCAM)_1。这使得白细胞能被内皮表面捕获并移行进 血管壁的内膜部分。斑块的发生包括发生移位和凋亡的平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)个数的增加，其导致基质周转(turnover)增加。受损的胶原蛋白合成可导致纤维帽削 弱并产生更易于破裂的动脉粥样硬化斑块；但是，大多数研究者认为，蛋白水解酶例如基质 金属蛋白酶(matrix metallo-protease,MMP)及其它蛋白酶的作用对斑块破裂的风险有重 要的贡献(Clarkson 和 Kaplan 509-28)。斑块可分为两种不同类型“脆弱的”和“稳定的”斑块。但是，对于详细的组织学 分析和对分子的认识，经常使用更详细的分类。斑块的发生有三个主要阶段起始、脂肪条 纹和复杂/晚期斑块(Stary H. C.)。动脉粥样硬化斑块在动脉内膜内发生，并可根据其组成和结构进行分类。这种分 类将病变分为8个类型(Stary H. C.)I.内膜中载有脂滴并被其增大的巨噬细胞(巨噬细胞源性泡沫细胞)增多。II.巨噬细胞源性泡沫细胞与内膜SMC内的脂滴一起在蛋白聚糖层深部积累。泡 沫细胞层以脂肪条纹的形式可见。在II型病变中，单核细胞通过单核细胞趋化蛋白(主要 是MCP-1)穿透内皮细胞层，所述趋化蛋白在人粥样斑中过表达。早期病变类型(I型和II 型)可以在婴儿期开始，但不一定导致斑块破裂。此外，动脉粥样硬化的发展可以在形成 III型病变之后结束，斑块的形成是无法预测的(Stair H. C.)。III. III型病变确定为处于脂肪条纹(II型)和粥样斑(IV型)之间的中间病变。 这些病变还含有胞外脂质的混合物，由此使得内膜深部肌肉弹性层中通常紧密相邻的SMC 之间的间距扩大。物质混合物可取代通常位于这里的蛋白聚糖和胶原纤维，但是这在动脉 粥样化形成的这一阶段造成的影响很小。
IV.粥样斑是动脉粥样硬化的第一个临床体征。细胞外脂质混合物的积累所导致 的动脉内膜中SMC的移位以及内膜结构的破坏是IV型病变的标志。脂质核心的形成是这 种SMC移位的最终结果。脂质核心的形成导致壁增厚加剧。脂质核心是内膜深处大且界限 明确的区域，在此处动脉壁这一部分的正常结构成分已经被致密堆积的泡沫细胞残留物、 游离脂滴、胆固醇晶体和钙颗粒所取代。在动脉粥样硬化发展的这一阶段，在正常情况下位 于该区域中的SMC减少或者完全失去。任何残留的SMC开始广泛分散，产生长形细胞体，并 且常常具有异常厚的基底膜。在此阶段，开始形成覆盖在脂质核心上的层。该层由富含胶 原蛋白和蛋白聚糖的细胞间基质、含和不含脂滴的SMC、巨噬细胞和泡沫细胞组成。V.对IV型病变的应答是形成修复性纤维组织基质，形成纤维“帽”。通常，这些病 变会由彼此不规则堆叠的脂质核心和修复性组织的层组成。另外，诸如血肿和血栓形成等 事件可额外并发这些病变类型。如果不致命，则这些病变并发症整合到病变中，其上长出修 复性基质组织的薄层，其由胶原蛋白和蛋白聚糖组成。在形成所述帽的过程中，动脉粥样硬 化斑块中细胞外基质蛋白胶原和蛋白聚糖的含量增加。VI.内皮的缺损例如裂隙、磨蚀、溃疡、血肿、血栓、出血在并发情况下可导致更复 杂的病变类型，称为VI型病变。VII.该病变经常称为钙化病变，其中病变中超过50%由矿物质组成。除了钙化之 外，这些病变还含有丰富的修复性纤维结缔组织。当滞留于此的SMC发生凋亡和崩解时，它 们的矿化细胞器变成钙化的一部分。VIII.钙化病变之后是纤维化病变。纤维化病变可完全由胶原蛋白组成，不含脂 质。(Stary H. C.)心血管事件经常是斑块破裂的结果，其中炎症与蛋白酶的释放减弱了纤维帽的肩 部区域，使得斑块中的脂肪物质与血液相接触，沉淀形成附壁血栓(Clarkson和Kaplan)。 蛋白酶活性增加连同基质产生的减少导致纤维帽变薄，这被认为是斑块不稳定的标志， 其增加了破裂的风险。斑块的脆弱性及其破裂的风险是临床上关注的领域。脆弱斑块 (vulnerableplaque, VP)的没有标准定义，但是一般认可与稳定斑块相比存在三种组织学 标志1)更大的脂质核心( >全部病变的40% )。2)更薄的纤维帽(65-150微米)。3)大量急性炎性细胞。定义VP的主要标准包括活跃的炎症(存在单核细胞、巨噬细胞和T细胞)、具有 大脂质核心的薄帽、伴随表面血小板凝集的内皮剥蚀、有裂隙的斑块以及>90%的动脉狭 窄。其它次要标准包括表面钙化结节、斑块内出血、内皮功能障碍以及向外的重塑(Shin， Edelberg 禾口 Hong)。斑块复杂性、不稳定性和破裂可以通过医学治疗和/或生活方式的改变来抑制。 但是，在一些情况下，可能需要更为介入性的方法，即血管成形术或旁路手术。目前，诊断工具是基于仍处于开发之中的静态图象分析，或者基于低技术的方法 例如与CVD风险相关的心脏收缩压和舒张压水平。该领域一直致力于开发可更好地鉴别 高风险患者的多变量分析。一个这样的模型是SCORE模型(系统性冠状动脉风险评价 (Systematic Coronary RiskEvaluation)模型)。1994年，欧洲动脉粥样硬化学会、欧洲心脏病学学会和欧洲高血压学会发表了有关预防冠状动脉心脏疾病的一组建议，并于2003 年进行了修订。此指南是基于几种评价技术，其已开发用于评估无症状对象中的CVD风险， 即鉴定无症状的高风险患者。SCORE模型整合了性别、年龄、吸烟情况、收缩压和总胆固醇或 胆固醇/HDL比值作为风险因素(Graham等)。为了作出更详细的诊断，SCORE模型是不够的，因此使用了成像技术。因此，主要 对高风险组中的患者或者在研究期间使用成像方法。成像技术冠状动脉血管造影术(Coronary angiography, CAG)是目前用于确定狭窄程度的 金标准成像技术。CAG在两个维度上对血管腔成像，但是其仅限于腔，而非管壁，因此CAG不 能区分有稳定斑块的动脉和有脆弱斑块的动脉。CAG常用于确定患者是否需要手术、血管成 形术或旁路手术。为了确定腔狭窄位点是否是晚期斑块，需要其它技术，即血管内冠状动脉 超声(intravascular coronary ultrasound，IVUS)或血管镜。IVUS提供了斑块和血管壁的二维截面图，被认为是适合表征血管壁以及钙化的形 态和程度的方法，但是不适于评估病变中的脂质。但是，IVUS是介入性的，需要专业技术和 一定的费用，因此其使用并不广泛。血管镜检是另一种了解和鉴定动脉粥样硬化的有用方 法。血管镜直接观察斑块表面，并且能够检测斑块颜色和血栓形成。但是，血管镜检是介 入性的并且在技术上十分困难，目前为止尚不能检测斑块延伸的程度。目前受到许多关注 的另一种成像技术是磁共振成象(MRI)。MRI是非介入性的，并且能够鉴定具有高中风风 险的颈动脉斑块。另一方面，由于斑块尺寸小和冠状动脉的位置，MRI不是用于对冠状动脉 成像的最佳技术。其它成像技术正在开发之中，即弹性成像术(elastography)、热成像术 (thermography)和光学相干断层成像术(Schaar等)。所提到的成像技术都处于开发之中，并且均无法单独地鉴定脆弱斑块，但是它们 可用于了解破裂之前的分子事件和斑块周转。目前，在早期阶段诊断CVD的唯一机会是利 用目的患者以及患者近亲中产生冠心病、外周动脉疾病和脑血管动脉粥样硬化疾病的一组 风险因素。现有生物化学标志物目前，已知有几种生物化学标志物是动脉粥样硬化的风险因素。最近，人们致力于 测量血清中的生物化学标志物浓度；脂质例如总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和炎性标志物例如C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、 白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-18 (IL-18)、肿瘤坏死因子-α (TNF α )、CD40、CD40配体 (CD40L)等。在脂蛋白标志物中，有至少两个重要的进展。LDL颗粒的大小似乎预示了动脉粥样 硬化发展的程度。相比于大颗粒浓度的增加，小LDL颗粒浓度的增加与CVD风险更加相关 (Gardner，Fortmann, and Krauss) 0HDL-C水平与甘油三酯强相关，高甘油三酯水平与CHD高风险相关。J印pesen等 的群体研究(2003)发现高TG/低HDL-C是IHD (ischemicheart disease，缺血性心脏病) 最强的风险因素Oppesen等)。脂质谱对于风险因素的评价来说非常重要，但是无法了解和测量与斑块周转相关 的分子事件。已经有建议将许多生物化学标志物作为CVD的风险因素，尽管这不是该疾病的特异性产物。它们包括CRP和骨钠尿肽(Bone natriuretic ρ印tide，BNP)(参见表1)。
表1总结了一些已知的CVD标志物。
