专利名称：一种醋酸阿托西班及其制剂的含量测定和有关物质测定的方法
技术领域：
本发明涉及一种活性多肽原料药和制剂的方法检测方法，尤其是涉及醋酸阿托西
班及其制剂的含量测定和有关物质测定的方法。
背景技术：
阿托西班(atosiban)，其化学名称为1-酸)-4-L-苏氨酸-8-L-鸟氨酸-催产素。
其结构式为
(3-硫醇丙醇酸)-2-(0-乙基-D酪氨 阿托西班是一种催产素类似物，为人工合成的环状多肽，是子宫内及蜕膜、胎膜上受体的催产素竞争性拮抗剂，在临床上使用其醋酸盐治疗早产。醋酸阿托西班注射液(AtosibanAcetate Injection)由辉凌公司(Ferring AB)研制，2000年3月23日首次在奥地利上市，商品名为Tractocile 。 醋酸阿托西班和醋酸阿托西班注射液的有关物质和含量的检测方法尚未见报道，其测定方法的难度在于在其合成过程中可能会产生缺失(不完全)肽、断裂肽、去酰胺多肽、非对映异构的多肽和低聚物等多种工艺杂质，通过色谱法进行纯化后，无法去除的杂质与主药的色谱行为比较相似，不易完全分离。
发明内容
本发明的目的是提供一种能测定醋酸阿托西班[1-(3-硫醇丙醇酸)-2-(0_乙基-D酪氨酸)-4-苏氨酸-8-鸟氨酸-催产素醋酸盐]及醋酸阿托西班制剂的含量和有关物质的检测方法。 本发明的醋酸阿托西班含量测定方法如下 采用反相高效液相色谱法检测1-(3-硫醇丙醇酸)-2-(0_乙基-D酪氨酸)-4-苏
氨酸_8-鸟氨酸_催产素醋酸盐及其制剂中醋酸阿托西班的含量，其步骤包括 1)取样品适量，用流动相A配制成每lml中含0.75mg的溶液，作为供试品溶液； 2)另称取对照品适量，用流动相A溶解并稀释制成每lml中含0. 75mg的溶液，作
为对照品溶液；
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3)量取供试品溶液与对照品溶液各20 1，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按
外标法以峰面积计算，得到样品中醋酸阿托西班的含量。 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6. 8g，加水至lOOOml，用磷酸调节pH值至2. 3，再加入120 y 1三乙胺，即得)为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为215nm ;流速为1. Oml/min。理论塔板数按阿托西班峰计算应不低于5000。梯度洗脱程序如下
时间(分钟)流动相A (%)流动相B (%)
08020
287327
296040
356040
368020
468020 其中对照品为醋酸阿托西班纯品，可从试剂商店购买。
本发明的有关物质含量测定方法，步骤如下 1)取样品适量，加流动相配制成每1ml中约含1. 5mg的溶液，作为供试品溶液；
2)量取供试品溶液lml，置100ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液； 3)取对照溶液20 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的20%，再精密量取供试品溶液和对照溶液各20iU，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，计算有关物质含量。
色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6. 8g，加水1000ml，用磷酸调节pH值至2. 3，再加入120 yl三乙胺，即得)为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为220nm ;流速为1. Oml/min。理论塔板数按阿托西班峰计算应不低于5000。梯度洗脱程序如下
时间(分钟)流动相A (%) 流动相B (%)
08020
287327
446040
496040
508020
608020 其中所述有关物质是指醋酸阿托西班合成过程中带有的杂质成分，如溶剂，中间
5体，原料，氨基酸片段等，杂质成分为限制成分，测定有关物质目的在于限制其含量。 本发明测定方法的特点是被分析物中各成分间分离彻底，可操作性强，分析方法
专属性强、准确性和灵敏度高、适应性强为保证药品安全、有效、可控提供依据。
图1为0. 1%三氟乙酸乙腈为流动相的色谱图 图2为0. 05mol/L磷酸盐缓冲液乙腈为流动相的色谱图 图3为专属性实验色谱图。 图4为检测限色谱图。 图5为样品有关物质测定的色谱图。 图6为样品含量测定的色谱图。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1 醋酸阿托西班含量测定方法
实验仪器及色谱条件 Waters 515-717-2996高效液相色谱仪，Agilent C18色谱柱(5 ii m，150X4. 6mm)，以0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6. 8g，加水1000ml，用磷酸调节pH值至2. 0 3. 0，再加入120 yl三乙胺，即得)为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为205 225nm ;流速为0. 8 1. 2ml/min ;进样量为5 200iU。。
试剂 乙腈(HPLC级)来自美国天地公司，超纯水为Millipore超纯水机自制。
色谱条件的选择
1.1流动相 我们通过实验比较了 0. 1%三氟乙酸(TFA):乙腈(ACN)与0. 05mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) : ACN，以O. 1%三氟乙酸水溶液作为流动相，基线波动大，杂质峰与主峰无法完全分离，干扰测定；而以0. 05mol/L为流动相，基线平稳，杂质峰与主峰可完全分离，且主峰的对称性好(见图l和图2)。
1. 2检测波长用紫外分光光度计在200 400nm进行连续扫描，样品在215nm处有最大吸收，而有关物质大多在220nm处有较强的吸收。同时考虑基线噪音对检测的干扰并兼顾测定的灵敏度，选择有关物质测定的检测波长定为220nm，含量测定的检测波长为215nm。
1.3样品浓度 本品制剂的浓度为7.5mg/ml，为了实验操作方便准确，分别比较了浓度为0. 75mg/ml与1. 5mg/ml供试品的色谱图，实验结果表明，浓度为1. 5mg/ml的样品杂质峰的峰高及面积均较显著，且未造成色谱柱过载，因此确定有关物质测定样品的浓度为1. 5mg/ml，含量测定样品的浓度为0. 75mg/ml。
检测条件的验证
2. 1专属性 取样品适量，加流动相A溶解并稀释制成浓度为1. 5mg/ml的溶液，每lml加10%氢氧化钠溶液约5滴，室温放置25分钟，取20 ii 1注入色谱仪，记录色谱图(见图3)。结果表明，再次检测条件下，破坏后的样品中其他组分与主峰均可达到基线分离，专属性强。
2. 2检测限 取样品适量，加流动相A溶解并稀释后，取20 iU注入液相色谱仪，记录色谱图，直至主峰峰高为基线噪音的三倍，测得最低检出量约为33. 4ng。
