专利名称：：一种快速检测海洋生物体内综合毒性的方法
技术领域：
：本发明涉及了一种快速检测海洋生物体内综合毒性的方法。
背景技术：
：海洋生物是人类不可或缺的食物种类之一，随着污染加剧，海洋食品的安全问题引起了广泛的重视。对于海洋生物体内毒性的检测，目甜都为化学分析法，不但检测时间长、操作复杂，而且不能反映出生物体内的综合毒性。对于目前污染物种类的闩益增多，传统的检测方法往往是滞后的，缺乏一种快速的检测方法是目前常规方法中存在的重大缺陷。
发明内容本发明针对上述问题，提供了一种快速检测海洋生物体内综合毒性的方法。为达到上述目的，本发明采用了以下的技术方案，具体为一、发光细菌的培养-采用明亮发光杆菌T3变种(尸/wto^"m'wmp/i(w;7/wm/m)制备发光细菌新鲜菌悬液(1)斜面菌种培养在新鲜斜面上接出第一代斜面，25。C士0.5。C培养24h后立即转接第二代斜面，25。C士0.5。C培养24h后再转接第三代斜面，25。C士0.5。C培养24h后备用；(2)摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml培养液的100ml烧瓶中，25。C士0.5。C，160r/min下培养24h备用;(3)将培养后的发光细菌新鲜菌悬液稀释至每毫升108个109个细胞，初始发光度不低于800mV，备用。斜面和菌液的营养基为胰蛋白胨0.5gNaCl3gNa2HP040.5gKH2P040.5g酵母0.5g甘油0.3g蒸馏水100ml固体培养基加琼脂1.69g二、生物样本的制备取生物样品10g，放入搅碎机打碎，加入50ml(V/V)0.1%的含二甲亚砜的人工海水，振荡30min，6000r离心6min，取上清液进行测试。三、发光细菌相对发光度的测定测定时的室温要控制在2o~25°c，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过士rc;取若干试管，部分作为对照管的试管中每支加1.98ml的人工海水，作为样品管的试管中每支加入歩骤二制备的生物样本上清液1.98ml，向每支试管中加入歩骤一制备的备用的发光细菌菌液0.02ml，放入发光光度计中检测。样品管发光度相对放光度(％)=四、毒性评价根据表2评价毒性。对照管发光度(mF)表2毒性评价表<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本发明的有益效果是简单、省时，能够快速检测海洋生物体内的综合毒性。具体实施例方式实施例1大连凌水贝样检测一、发光细菌的培养菌种采用明亮发光杆菌T3变种(尸/wto^c&〃'wwp/2^T^orew/w)，制备发光菌亲斤鱼羊菌悬^夜(l)斜面菌种培养在新鲜斜面上接出第一代斜面，25。C士0.5t:培养24h后立即转接第二代斜面，25。C士0.5。C培养24h后再转接第三代斜面，25t^0.5。C培养24h后备用。(2)摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml三角烧瓶中，25°C±0.5°C，160r/min下培养24h备用。(3)将培养后的发光细菌菌悬液稀释至每毫升108个~109个细胞，初始发光度不低于800mV,备用。斜面和菌液的营养基为胰蛋白胨0.5gNaCl3gNa2HP040.5gKH2P040.5g酵母0.5g甘油0.3g蒸馏水100ml固体培养基加琼脂1.69g二、生物样本的制备在大连凌水附近取贝类10g，放入搅碎机打碎，加入50ml(V/V)0.1%的含二甲亚砜的人工海水。振荡30min，6000r离心6min，取上清液进行测试。三、发光细菌相对发光度的测定测定时的室温要控制在2o~25°c，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过士rc;在试管架上按下列方式排列测试管左侧放对照管，右侧放样品管，每管3个重复，具体摆放位置见表l。表l试管在试管架上的排列对照管样品管空白l空白2空白3样l样l样l给每支作为对照管的试管加1.98ml的人工海水，给每支作为样品管的试管加入歩骤二制备的生物样本上清液1.98ml，向每管中加入步骤一制备的备用的发光细菌菌液0.02ml，放入发光光度计中检测。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>四、毒性评价算出相对发光度为39.9%，查对表2为重毒。实施例2大连黑石礁贝样检测一、发光细菌的培养-菌种采用明亮发光杆菌T3变种(P/ioto6ac欣hw^/jo印/zomwO，制备发光菌新鲜菌悬液(1)斜面菌种培养在新鲜斜面上接出第一代斜面，25。C士0.5。C培养24h后立即转接第二代斜面，25。C士0.5。C培养24h后再转接第三代斜面，25。C士0.5。C培养24h后备用。(2)摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml三角烧瓶中，25。C士0.5。C，160r/min下培养24h备用。(3)将培养后的发光细菌菌悬液稀释至每毫升108个~109个细胞，初始发光度不低于800mV，备用。斜面和菌液的营养基为胰蛋白胨0.5gNaCl3gNa2HP040.5gKH2P040.5g酵母0.5g甘油0.3g蒸馏水100ml固体培养基加琼脂1.69g二、生物样本的制备-在大连黑石礁附近取贝类10g，放入搅碎机打碎，加入50ml(V/V)0.1%的含二甲亚砜的人工海水。振荡30min，6000r离心6min，取上清液进行测试。三、发光细菌相对发光度的测定同实施例1。四、毒性评价算出相对发光度为28.3%，査对表2为高毒。权利要求1、一种快速检测海洋生物体内综合毒性的方法，其特征在于，该方法步骤如下一、发光细菌的培养采用明亮发光杆菌T3变种(Photobacteriumphosphoreum)制备发光细菌新鲜菌悬液(1)斜面菌种培养在新鲜斜面上接出第一代斜面，25℃±0.5℃培养24h后立即转接第二代斜面，25℃±0.5℃培养24h后再转接第三代斜面，25℃±0.5℃培养24h后备用；(2)摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml培养液的100ml烧瓶中，25℃±0.5℃，160r/min下培养24h备用；(3)将培养后的发光细菌新鲜菌悬液稀释至每毫升108个～109个细胞，初始发光度不低于800mV，备用；斜面和菌液的营养基为胰蛋白胨0.5gNaCl3gNa2HPO40.5gKH2PO40.5g酵母0.5g甘油0.3g蒸馏水100ml固体培养基加琼脂1.69g二、生物样本的制备取生物样品10g，放入搅碎机打碎，加入50ml(V/V)0.1％的含二甲亚砜的人工海水，振荡30min，6000r离心6min，取上清液进行测试；三、发光细菌相对发光度的测定测定时的室温要控制在20～25℃，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±1℃；取若干试管，部分作为对照管的试管中每支加1.98ml的人工海水，作为样品管的试管中每支加入步骤二制备的生物样本上清液1.98ml，向每支试管中加入步骤一制备的备用的发光细菌菌液0.02ml，放入发光光度计中检测。全文摘要本发明涉及一种快速检测海洋生物体内综合毒性的方法，该方法通过发光细菌的培养、生物样本的制备、发光细菌相对发光度的测定检测海洋生物体内综合毒性，发光细菌采用海水发光细菌—明亮发光杆菌T3变种(Photobacteriumphosphoreum)，将海洋生物样本的上清液与发光细菌的菌液混合，通过测定发光细菌的相对发光度，判定所测样品的综合毒性，给出毒性级别，本发明简单、省时，能够快速检测海洋生物体内的综合毒性。文档编号G01N33/48GK101551381SQ20091001061公开日2009年10月7日申请日期2009年3月6日优先权日2009年3月6日发明者刘长安,张世宇,慧王申请人:国家海洋环境监测中心