肌酐磷酸激酶 (CK-MB)酶可用作心肌梗死的早期检 测。髓过氧化物酶 (MPO)血红素酶活化金属蛋白酶并促进斑块 失稳。肌球蛋白血红素蛋白在组织坏死时释放。CD40L蛋白质在动脉粥样化的早期阶段 通过斑块破裂而被释放。在 中风中升高。肌钙蛋白T(TnT)蛋白质风险分级的工具心脏型脂肪酸结合 蛋白(H-FABP)蛋白质H-FABP在梗死后立刻从心 脏释放微白蛋白尿蛋白质血管内皮功能障碍的标志物低密度脂蛋白胆固 醇(LDL-C)脂蛋白在血液中运输胆固醇高密度脂蛋白胆固 醇(HDL-C)脂蛋白具有抗氧化剂和抗炎特性甘油三酯脂质PIIINP前胶原III型胶原蛋白周转的标志物 表1 目前CVD中生物化学标志物的选择因此，已经提出将一组不同生物化学标志物作为心血管事件的标志物。Wang等 (2006)测定了参与Framingham研究的3200位患者的10种不同生物化学标志物，其记载于 表1。结论是，对10种生物化学标志物的测量仅对高于标准风险因素的诊断有一定贡献。 在10种生物化学标志物中，B型钠尿肽水平、C反应蛋白水平和尿白蛋白/肌酐比值显示出 标志物与死亡/心血管事件之间的最高相关性(Wang等)。C反应蛋白C反应蛋白(CRP)是肝脏应答于不同临床状况例如炎症、感染或外伤而产生的急 性期血清蛋白(Gabay&Kushner 1999)。CRP的产生是由受损或病变组织释放的细胞因子例 如IL-6诱导的。CRP的生理作用仍然未知，对其促炎症或抗炎症作用的讨论一直在进行。
有越来越多的证据证明，CRP是人类CVD的风险因素。在Ridker等(2002)的研究 中，在由28000位健康妇女组成的大群体中对急性心肌梗死、中风、冠状动脉血运重建或者 CVD所致死亡的发生进行了八年随访，显示CRP是比LDL胆固醇更好的未来心血管事件的预 测物。许多其它研究也报道，基线CRP水平构成了心血管事件的独立风险因素(Thompson等 1995，Mendall 等 1996，Kuller 等 1996，Ridker 等 1997，Tracy 等 1997，Ridker 等 2000)。已有推测认为，循环CRP仅反映动脉粥样硬化过程中发生的一般性炎症，而不是 疾病发病的活性组分。但是，也有一些证据支持这种观点，即CRP在动脉粥样化形成中有作 用。首先，产生CRP的慢性感染也与CVD风险增加相关(Leinonen&Saikku 2002)。其次，我们 和其他人在不同程度的动脉粥样硬化病变中鉴定到CRP(Reynolds&Vance 1987，Hatanaka 等1995)。最后，CRP已显示出在体外具有促动脉粥样化特性CRP可活化内皮细胞产生粘 附分子(Pasceri等2000)。其还可降低内皮细胞中eNOS的产生(Venugopal等2002)并增 加巨噬细胞对LDL的摄取(Zwaka等2001)。脑钠尿肽脑(B型)钠尿肽(BNP)是由心室应答于心室中心肌细胞过度拉伸而分泌的肽类 激素。在切割ProBNP后，T-proBNP (无活性的N端片段)与活性激素(BNP) —起被释放到 血流中。BNP和NT-proBNP都已被建议用作潜在的心血管事件生物化学标志物(Wang等)。趋化因子趋化因子也是潜在的CVD标志物；趋化因子是在炎症中产生的低分子量细胞因 子。与CVD相关的一种主要趋化因子是单核细胞趋化蛋白I(MCP-I)。MCP-I似乎在将单核 细胞募集到动脉粥样硬化病变中起到早期且重要的作用。在使用猴动脉粥样硬化模型的研 究中，MCP-I的血浆浓度与斑块大小和斑块并发症高度相关(Register等)。包括胆固醇的脂质最近，许多人着眼于测定血清中的胆固醇浓度；总胆固醇以及低密度脂蛋白胆固 醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的浓度。在脂蛋白标志物中，至少有两个重要 的进展。首先，LDL颗粒的大小似乎预测了动脉粥样硬化发展的程度。相比于大颗粒浓度 的增加，小LDL颗粒浓度的增加与CVD风险更加相关(Gardner等)。其次，LDL颗粒的胆 固醇油酸酯含量可能是CVD风险特别重要的标志物。在猴中，含有胆固醇油酸酯的脂蛋白 颗粒核心的富集与更严重的冠状动脉动脉粥样硬化强烈正相关(Rudel等)，并且对LDL和 HDL胆固醇浓度的贡献有加合性。另外，这些实验动物中的发现也得到了更早的人类研究 (Lawrie等)的支持了，其显示与正常对照相比，具有低比例胆固醇亚油酸酯的血浆脂蛋白 (相反，具有高比例的胆固醇油酸酯)常见于具有CHD(coronary heart disease，冠心病) 并发症的患者。HDL-C水平与甘油三酯强相关，高甘油三酯水平与更高的CHD风险相关。Jeppesen 等的群体研究发现高TG/低HDL-C是IHD (缺血性心脏病)最强的风险因素。这些脂质谱对于风险因素的评价来说非常重要，但是不能了解和测量与斑块周转 相关的分子事件。已经提出将许多生物化学标志物作为CVD的风险因素，尽管不是该疾病 的特异性产物。它们包括CRP和ApoE。脂蛋白最常用于预测CVD的生物标志物是胆固醇浓度(总胆固醇和胆固醇/HDL比值)。它们与其它风险因素(例如血压和LDL水平)一起使用。在之前提到的SCORE模型中同时 使用了这两种因素。LDL水平是重要的，因为LDL在血液中运输胆固醇，氧化LDL的积累可 促进动脉粥样硬化(Graham等)。另外，发现CHD与甘油三酯(TG)水平显著相关，其中CHD 风险的提高与TG水平提高相关，而不论LDL-C和HDL-C水平如何，但胆固醇水平仍被视为 CVD主要风险因素之一 Oppeson等)。APO-E载脂蛋白E可见于乳糜微粒、VLDL和HDL中。其主要在肝脏中合成，但也在许多 其它器官例如脑、脾、肾中合成(Siest等1995)。ApoE在脂蛋白代谢中起关键作用，这通过 作为两种受体(LDL受体和ApoE特异性乳糜微粒残余物受体)的配体来实现。ApoE与这些 受体之间的相互作用为胆固醇的代谢调节提供了基础。apoE基因座的多态性导致在大多数 人群中存在三个等位基因ε 2、ε 3和ε 4，其决定了六种apoE表型。同工型之间的差异是 112位和158位的一个氨基酸。ApoE2在两个残基处均为半胱氨酸，E4在两个位置均为精 氨酸。ApoE3在112位是半胱氨酸，在158位是精氨酸。等位基因的频率在不同的人群中是 不同的。一些研究评估了 apoE多态性与动脉粥样硬化之间可能的关系。14项观察研究的 综合分析证明，在男性和女性中ε 4等位基因都与冠心病相关联(Wilson等1996)。此外， ε 4等位基因已经与颈动脉动脉粥样硬化相关联(Terry等1996，Cattin等1997，Haraki 等 2002)。ApoE为299个氨基酸长，其将脂蛋白、脂溶性维生素和胆固醇运送进入淋巴系统， 并进一步运送进入血液循环。ApoE主要在肝脏中合成。目前，ApoE有七种哺乳动物受体， 其属于保守的低密度脂蛋白受体基因家族。其他生物化学标志物微白蛋白尿(白蛋白/肌酐的水平)也是潜在的独立标志物。尿白蛋白排泄率是 肾脏变化的标志物，与少量肌酐升高进行比较后，其可指示动脉粥样硬化(Wang等)。在前胶原蛋白标志物中，已研究将III型胶原蛋白周转率(PIIINP)的标志物作为 高血压的预后标志物，并已将其与心肌梗死相关联。Satta等研究了腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)与血液中前胶原(PIIINP)浓度的相关性。他们显示，在患有AAA的 患者中III型胶原蛋白的周转增加，这可能是由于合成增强、降解增强或其两者的组合。在 同一实验中，测定I型前胶原蛋白(PICP)的羧基端前肽，在动脉瘤囊中I型胶原蛋白没有 加速合成。斑块的蛋白质谱人动脉可以分为大动脉或弹性动脉、中动脉或肌肉动脉以及小动脉。动脉壁由内 膜、中膜和外膜构成，其由内弹性层和外弹性层隔开。内膜由结缔组织、平滑肌细胞和少量 分离的巨噬细胞组成。内膜的边界可以定义为内皮的腔表面与内弹性层之间的层。动脉内膜可进一步分为两层。内层称为蛋白聚糖层，由丰富的蛋白聚糖、平滑肌细 胞和巨噬细胞构成。下层(肌弹性组织层)由丰富的平滑肌细胞和弹性纤维构成。在正常 情况下，内膜的这两层在光学显微镜下几乎不可见，但是在发生内膜增厚时明显且显著。中 膜是动脉壁的肌肉部分，其由平滑肌细胞、弹性蛋白、胶原纤维构成。外膜(外层)是高度微血管化的，其含有胶原蛋白、弹性纤维、平滑肌细胞和淋巴 通道。
人动脉粥样硬化斑块的特征是纤维帽覆盖的富脂质核心，所述纤维帽由纤维状胶 原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和SMC构成。透明质多糖(hyaluronan)这种蛋白聚糖是细胞 外基质主要的非纤维成分，其具有通过调节诸如脂质积累、血栓形成和细胞增殖及迁移的 事件以及通过影响组织的材料特性来影响病变发生的潜力(Wight 1995)。也存在浸润的 ApoE和CRP，我们已经证明这两者在动脉粥样硬化疾病的不同阶段均位于冠状动脉粥样硬 化斑块中。ApoE和CRP在人中的分布下表2显示人体中ApoE和CRP的分布。表 2 下表3举例说明在体内和/或体外证明的ApoE和CRP与蛋白质的已知相互作用。表3 胶原蛋白在人类中的分布胶原蛋白在人体中分布很广，即胶原蛋白构成了人体中约30%的蛋白量。在表4 中，列出了主要的胶原蛋白类型及其主要组织分布。表4胶原蛋白类组织分布 型 I型胶原蛋白是最丰富的胶原蛋白，可见于多数结缔组织中。其对于骨和皮肤的结 构至关重要。人体中胶原蛋白的主要含量分布在皮肤和骨骼中，其中主要的胶原蛋白组分 是I型和III型胶原蛋白。III型胶原蛋白是大动脉的主要成分，还发现在富含I型胶原蛋 白的组织中有较少量存在。另外，IV型胶原蛋白可见于基底膜中以及血管和神经周围。V 型胶原蛋白最常见的定位是在特征性胶原纤维中，与I型和HI型胶原蛋白相关联(Garrone