2. 3回收率取样品适量，分别配制成O. 6mg/ml、0. 75mg/ml和0. 9mg/ml3个浓度，每个浓度各3份样，取20iil注入色谱仪，计算回收率。该方法的平均回收率为100.0X，RSDX为0. 1%。
样品测定
3. 1有关物质 取本品适量，加流动相配制成每lml中约含1. 5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液lml，置100ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液20 iU注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的20%，再精密量取供试品溶液和对照溶液各20ia，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍(见图5)。
3. 2含量测定 取本品适量，用流动相A配制成每lml中含0. 75mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取对照品适量，用流动相A溶解并稀释制成每lml中含0. 75mg的溶液，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20 1，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得(见图6)。
权利要求
一种醋酸阿托西班含量测定方法，其特征是，其步骤包括1)取醋酸阿托西班原料或制剂样品适量，用流动相A配制成每1ml中含0.75mg的溶液，作为供试品溶液；2)另称取对照品适量，用流动相A溶解并稀释制成每1ml中含0.75mg的溶液，作为对照品溶液；3)量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中醋酸阿托西班的含量；色谱条件为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶C18为填充剂，流动相以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱方式梯度洗脱，流速0.8～1.2ml/min，检测波长UV 205～225nm，配制的样品溶液浓度每1ml中约含醋酸阿托西班0.1～15mg进样量5～200μl。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于含量测定的的方法为照中国药典2005年版二部附录V D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. 05mol/L的磷酸 盐缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为215nm ;流速为1. 0m1/ min，理论塔板数按阿托西班峰计算应不低于5000，梯度洗脱程序如下时间(分钟)流动相A (%)流动相B (%)08020287327296040356040368020468020其中，磷酸盐缓冲液的配制方法为取磷酸二氢钾6. 8g，加水1000ml，用磷酸调节pH值 至2. 3，再加入120 iil三乙胺，即得；测定法取醋酸阿托西班原料或制剂样品适量，用流动相A配制成每lml中含0. 75mg 的溶液，作为供试品溶液；另精密称取对照品适量，用流动相A溶解并稀释制成每lml中含 0. 75mg的溶液，作为对照品溶液，精密量取供试品溶液与对照品溶液各20iU，分别注入液 相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
3. —种醋酸阿托西班有关物质的检测方法，其特征在于1)取醋酸阿托西班原料或制剂样品适量，加流动相配制成每lml中约含1. 5mg的溶液， 作为供试品溶液；2) 量取供试品溶液lml，置100ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；3) 取对照溶液20 注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的20%，再精密量取供试品溶液和对照溶液各20iU，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，计算有关物质含量；色谱条件为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶C18为填充剂，流动相以0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱方式梯度洗脱，流速0. 8 1. 2ml/min，检测波长UV 205 225nm，配制的样品溶液浓度每lml中约含醋酸阿托西班0. 1 15mg进样量5 200 ii 1，
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于有关物质检测的的方法为照中国药典2005年版二部附录V D高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为220nm ;流速为1. Oml/min，理论塔板数按阿托西班峰计算应不低于5000，梯度洗脱程序如下时间(分钟)流动相A (%)流动相B (%)08020287327446040496040508020608020其中，磷酸盐缓冲液的配制方法为取磷酸二氢钾6. 8g，加水1000ml，用磷酸调节pH值至2. 3，再加入120 iil三乙胺，即得；测定法取醋酸阿托西班原料或制剂样品适量，加流动相A配制成每lml中约含1. 5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液lml，置100ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液，取对照溶液20 ii 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高约为满量程的20%，再精密量取供试品溶液和对照溶液各20iU，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。
全文摘要
本发明涉及一种醋酸阿托西班及其制剂的含量测定和有关物质测定的方法，检测方法为高效液相色谱法，色谱条件为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶(C18)为填充剂；以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为205～225nm；流速为0.8～1.2ml/min，配制的样品浓度为每1ml中约含多肽0.1～15mg，进样量5-200μl，采用本发明的高效液相色谱分析法，可以同时准确测定样品及其杂质的含量，分析过程中样品分离彻底，分析结果重现性好，为生产进程中的质量控制分析提供了简单可靠的方法。
文档编号G01N30/02GK101696959SQ20091000888
公开日2010年4月21日 申请日期2009年2月11日 优先权日2009年2月11日
发明者付建兴, 周宗贞, 崔学云, 杨平, 王文, 马中刚 申请人:海南中和药业有限公司;海南中和多肽药物研发有限公司;