寸J ο一些胶原蛋白具有有限的组织分布例如II型，其仅发现于软骨中(Mayne R.)。胶原纤维常由超过一种胶原类型组成。例如，I型胶原纤维经常含有少量的III 型、V型和XII型胶原蛋白，而软骨的II型胶原纤维还含有IX和XI型胶原蛋白。动脉中的胶原蛋白在动脉中，发现了六种类型的胶原蛋白(I、III、IV、V、VI和VIII型)，其中I型和 III型最为丰富，占胶原含量的80-90%。I型和III型在血管壁中也是占优势的。它们似 乎以不同的量共分布于动脉壁的全部三层中，I型和III型胶原的合成倾向于位于内膜中 (Mayne R)。斑块中的胶原和其它结构蛋白——周转在动脉粥样硬化斑块发展过程中，胶原蛋白在纤维帽中积累(StaryH.C.)。在 Katsuda等(1992)的研究中，在人主动脉组织的所有病变阶段的增厚内膜中发现了 I、III 和IV型胶原。VI型胶原蛋白分布在内膜细胞区域以及晚期病变的基底膜中，也在伸长的 SMC周围检测到。对I型和III型的早期研究提供了动脉粥样硬化壁中相同分布的证据 (Shekhonin等)。根据McCulIagh等(1980)，III型是正常人主动脉中膜中的主要胶原(可提取胶原的约70%)。Eriksen等(2006)最近的研究发现，人主动脉瓣中总胶原蛋白含量 根据狭窄程度而降低。认为狭窄的分子机制与动脉粥样硬化相似。在健康主动脉瓣中，胶 原组成主要是I型和III型。在狭窄过程中，胶原蛋白总含量降低，推测其是由于I型胶原 蛋白周转的增加。I型胶原蛋白占总胶原蛋白的约60-70%;而III型胶原蛋白的比例在健 康瓣膜和钙化瓣膜中都是30-40%。V型胶原蛋白也在晚期动脉粥样硬化病变中增加，其分布在主动脉中膜和斑块内 皮下区域的整个细胞外基质中(McCullagh等)。似乎一致的是，在动脉粥样硬化斑块中发现的主要胶原蛋白类型是I型和III型， 它们在健康的和动脉粥样硬化的血管中是否有相同的分布有待进一步研究。在Katsuda等(1992)的研究中，在更晚期病变的粥样斑中心未检测到胶原蛋白。弹性蛋白弹性蛋白是体内最稳定的蛋白质之一，其发现于大多数由其弹性和回弹力所致的 结缔组织中。弹性蛋白在动脉壁的蛋白质含量中占优势，其中它是主要的细胞外基质蛋白。弹性蛋白是弹性纤维的主要成分，并且与钙化相关。血管钙化在血管壁内两个不 同的部位发生内膜和中膜。内膜钙化涉及动脉粥样硬化，主要是在坏死的核心内。钙化的 弹性纤维构成了斑块的肩区，在此处斑块最易于破裂；表明弹性纤维的钙化可影响斑块的 稳定性(Bobryshev V. V.)。在动脉粥样硬化中，弹性纤维的含量随着脂质的沉积而降低，这 使得对弹性蛋白降解酶的敏感性提高。因此，与胶原蛋白相反，弹性蛋白含量随着病变的发 展而降低。弹性蛋白在人中的分布表5显示了人体中弹性蛋白的分布。表 5
蛋白质表达部位弹性蛋白主动脉及其它血管、肺、皮肤成纤 维细胞表6显示了体内和/或体外证明的弹性蛋白与蛋白质的已知相互作用。表6: 蛋白聚糖(PG)是主要定位于血管壁细胞间基质中的多糖_蛋白质大分子 (Salisbury和Wagner 1981)。PG是具有以下特征的大分子存在一个或多个称为GAG的 长的无支链高度多阴离子糖侧链，其通过连接区与核心蛋白质共价连接。GAG的重复单元由 氨基糖(N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)或者N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc))和己糖醛酸(葡 萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA))组成。所述重复单元中的一个或两个糖含有一个 或多个硫酸基团(Rodriguez-Lee 2007)。除了 GAG链之外，大多数核心蛋白质还带有N-和 /或0-连接的寡糖。PG的分类和命名PG是一组高度异质的大分子。一种类型的核心蛋白质在连接的GAG链的数目和类 型上可有所不同。链的长度和硫酸化残基沿链的排列也可不同。根据重复二糖单元的结构分为四个主要的GAG类别硫酸软骨素(CS)和硫酸皮肤 素(DS)；硫酸肝素(HS)和肝素；透明质多糖；以及硫酸角蛋白(KS)。透明质多糖是最简单的GAG。与所有其它的相反，它不含有任何硫酸化糖。其所有 二糖单元都是相同的，其链长非常长，不连接任何核心蛋白质。KS是硫酸化多聚半乳糖胺链。KS-I最先描述于角膜中，其与核心蛋白质中的天冬 酰胺残基N-连接，而KS-II或软骨KS与丝氨酸或苏氨酸残基0-连接(Funderburgh 2000)。可根据几个参数对PG进行分类-所连接的GAG链(含有CS/DS或HS的PG)-相对于细胞的拓扑分布(细胞外和基底膜PG，细胞相关PG或细胞内PG)-核心蛋白质同源性(透明凝集聚糖(hyalectan)，小的富亮氨酸PG(smal 1 leucine-rich PG, SLRP)硫酸软骨素/皮肤素PG (多功能蛋白聚糖(versican)、聚集蛋白聚糖 (aggrecan)、神经蛋白聚糖(neurocan)和短蛋白聚糖(brevican))属于透明质多糖结合蛋 白聚糖家族。此基因家族总称为透明凝集聚糖。每个家族成员具有特征性分布，聚集蛋白 聚糖在软骨中占优势，神经蛋白聚糖和短蛋白聚糖在中枢神经系统中占优势，多功能蛋白 聚糖在多种软组织包括动脉壁中存在。多功能蛋白聚糖的基因和蛋白结构符合结构域模 板。氨基端球形末端(Gl)结合GAG透明质多糖，羧基端球形结构域(G3)类似于选择素蛋 白家族，由与两个表皮生长因子(EGF)结构域和补体调节区域相邻的C型凝集素组成。多 功能蛋白聚糖核心蛋白质的中间区域由两个大外显子编码，其确定了多功能蛋白聚糖的CS 附着区域。外显子7编码的区域称为α GAG，而外显子8编码的区域称为β GAG。四种mRNA 转录本来自于多功能蛋白聚糖的选择性剪接，得到V0、V1、V2和V3，其核心蛋白质的长度以 及所连接GAG数目不同(Dours-Zimmermann和Zimmermann)。人多功能蛋白聚糖中潜在GAG 连接位点的数目为:V0为17-23个，Vl为12-15个，V2为5-8个，V3没有(Wight 617-23)。核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖是SLRP家族的成员，所述家族包含至少9个成 员，其分为三类(I、II和III)以及不同的亚家族。它们全都具有下述特征存在含有富亮 氨酸重复的中央结构域，以实现强蛋白质-蛋白质相互作用。核心蛋白聚糖和双糖链蛋白 聚糖是I类的成员，显示最高的家族氨基酸同源性(约57% )，是仅有的具有前肽的SLRP。 所述前肽在物种间高度保守，可作为木糖基转移酶的识别序列，该酶是参与GAG链合成的 第一种酶。
多功能蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖是哺乳动物动脉壁基质中主要 的CS/DS PG(Wight等1986)。多功能蛋白聚糖VO核心蛋白质的大小是370kDa，约为核心 蛋白聚糖36kDa和双糖链蛋白聚糖38kDa的十倍大。侧链显示宽尺寸范围，但是通常平均 为每个约40-90kDa。硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)分为五个不同的细胞结合和细胞外周PG类别，它们占 哺乳动物细胞表面、基底膜和ECM中HS的至少95%。细胞结合HSPG包括整合的膜多配体 蛋白聚糖(syndecan)和锚定的磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)。细胞外周HSPG主要包括 基底膜蛋白聚糖(perlecan)、agrin。这些PG称为细胞外周的，是因为它们通过整合素与 质膜紧密关联(Whitelock和Iozzo)。基底膜蛋白聚糖是模块化HSPG，其在几乎所有基底膜和间充质器官及结缔组织中 表达，是脊椎动物和无脊椎动物中所发现的最大的单链多肽之一。基底膜蛋白聚糖的五个 模块及其HS侧链参与许多分子间相互作用，例如与成纤维细胞生长因子-2、血管内皮生长 因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)以及其它基质蛋白质相互作用。人基底膜蛋白聚 糖的核心蛋白质约为470kDa，加上许多0-连接寡糖和4个HS侧链，可达到超过800kDa的 分子量(Knox 和 Whitelock)。蛋白聚糖分布蛋白聚糖(PG)是在人体中几乎到处都有分布的大分子。PG的结构和大小差别非 常大。所有PG的基本结构包括核心蛋白质和至少一个(但经常是很多)糖链——糖胺多 糖(GAG)。PG可见于细胞内、细胞表面和细胞外基质中。PG的结构多样性提示了多种生物 学功能，参见表7。表7 表7给出了 PG分布和功能的概况。动脉中的蛋白聚糖至少五种PG类型存在于动脉壁的细胞外基质中；多功能蛋白聚糖，其与透明质多 糖相互作用形成大的聚集体；小富亮氨酸核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖，其与纤维状基 质组分如胶原和弹性蛋白相互作用；硫酸肝素-基底膜蛋白聚糖，其是基底膜的组分，以及 硫酸角蛋白-光亮蛋白聚糖(Talusan等)。多功能蛋白聚糖是在动脉粥样硬化病变中积累的数种ECM分子之一。尽管许多研 究显示多功能蛋白聚糖明显能够结合LDL，但是在坏死核心的富脂质中心中一般检测不到 多功能蛋白聚糖。光亮蛋白聚糖已显示直接结合巨噬细胞，并增强巨噬细胞的迁移。因此，光亮蛋白 聚糖可直接影响血管内膜中巨噬细胞的行为，以及刺激坏死核心的形成，其为晚期动脉粥 样硬化病变的特征(Funderburgh等1997)。双糖链蛋白聚糖可见于纤维帽中。多功能蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖具有LDL亲 和力，并形成加速LDL氧化的不溶复合物。双糖链蛋白聚糖可通过将脂蛋白截留在动脉壁 中而促进动脉粥样硬化的发病。动脉内膜中蛋白聚糖代谢的变化构成了动脉粥样硬化的初 期病变，蛋白聚糖的积累在动脉粥样硬化的发展中具有重要的作用(Kimz J.)。有报道称，通过基于质谱的分析和免疫组织化学发现基底膜蛋白聚糖在人内膜增 生中是内膜细胞外基质的中心组分之一。表8显示了一些PG在正常动脉和动脉粥样硬化动脉的PG免疫组织化学染色中的 分布(Evanko等)。表8
38 参与基质重塑的蛋白聚糖对非人灵长类中动脉粥样硬化发展的研究证明，特定PG的积累随着病变严重程 度而变化，并随细胞和生长因子的分布而变化，表明不同的PG在动脉粥样硬化的发展过程 中起不同的作用。不同水平的特定PG可通过对改变纤维性基质组分(例如弹性蛋白和胶 原)的结构排列的贡献而直接影响组织的材料特性。多功能蛋白聚糖和透明质多糖显示在基质中相似的定位，表明在动脉粥样化形成 中两者之间形成聚集体。多功能蛋白聚糖和透明质多糖在早期病变中的显著增加可提示它 们在早期动脉粥样硬化病变中起作用，例如SMC和白细胞的增殖和迁移。此外，多功能蛋白 聚糖和透明质多糖是人再狭窄病变的主要基质组分，已在体外显示出对血管病变后的新生 内膜增厚有贡献。由于脂蛋白结合多功能蛋白聚糖的硫酸软骨素链，动脉粥样化形成中早 期富含多功能蛋白聚糖还可使得细胞外基质更易于增加脂质截留。这一想法得到了移植性 动脉病中多功能蛋白聚糖与脱辅基蛋白(a)和载脂蛋白E共定位的支持(Evanko等)。斑 块中多功能蛋白聚糖的丧失可导致基质不稳定。这也被血管病变后观察到的多功能蛋白聚糖基因上调所证明。在动脉粥样化形成 的所有阶段也鉴定到多功能蛋白聚糖；在早期发生斑块的内膜中，还遍及晚期病变中以及 在充满脂质的坏死核心的边界上和斑块血栓界面上(Wight和Merrilees 2005)。这些观 察结果将多功能蛋白聚糖与脂质积累、炎症和血栓形成关联起来。此外，多功能蛋白聚糖在 ECM的组装以及弹性纤维原纤维形成的控制中起重要作用，这对于血管病期间ECM的重塑 非常重要(Wight 和 Merrilees 2005)。双糖链蛋白聚糖在动脉细胞生物学中的作用尚不清楚。一些免疫组织化学研究显 示，双糖链蛋白聚糖与人再狭窄病变中的I型和III型胶原蛋白的染色相关(Evanko等)。还通过产生双糖链蛋白聚糖基因无效突变的纯合BALB/cA小鼠进一步显示了双 糖链蛋白聚糖作为基质蛋白质的重要性，其中50%的双糖链蛋白聚糖缺陷型雄性小鼠在生 命的前3个月内由于主动脉破裂而突然死亡。此观察结果表明双糖链蛋白聚糖对于主动脉 壁结构和功能的完整性来说是必需的，还表明了双糖链蛋白聚糖基因缺陷在人主动脉剥离 和破裂的发病中可能的作用。(Heegaard等2007)其它研究显示，双糖链蛋白聚糖在灵长类动脉中是与弹性蛋白相关联的主要PG; 这些观察结果与人冠状动脉病中观察到的结果相似(Evanko等)。核心蛋白聚糖已显示出与胶原蛋白结合并调节胶原纤维的形成(Brown和Vogel)(Danielson 等)。蛋白酶谱蛋白酶水解肽键，并且导致粥样斑中的细胞外基质蛋白质例如胶原、蛋白聚糖和 弹性蛋白发生降解，参见表9。在动脉粥样硬化斑块中，发现了三种主要类型金属蛋白酶 类(即MMP)、丝氨酸蛋白酶类和半胱氨酸蛋白酶类(即组织蛋白酶)。组织蛋白酶类和MMP 导致所有细胞外基质蛋白质降解。因为基质对于斑块稳定性来说是至关重要的，所以蛋白 酶将其从纤维帽除去可引起斑块的破裂(Stary H. C.)。在表9中列出了在动脉粥样硬化斑块中发现的多种蛋白酶。表9 表9在动脉粥样硬化斑块中检测到的蛋白酶怀疑斑块中MMP表达的主要来源与巨噬细胞和SMC活性有关。斑块中的巨噬细胞 含有丰富的MMP-l、-8、_9和-13，其与胶原和蛋白聚糖原位降解的位点共定位(Kimz J.)。 此外，我们的数据表明MMP-8和组织蛋白酶K定位于动脉粥样硬化斑块中。基质金属蛋白酶(MMP)MMP是一大组内肽酶，其能够降解ECM的多数组分。目前，已鉴定到超过25种MMP。
40金属蛋白酶类的特征在于含有金属原子(通常为锌)的活性位点，并以酶原的形式分泌。特 异性组织抑制剂TIMP调控MMP的活性。动脉粥样硬化斑块中发现有很多种MMP。它们最常 位于作为纤维帽边界的巨噬细胞中、SMC和巨噬细胞中的斑块肩部内，但很少在纤维帽内部 鉴定到(Kunz J.)。 MMP根据其底物特异性分为不同的组降解纤丝胶原(如I、II、III和V型胶原以 及蛋白聚糖)的胶原酶；降解蛋白聚糖、IV、V、VII型胶原和弹性蛋白的明胶酶；对蛋白聚 糖和弹性蛋白有活性的基质降解酶(Rouis M)。这三个亚类在动脉粥样硬化斑块的基质重 塑方面特别重要。明胶酶不溶性弹性蛋白被MMP-2和-9消化，这两者都属于MMP的明胶酶家族。MMP_9在 影响动脉粥样硬化斑块的大小和组成上起到重要的作用。在不稳定的人动脉粥样硬化斑块 中以及斑块的脆弱区域中，已观察到MMP-9较高的表达和浓度。此外，与具有稳定心绞痛的 患者相比，在具有不稳定心绞痛的患者中更经常在冠状动脉斑块的细胞内发现MMP_9(表 示活跃合成)。血液MMP-9水平与冠状动脉粥样硬化相关地升高，预测不良的心血管事件 (Sundstrom和Vasan)。Kuzuya等(2006)最近的研究显示MMP-2负责纤维帽中SMC的积 累，由此诱导斑块的不稳定。基质降解酶MMP-3属于基质降解酶，其能够降解弹性蛋白和蛋白聚糖。Yamada等(2002)的研 究显示，MMP-3被证实可以是预测女性心肌梗死遗传风险的可靠手段。胶原酶MMP-U-8和-13均已在动脉粥样硬化斑块中鉴定到，它们在这里降解蛋白聚糖以 及I型和III型胶原。MMP-U-8和-13是胶原酶，其将胶原切割成两个片段，其进一步被MMP_2、_3或_9降解。MMP-8由中性粒细胞表达，不常见于人粥样斑中，但是已在动脉粥样硬化斑块中 鉴定到。MMP-8可能部分地负责纤维帽的降解，因为MMP-8具有I型胶原蛋白的偏好性 (Herman等)，其降解I型胶原的活性是MMP-I和13的三倍。这得到了 Turu等(2006)的支 持，在该研究中，具有脆弱斑块的患者血浆中MMP-8的含量显著高于具有稳定斑块的患者。已有报道MMP-13切割SLRPS，对双糖链蛋白聚糖具有高特异性。MMP-13在特异性 切割位点(...G177/V178)降解双糖链蛋白聚糖，这之前已由Monfort等(2005)证实，并且提 出其在骨关节炎中软骨退化的早期检测中起重要作用。组织蛋白酶人半胱氨酸组织蛋白酶由11个成员组成，包括组织蛋白酶B、K、L和S，其主要在 细胞的内体/溶酶体区室内表达。组织蛋白酶能够催化蛋白聚糖、胶原蛋白和弹性蛋白的 水解性降解。相比于正常主动脉，在腹主动脉瘤(AAA)中发现了高水平的组织蛋白酶S、K和L。 正常人血管SMC含有的组织蛋白酶K无法通过免疫染色检出，但是动脉粥样硬化斑块内的 细胞明显是阳性的。组织蛋白酶K定位于易于破裂的区域，例如纤维帽、斑块肩部以及斑块 破裂的实际部位(Chapman等)。发现在动脉粥样硬化斑块中组织蛋白酶S与弹性蛋白降解增加的区域共定位，在组织蛋白酶S和K缺陷型小鼠中观察到动脉粥样硬化减少(Liu等)。组织蛋白酶L和K都降解数种蛋白聚糖以及I型和II型胶原蛋白，组织蛋白酶K 在共价交联的三螺旋内降解，而组织蛋白酶L仅在非螺旋端肽区域进行切割。组织蛋白酶 K定位于纤维帽和斑块肩部。正常动脉中组织蛋白酶K的表达极低。人早期动脉粥样硬化 病变中显示在内膜和中间的SMC中表达组织蛋白酶K。在晚期动脉粥样硬化斑块中，组织蛋 白酶K主要定位于纤维帽的巨噬细胞和SMC中(Lutgens等)。与正常动脉相比，动脉粥样 硬化病变中组织蛋白酶K蛋白水平提高，而组织蛋白酶K的mRNA水平在动脉粥样硬化动脉 和正常动脉中相似。此外，已显示与早期动脉粥样硬化病变和包含血栓的病变相比，蛋白酶 K mRNA和蛋白水平在晚期但稳定的人动脉粥样硬化斑块中组织是最高的(Chapman等)。在早期人动脉粥样硬化病变和脂肪条纹的内膜和中间SMC中，组织蛋白酶S仅稀 少地表达。在晚期动脉粥样硬化斑块中，组织蛋白酶S定位于纤维帽的巨噬细胞和SMC中。 沿血管本身以及斑块微血管的腔排列的EC也表达组织蛋白酶S。此外，与正常动脉相比，人 粥样斑中组织蛋白酶S mRNA和蛋白水平升高(Lutgens等)。组织蛋白酶S可降解蛋白聚 糖、弹性蛋白和胶原蛋白(Liu等)。目前，CVD风险的确定是在动脉粥样硬化发展的晚期阶段进行的；此时具有显著 的纤维斑块破裂的风险。需要一种在较早阶段和晚期阶段都提供动脉粥样硬化或CVD风险 之相关信息的诊断或预后测定。Katsuda等(1992)的发现表明，存在将胶原蛋白从晚期病 变中除去的酶促机制，实际上提示了新表位在动脉硬化中的重要作用。本发明提供了一种对包含新表位的肽片段进行定量的生物测定法，所述新表位是 由蛋白酶切割动脉粥样硬化斑块的蛋白质而形成的，所述方法包括使包含所述肽片段的样 品与对所述新表位具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体相接触，以及测定所述样品中 所述免疫结合配偶体与肽片段结合的水平。所述测定的结果可产生指示特定患者中动脉粥样硬化斑块破裂风险程度或者患 者动脉粥样硬化斑块脆弱状态的指标。可建议所述指标的值高于阈值水平的患者通过斑块成像方法(包括上文所述的 那些)进行进一步研究，或者建议其服用治疗动脉粥样硬化的药物或者进行动脉粥样硬化 的手术治疗，这些后续研究或治疗可构成本发明方法的一部分。动脉粥样硬化斑块的蛋白质包括光亮蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、基底膜蛋白聚 糖、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、III型胶原、CRP、ApoE和弹性蛋白。不认为I型胶原 是动脉粥样硬化斑块的蛋白质。动脉粥样硬化斑块中存在的以比体内其它地方更高的水平 暴露于蛋白酶的蛋白质是特别有意义的。 所述免疫学结合配偶体可对包含C端新表位或N端新表位的肽片段具有特异性结 合亲和力。蛋白聚糖测定所述肽片段可以是蛋白聚糖多功能蛋白聚糖(SEQ ID NO :1)、光亮蛋白聚糖(SEQ ID NO 2)、基底膜蛋白聚糖(SEQ ID NO 3)、双糖链蛋白聚糖(SEQ ID NO 4)和核心蛋白聚 糖(SEQ ID NO 5)的片段，其全部都在正常和动脉粥样硬化的动脉中鉴定到。蛋白聚糖与 弹性蛋白和胶原蛋白是构成动脉粥样硬化斑块和斑块帽的主要蛋白质中的一部分。蛋白聚 糖含量在动脉粥样硬化发展过程中发生变化，使得蛋白聚糖的新表位有可能成为疾病分期和疾病发展的良好标志物。尤其是因为多功能蛋白聚糖和光亮蛋白聚糖在许多其它器官中 并不丰富，这使得它们成为更具特异性的生物化学标志物的候选。一些候选蛋白酶可能负责消化斑块中的蛋白聚糖，因为文献中报道了动脉粥样硬 化斑块中的许多不同的蛋白酶。最可能的是，这是最终导致斑块破裂的一系列复杂过程的 结果。但是，在我们的评估中，早期阶段可以由一组MMP组成，而晚期阶段可更多地依赖于 组织蛋白酶对基质的降解，根据疾病阶段而产生不同的新表位谱。我们确定了表4中所 列酶产生光亮蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖和核心蛋白聚 糖，得到至少下列切割产物 表4、蛋白酶产生的肽——蛋白聚糖的切割产物。*代表切割位点因此，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含蛋白酶在其上述任一部分序列中* 号标明的位点切割多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖或双糖 链蛋白聚糖而形成的新表位。另外，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含通过一种(或多种)蛋白酶在下列 任一多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖部 分序列中的位点切割下列蛋白聚糖而形成的新表位多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、基底 膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖；或者所述免疫结合配偶体可与下列序列之 一特异性反应 表10、蛋白聚糖切割的肽片段。
优选地，所述免疫结合配偶体不与完整的多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、核心蛋 白聚糖、基底膜蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖反应。优选地，如果延长经过所产生片段的相应 C端和N端，则所述免疫结合配偶体不与上文所列的序列反应。免疫结合配偶体可与切割多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、基底膜 蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖类型而形成的C端或N端新表位特异性反应。因此，合适的免疫结合配偶体可与肽N端的表11中下列任一序列特异性反应
表11、蛋白酶产生的蛋白聚糖肽片段的N端序列或者与肽C端的表12中下列任一序列反应 表12、蛋白酶产生的蛋白聚糖肽片段的C端序列通过将蛋白聚糖或其它动脉粥样硬化斑块蛋白质暴露于本文所述的任何酶以及 分离并测序由此产生的肽，可以鉴定出限定能以类似方式测定的新表位的其它切割位点。胶原蛋白测定所述肽片段可以是III型胶原蛋白的片段(SEQ ID NO 153)，优选成熟III型胶原 蛋白，即非III型胶原蛋白前肽。动脉粥样硬化斑块中主要的蛋白质是I型和III型胶原 蛋白以及弹性蛋白，而蛋白聚糖仅仅对斑块的基质有次要的贡献。在动脉粥样硬化斑块中 发现的三种主要蛋白质中，I型和III型胶原蛋白占优势地位，而弹性蛋白在动脉的蛋白质 谱中占有优势，但不是斑块的主要蛋白质成分。I型胶原蛋白在体内各处都很丰富，而III型具有更有限的组织定位，由此(按照我们的观点)是更特异性的生物化学标志物候选。一些候选蛋白酶可能负责消化斑块中的胶原，因为文献中报道了动脉粥样硬化斑 块中的许多不同的蛋白酶。最可能的是，这是最终导致斑块破裂的一系列复杂过程的结果。 但是，在我们的评估中，早期阶段可以由一组MMP组成，而晚期水平可更多地依赖于组织蛋 白酶K对基质的降解，导致根据疾病水平产生不同的新表位谱。我们确定了下表中所列的 酶在至少下列切割位点(记为切割III型胶原蛋白
经过相应的切割位点，则所述免疫结合配偶体不与上文所列的序列反应。所述免疫结合配偶体可以与切割III型胶原蛋白而形成的C端或N端新表位特异 性反应。因此，合适的免疫结合配偶体可以与肽N端的下列任一序列具有特异性反应性 (每个序列后为序列编号)
或者与肽C端的下列任一序列具有特异性反应性 通过将III型胶原蛋白或另一种动脉粥样硬化斑块蛋白质暴露于本文所述的任 何酶以及分离并测序由此产生的肽，可以鉴定出限定能以类似方式测定的新表位的其它切 割位点。CRP 和 ApoE 测定所述肽片段可以是CRP(SEQ ID NO 658)或ApoE(SEQ ID NO 659)的片段。对于 ApoE，优选所选片段在所鉴定的全部ApoE同种型ε 2、ε 3和ε 4中都存在。尽管CRP和ApoE在人体各处都很丰富，但它们在动脉粥样硬化组织中的定位使其 暴露于局部蛋白酶的作用。因此，这些分子是作为生物化学标志物的良好且特异的候选。一些候选蛋白酶可能负责消化斑块中的CRP和ΑροΕ，因为文献中报道了动脉粥样 硬化斑块中的许多不同的蛋白酶。最可能的是，这是最终导致斑块破裂的一系列复杂过程 的结果。但是，在我们的评估中，早期阶段可以由一组MMP组成，而晚期水平可更多地依赖 于组织蛋白酶K对基质的降解，导致根据疾病水平产生不同的新表位谱。通过大量纯化天 然蛋白质的体外切割，我们确定了下表中所列的酶在至少下列切割位点(记为切割CRP 禾口 ApoE 表13、特异性蛋白酶产生的CRP和ApoE片段。
因此，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含由蛋白酶在下列任一 CRP和ApoE 部分序列中以*标记的位点切割CRP和ApoE而形成的新表位，或者所述免疫结合配偶体与 下述序列之一的*号之间定义的序列特异性反应。表14、CRP和ApoE的切割片段。
因此，合适的免疫结合配偶体可以对肽N端的下列任一序列具有特异性反应性 或者对肽C端与下列任一序列具有特异性反应性 通过将CRP和ApoE或另一种动脉粥样硬化斑块蛋白质暴露于本文所述的任何酶 以及分离并测序由此产生的肽，可鉴定出限定可以类似方式测定之新表位的其它切割位
点ο弹性蛋白测定所述肽片段可以是弹性蛋白(SEQ ID NO 735)的片段。尽管弹性蛋白在人体各处 都很丰富，但它们在动脉粥样硬化组织中的定位使其暴露于局部蛋白酶的作用，因此这些 分子是作为动脉粥样硬化斑块周转的生物化学标志物的良好且特异的候选。一些候选蛋白酶可能负责消化斑块中的弹性蛋白，因为文献中报道了动脉粥样硬 化斑块中的许多不同的蛋白酶。最可能的是，这是最终导致斑块破裂的一系列复杂过程的 结果。但是，在我们的评估中，早期阶段可以由一组MMP组成，而晚期阶段可更多地依赖于 组织蛋白酶K对基质的降解，根据疾病水平而产生不同的新表位谱。通过大量纯化天然蛋 白质的体外切割，我们确定了下表中所列的酶在至少下列切割位点(记为切割弹性蛋 白表15、特异性蛋白酶产生的弹性蛋白片段 因此，在本发明的方法中，所述肽片段优选包含由蛋白酶在下列任一弹性蛋白部 分序列中以*号标记的位点切割弹性蛋白而形成的新表位，或者所述免疫结合配偶体对下 述序列之一中*号之间所定义序列具有特异性反应性。表16、弹性蛋白的切割片段。
因此，合适的免疫结合配偶体可以与肽N端的下列任一序列具有特异性反应性 或者与肽C端的以下任一序列具有特异性反应性 通过将弹性蛋白或另一种动脉粥样硬化斑块蛋白质暴露于本文所述的任何酶以 及分离并测序由此产生的肽，可鉴定出限定可以类似方式测定之新表位的其它切割位点。可分别对多于一种上述肽进行测定，并将其结果相结合，或者可同时测定多于一 种上述的肽。本发明测定的结果可以与一种或多种其它测定的生物标志物相结合，形成诊断或 预后值的复合指标。本文使用的术语“免疫结合配偶体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，以及抗体的特 异性结合片段例如Fab或F(ab' )2。因此，所述免疫结合配偶体可以是单克隆抗体或者具 有特异性结合亲和力的单克隆抗体片段。本文使用的术语“蛋白质”包括脂蛋白和蛋白聚糖及其他蛋白质(非蛋白质)天 然缀合物。一般地，所有先前已知的免疫测定形式都可用于本发明，包括异质和均质的形式， 夹心法测定、竞争测定、酶联测定、放射性免疫测定等等。因此，任选地，所述方法以竞争性 免疫测定的形式进行，其中将所述免疫结合配偶体和竞争剂在所述样品存在下一起孵育， 所述竞争剂与样品中的肽片段竞争结合该免疫结合配偶体。所述竞争剂可以是合成肽，或是通过切割新表位所属蛋白以暴露新表位而形成的 纯化天然肽。因此，所述肽可来源于多功能蛋白聚糖、光亮蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心 蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、III型胶原蛋白、ApoE、CRP或弹性蛋白中的任一种。一种合适的方法可以是使用单克隆抗体或抗体结合片段进行的竞争免疫测定，所 述单克隆抗体或抗体结合片段与任一这些蛋白质片段中的新表位或者来自动脉粥样硬化 斑块的其他肽片段上的新表位结合。包被于微滴定板固体表面上的适当选择的合成肽可与 样品竞争结合所述单克隆抗体或结合片段。或者，带有单克隆抗体或结合片段所识别新表 位的一种或多种蛋白质的纯化天然片段可用于固体表面上。另一种替代方案是将单克隆抗 体或结合片段固定于固体表面，然后将样品与适当连接信号分子(例如辣根过氧化物酶或 生物素)的合成肽共孵育。所述样品可以是尿、血清、血、血浆或其它样品，例如动脉粥样硬 化斑块活组织检查。在某些优选方法中，所述样品是来自患者的样品，所述方法还包括将测得的所述 肽片段结合水平与下列特征值进行比较(a)相当的健康个体和/或(b)病理动脉粥样硬 化状况，以及任选地将所测定较高的肽水平(通常由较高水平的结合来表示)与更严重的 所述状况程度相关联。本发明的一个方面涉及开发识别上述新表位的单克隆抗体。这可通过下述方案来实现，用合成肽免疫小鼠，所述合成肽来自于目的蛋白质分子的氨基酸序列(包括上文所 列序列或者在其中终止的序列)；将来自所选小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；以及测定 单克隆抗体与相关合成肽上新表位的结合。可通过要求与合成肽具有反应性但与C延长形 式的免疫肽(对于C端新表位)或者N端延长形式的免疫肽(对于N端新表位)无反应性， 来确保新表位的特异性。也可对针对新表位的抗体进行评估，以确定不能与天然蛋白质结 合。或者，可通过要求抗体反应性负依赖于与末端氨基酸之一共价连接的生物素或其他官 能团的存在，来确保对新表位的特异性。本发明包括对新表位具有特异性免疫反应性的免疫结合配偶体，所述新表位是通 过蛋白酶在任一上述部分序列的末端位点切割所述蛋白质而形成的，所述免疫结合配偶体 可以是例如单克隆抗体或其结合片段。本发明包括产生针对C端或N端新表位的单克隆抗体的细胞系，所述新表位是通 过在任一上述部分序列的序列末端位点切割动脉粥样硬化斑块蛋白质而形成的。本发明还提供包含C端或N端新表位的肽，所述新表位是通过在任一上述蛋白质 部分序列中切割所述蛋白质而形成的。这样的肽可以作为半抗原与载体缀合，用以产生对 所述肽的免疫应答，或者固定到固体表面或与可检测标记缀合用于免疫测定。本发明还包括编码包含C端或N端新表位的肽的分离核酸分子，所述新表位是通 过在任一上述部分序列中切割所述蛋白质而形成的。本发明还包括包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含表达信号以及编码表达包 含C端或N端新表位的肽的编码序列，所述新表位是通过在任一上述部分序列中切割所述 蛋白质而形成的，本发明还包括用此载体转化并表达所述肽的宿主细胞。本发明的另一个方面涉及试剂盒，其可方便地用于实施上述方法。此试剂盒可包 含(1)用合成肽包被的微滴定板；(2)对所述合成肽具有反应性的本发明单克隆抗体或抗 体结合片段；和⑶带标记的抗小鼠IgG免疫球蛋白。或者，此试剂盒可包含⑴用纯化的 天然蛋白质片段包被的微滴定板；(2)识别任一所述蛋白质片段上新表位并对所述纯化片 段具有反应性的单克隆抗体；和(3)带标记的抗小鼠IgG免疫球蛋白。或者，此试剂盒可包 含⑴用链霉亲和素包被的微滴定板；(2)与生物素相连的合成肽；(3)识别所述蛋白质片 段上新表位并对所述合成肽具有反应性的单克隆抗体；和(4)带标记的抗小鼠IgG免疫球 蛋白。另一种替代方案可以是包含以下的试剂盒(1)用链霉亲和素包被的微滴定板；(2) 与生物素相连的合成肽；(3)识别所述蛋白质片段上新表位(并对所述合成肽具有反应性) 并且与辣根过氧化物酶缀合的单克隆抗体。因此，本发明包括免疫测定试剂盒，其包含如本文所述的免疫结合配偶体以及与 所述免疫结合配偶体结合的竞争剂，并任选地包含以下一种或多种洗涤试剂、缓冲剂、终 止试剂、酶标记、酶标记底物、校准标准品、抗小鼠抗体和进行所述免疫测定的说明。本文所述测定可用于诊断患者的动脉粥样硬化疾病。另外，所述测定可用于评估 疾病进展并监测对治疗的反应。本发明的免疫结合配偶体还可用于免疫染色，以显示本文 所述任一动脉粥样硬化斑块蛋白质切割产物的存在情况或位置。下面参考附图进一步解释和说明本发明，其中

图1显示使用单克隆小鼠抗体对具有III型病变的主动脉样品进行双糖链蛋白聚 糖染色(分别为2、4、4和10倍放大)。
图2显示使用单克隆小鼠抗体对具有III型病变的主动脉样品进行组织蛋白酶K 染色(分别为2、4、10和10倍放大)。图3显示使用单克隆小鼠抗体对具有V型病变的主动脉样品进行双糖链蛋白聚糖 染色(分别为2、4、10和10倍放大)。图4显示使用单克隆小鼠抗体对包含V型病变的主动脉样品进行组织蛋白酶K染 色(分别为2、4、10和IOx倍放大)。图5显示通过以下蛋白酶产生的双糖链蛋白聚糖切割产物MMP2、MMP3、MMP8、组 织蛋白酶K、组织蛋白酶S、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L。M = Rainbow标记物，-enz =未 进行酶消化，利用实施例2的凝胶进行。图6至8显示实施例4所得的竞争研究结果。图9显示实施例6所得的竞争研究结果。图10和11显示实施例7所得的竞争研究结果。实施例1为了分析蛋白聚糖和蛋白酶的定位，我们对来自于冠状动脉左前降支(left coronary descending arteries, LAD)的人动脉样品进行了免疫组织化学染色。下文中， 证明了组织蛋白酶K蛋白酶与双糖链蛋白聚糖共定位。如图1和2中所示的免疫组织化学染色显示了双糖链蛋白聚糖与组织蛋白酶K的 共定位。这可表明双糖链蛋白聚糖是组织蛋白酶K的优选底物。对主动脉样品进行了相同 的免疫组织化学染色，其中形成了动脉粥样硬化斑块，并因此导致巨噬细胞性泡沫细胞浸 润物和钙化替代了正常主动脉结构。这些免疫染色的结果汇总在图3和4中。双糖链蛋白聚糖和组织蛋白酶K的免疫组织化学染色显示在发展的动脉粥样硬 化病变中共定位。综合这些结果产生了下列假说双糖链蛋白聚糖中组织蛋白酶K的特异 性切割位点导致动脉粥样硬化病变中的新表位产生增加。为了检验这一假说，我们使用不 同的蛋白酶切割双糖链蛋白聚糖。实施例2用于评估降解片段的双糖链蛋白聚糖降解。通过下列蛋白酶切割来自牛关节软骨 的双糖链蛋白聚糖(B8041-Sigma-Aldrich) :MMP2、MMP3、MMP8、组织蛋白酶K、组织蛋白酶 S、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L。将由上述蛋白酶的酶促切割产生的蛋白聚糖片段在10% NuPage Bis-Tris凝胶上分离，然后通过“Silver Express”银染试剂盒(Invitrogen 目录号LC6100，批号341099)进行银染。蛋白水解产生的双糖链蛋白聚糖的分离以及银染 的结果在图5中显示。实施例3用与卵白蛋白缀合的来自III型胶原的肽免疫小鼠。对血清筛选与缀合生物素的 所筛选肽序列的反应性。产生分泌单克隆抗体的克隆，并使用筛选序列进行筛选。检查克 隆的以下方面缺少与延长形式靶标肽的反应性以及缺少与无义肽的反应性，所述延长形 式靶标肽延续了 III型胶原中的临近序列(反选肽)。所有靶序列阳性克隆均不与延长或 无义序列反应。所述靶序列、免疫原、筛选序列和反选序列如下 实施例4
III型胶原蛋白新表位单克隆抗体与人尿的反应性在使用免疫肽作为竞争剂的竞争测定形式中确定来自实施例3的所选单克隆抗 体克隆与人尿的反应性。在典型方案中，在20°C下用PBS-BTE中lOng/ml生物素-肽对以 链霉亲和素包被的96孔板摇动包被30分钟，在洗涤缓冲液中洗涤5遍。加入20 μ 1稀释 的样品(尿或肽溶液)。添加如下文所述稀释的100 μ 1未纯化抗体溶液(来自细胞培养物 的上清液)。将平板在20°C下以300rpm摇动孵育1小时，然后在洗涤缓冲液中洗涤5遍。 添加100 μ 1 二抗(POD，1 5000)，在20°C下以300rpm摇动孵育1小时，然后在洗涤缓冲 液中洗涤5遍。添加100 μ 1 TMB,避光以300rpm摇动孵育15分钟，然后添加100 μ 1终止 液。在ELISA读取仪上以450nm读取平板，以650nm作为参照。这样，平板上的肽与溶液中 的肽发生对抗体的竞争，通过过氧化物酶显色反应确定与平板结合的抗体量。四个不同克隆的结果显示于图6。可以看出，每种所述抗体都检测出尿中的相关序 列。对一个选定的克隆进行另外的竞争研究，以测试免疫肽与被MMP9体外切割的天 然III型胶原蛋白之间对抗体结合的竞争。被切割的胶原、KNGETG肽和该序列延长形式的 结果显示于图7。可以看出，所述抗体结合免疫肽序列和被酶切割的胶原蛋白，但是不结合 延长的序列。对同一克隆进行的其它竞争研究见于图8，其中竞争剂分别是KNGETG肽、人血清、 大鼠血清、FCS(胎牛血清)和动脉粥样硬化斑块提取物。可以看出，所述抗体与所述肽、所 述斑块提取物以及人血清反应，但是不与大鼠血清或FCS反应。实施例5产生针对核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖序列的抗血清如实施例3中所述，产生抗血清并获得单克隆抗体，不同在于使用下列免疫原、筛 选序列和反选序列。 实施例6核心蛋白聚糖新表位单克隆抗体与人尿的反应性基本如实施例5所述使用一种抗核心蛋白聚糖未纯化单克隆抗体(NB62)进行竞 争性ELISA。
结果显示于图9。可观察到针对产生和选择该抗体的肽序列以及针对尿的反应性， 但针对无关肽序列NB18则不然。实施例7多功能蛋白聚糖新表位单克隆抗体与人尿的反应性基本如实施例5使用针对序列(NB64)产生的两种抗多功能蛋白聚糖未纯化单克 隆抗体克隆进行竞争性ELISA。各个克隆的结果显示于图10和11。在每种情况下，可观察到针对产生和选择该抗 体的肽序列以及针对尿的反应性，但是针对无关肽序列NB18则不然。在本说明书中，除非另外指明，否则词语“或”以下述运算符含义使用当满足所述 情况之一或同时满足时返回真值，相反，运算符“异或”要求仅满足条件之一。词语“包含”
以“包括”的含义使用，而不表示“由......组成”。上文给出的在先教导通过引用并入本文。参考文献Bobryshev YV. Calcification of elastic fibers in human atheroscleroticplaque. Atherosclerosis 2005 ；180 :293_303·Brown, D. C. and K. G. Vogel. " Characteristics of the in vitro interactionof a small proteoglycan(PG II)of bovine tendon with type Icollagen. " Matrix. 9. 6(1989) :468_78.Cattin L, Fisicaro M, Tonizzo M, Valenti M, Danek GM, Fonda M, Da Col PG, Casagrande S, Pincetri E, Bovenzi M, and Baralle F. Polymorphism ofthe apolipoprotein E gene and early carotid atherosclerosis definedby ultrasonography in asymptomatic adults. Arterioscler Thromb VascBiol. 1997 Jan ； 17(1) :91-4.Chapman HA, Riese RJ, Shi GP. Emerging roles for cysteine proteases inhuman biology. Annu. Rev. Physiol 1997;59:63-88.Clarkson TB, Kaplan JR. Stage of Reproductive Life, AtherosclerosisProgression and Estrogen Effects on Coronary Artery Atherosclerosis, In :Lobo RA,editor. Treatment of the Postmenopausal Woman Basic andClinical Aspects,3 ed. San Diego :Elsevier ；2007.p.509-28.Danielson, K. G. , et al. " Targeted disruption of decorin leads to abnormal collagen fibril morphology and skin fragility. " J.Cell Biol. 136. 3(1997) :729_43.Dour s-Z immermann , Μ. T. and D. R. Z immermann. " A novel glycosaminoglycanattachment domain identified in two alternative splice variants ofhuman versican. “ J.Biol.Chem. 269. 52(1994) :32992_98.Eriksen HA, Satta J, Risteli J, Veijola M, Vare P, Soini Y. Type I andtype III collagen synthesis and composition in the valve matrix inaortic valve stenosis.Atherosclerosis 2006 ；189 :91_98·Evanko, S. P.，et al. “ Proteoglycan distribution in lesionsofatherosclerosis depends on lesion severity, structuralcharacteristies, and the proximity of platelet-derived growth factorand transforming growth factor-beta." Am. J. Pathol. 152.2(1998) :533_46.Funderburgh，J. L. 〃 Keratan sulfate :structure，biosynthesis, andfunction. " Glycobiology 10.10(2000) :951_58.Funderburgh，J. L.，et al. ” Macrophage receptors for lumican. A cornealkeratan sulfate proteoglycan. “ Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 38. 6 (1997) 1159-67.Gabay C and Kushner I.Acute-phase proteins and other systemic responsesto inflammation. N Engl J Med. 1999 Feb 11 ；340(6) 448-54.Gardner CD，Fortmann SP，Krauss RM. Association of small low-densitylipoprotein particles with the incidence of coronary artery diseasein men and women. JAMA 1996 ；276 :875_8LGarrone R，Lethias C，Le Guellec D. Distribution of minor collagens duringskin development. Microsc. Res Tech. 1997;38:407-12.Graham I，Atar D，Borch-Johnsen K，Boysen G，Burell G，Cifkova R et al.European guidelines on cardiovascular disease prevention in clinicalpractice :executive summary. Atherosclerosis 2007 ；194 1-45.Haraki T，Takegoshi T，Kitoh C，Wakasugi T，Saga T，Hirai JI，Aoyama T， Inazu A and Mabuchi H,Carotid artery intima—media thickness andbrachial artery flow-mediated vasodilation in asymptomatic Japanesemale subjects amongst apolipoprotein E phenotypes. J Intern Med. 2002Aug ；252 (2) 114-20.Hatanaka K，Li XA，Masuda K，Yutani C and Yamamoto A， Immunohistochemicallocalization of C-reactive protein-binding sites in humanatherosc1erotic aortic lesions by a modified streptavidin-biotin-staining method. Pathol Int. 1995 Sep ；45 (9) :635_41.Heegaard AM，Corsi A，Daniel sen CC，Nielsen KL，Jorgensen HL，Riminucci M， Young MF and Bianco P， Biglycan deficiency causes spontaneous aorticdissection and rupture in mice. Circulation. 2007 May29 ；115 (21) :2731_8.Epub 2007 May 14.Herman MP,Sukhova GKiLibby PiGerdes N，Tang NiHorton DB et al.Expression of neutrophil collagenase(matrix metalloproteinase-8)inhuman atheroma :a novel collagenolytic pathway suggested bytranscriptional profiling. Circulation 2001 ； 104 1899-904.Jeppesen J， Hein HO, Suadicani P， Gyntelberg F.High triglycerides/ lowhigh-density lipoprotein cholesterol， ischemic electrocardiogramchanges，and risk of ischemic heart disease. Am Heart J 2003 ； 145 103-08.Lawrie TD, Mcalpine SG, Rifkind BM, Robinson JF.Serum fatty-acid patternsin coronary-artery disease. Lancet 1961 ；1 421-24.Katsuda S，Okada Y，Minamoto T，Oda Y，Matsui Y，Nakanishi
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权利要求
用于对包含新表位的肽片段进行定量的生物测定方法，所述新表位是由蛋白酶对动脉粥样硬化斑块的蛋白质进行切割而形成的，所述方法包括将包含所述肽片段的样品与对所述新表位具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体相接触，以及测定所述免疫结合配偶体与所述样品中肽片段的结合水平。
2.根据权利要求1的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含C端新表位的肽片段具有 特异性结合亲和力。
3.根据权利要求1的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含N端新表位的肽片段具有 特异性结合亲和力。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含新表位的肽片段 具有特异性结合亲和力，所述新表位是由蛋白酶在CRP的下列任一部分序列中对CRP进行 切割而形成的
5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含新表位的肽片段具有特异性结合亲和力，所述新表位是由蛋白酶在ApoE的下列任一部分序列中对ApoE 进行切割而形成的
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述免疫结合配偶体对肽N端的下列任一序列具 有特异性结合亲和力
7.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肽片段是光亮蛋白聚糖、多功能蛋白 聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖的片段。
8.根据权利要求7的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含新表位的肽片段具有特异性结合亲和力，所述新表位是由蛋白酶在光亮蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、基底膜蛋白聚 糖、核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖的下列任一部分序列中切割光亮蛋白聚糖、多功能蛋 白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖而形成的:
9.根据权利要求8的方法，其中所述免疫结合配偶体对肽N端的下列任一序列具有特 异性结合亲和力
10.根据权利要求8的方法，其中所述免疫结合配偶体对肽C端的下列任一序列具有特 异性结合亲和力
11.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含新表位的肽 片段具有特异性结合亲和力，所述新表位是由蛋白酶在III型胶原蛋白的下列任一部分序 列中在符号1 示记的位点处对III型胶原蛋白进行切割而形成的
12.根据权利要求11的方法，其中所述免疫结合配偶体对肽N端的下列任一序列具有 特异性结合亲和力 或者对肽C端的下列任一序列具有特异性结合亲和力
13.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含新表位的肽 片段具有特异性结合亲和力，所述新表位是由蛋白酶在弹性蛋白的下列任一部分序列中对 弹性蛋白进行切割而形成的
14.根据权利要求13的方法，其中所述免疫结合配偶体对肽N端的下列任一序列具有特异性结合亲和力_ 或者对肽C端的下列任一序列具有特异性结合亲和力
15.根据上述任一权利要求的方法，其中所述免疫结合配偶体不与作为所述新表位序 列之来源的完整蛋白特异性结合。
16.根据上述任一权利要求的方法，其中所述免疫结合配偶体是单克隆抗体或者具有 特异性结合亲和力的单克隆抗体片段。
17.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述方法以竞争性免疫测定的形式进行，其 中将所述免疫结合配偶体和竞争剂在所述样品存在下孵育，所述竞争剂与所述样品中的肽 片段竞争结合所述免疫结合配偶体。
18.根据权利要求17的方法，其中所述竞争剂是合成肽，或者是切割所述表位的来源 蛋白以显露所述新表位而形成的纯化天然肽。
19.根据上述任一权利要求的方法，其中所述样品是尿、血清、血或血浆的样品。
20.根据前述任一权利要求的方法，其中所述样品是来自患者的样品，所述方法还包括 将所测定的所述肽片段的结合水平与下列特征值进行比较(a)相当的健康个体和/或(b) 病理动脉粥样硬化状况。
21.针对C端或N端新表位的免疫结合配偶体，所述新表位是由蛋白酶切割光亮蛋白 聚糖、多功能蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、III型胶原蛋白、 ApoE, CRP或弹性蛋白而形成的。
22.根据权利要求21的免疫结合配偶体，其对新表位具有特异性免疫反应性，所述新 表位是由蛋白酶在权利要求5至14中任一项所述蛋白质的任一部分序列中切割所述蛋白 质而形成的。
23.根据权利要求21或22的免疫结合配偶体，其为单克隆抗体或其结合片段。
24.产生权利要求23所述单克隆抗体的细胞系。
25.包含C端或N端新表位的肽，所述新表位是由蛋白酶在权利要求5至14中任一项 所述蛋白质的任一部分序列中切割所述蛋白质而形成的。
26.根据权利要求25的肽，其作为半抗原与载体缀合以产生针对所述肽的免疫应答，或者固定于固体表面或者与检测标记缀合以用于免疫测定中。
27.编码包含C端或N端新表位的肽的分离核酸分子，所述新表位是由蛋白酶在权利要 求5至14中任一项所述蛋白质的任一部分序列中切割所述蛋白质而形成的。
28.包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含表达信号和编码序列，所述编码序列编码 表达包含C端或N端新表位的肽，所述新表位是由蛋白酶在权利要求5至14中任一项所述 蛋白质的任一部分序列中切割所述蛋白质而形成的。
29.转化有权利要求28所述载体并表达所述肽的宿主细胞。
30.免疫测定试剂盒，其包含权利要求21至23中任一项的免疫结合配偶体以及与所述 免疫结合配偶体结合的竞争剂，并任选地包含以下一种或多种洗涤试剂、缓冲剂、终止试 剂、酶标记、酶标记底物、校准标准品、抗小鼠抗体和使用所述试剂盒进行测定的说明书。
全文摘要
用于对包含新表位的肽片段进行定量的生物测定方法，所述新表位通过以蛋白酶切割动脉粥样硬化斑块的蛋白质例如光亮蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、III型胶原蛋白、CRP、ApoE或弹性蛋白而形成，所述方法包括将样品例如尿或血清与对所述新表位具有反应性的抗体相接触，以及测定所述免疫结合配偶体与所述样品中肽片段的结合水平。所述测定可预测心血管疾病事件的风险。
文档编号G01N33/68GK101918846SQ200880123912
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月4日 优先权日2007年11月5日
发明者佩尔·奎斯特, 娜塔莎·巴拉斯丘克, 莫滕·卡尔斯达尔 申请人:北欧生物科技公司