专利名称：：一种血清中MG7-Ag的定量检测方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及血清中MG7-Ag的检测方法，特别涉及一种血清中MG7-Ag的定量检测方法。
背景技术：
：恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。恶性肿瘤的研究及应用方向已从以治疗为主转向防治结合。肿瘤的早期诊断尤为重要，它决定了肿瘤治疗的成败。胃癌是我国常见重大恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均在继续上升。目前用于胃癌早期筛査最可靠的途径是内窥镜检查结合活体组织病理检査。但是，对于少数夹杂在正常组织细胞中的形态不典型胃癌细胞、分化差或未分化的胃癌细胞、发生淋巴结转移的胃癌肿瘤鉴别难度很大；而肿瘤标志物的检查是一种很有效的方法。肿瘤标志物(Cancerbiomarker)的发现和应用是一个系统的方法，从高危人群的筛查、早期癌症的检出，到诊断及定位、机体对治疗的反应及预后观察，直至癌症复发的检测，肿瘤标志物发挥了重要的作用。目前临床常用的胃癌的肿瘤标志物有CEA、CA19-9、CA72-4等，受CEA、CA19-9和CA72-4标志物特异性的限制，能够检测到以上标志物的绝大多数患者，其病情已进入中晚期。樊代明等人最新发现了一种胃癌特异性抗原MG7-Ag(LeeCH,LumJH，FanDMe/a/.Proteomics.2005;5(4):1160-1166)，并针对该抗原制备了鼠源性单克隆抗体MG7(FanDM,ZhangXY,ChenXTetal.JournalofGastroenerologyandHepatology.2005;20(3):360-365)。在组织学研究中发现，MG7-Ag在胃癌中阳性率达90X以上，在正常胃粘膜中不表达。MG7-Ag表达量在萎縮性胃炎、异型增生及胃癌组织中呈渐进递增，同时对MG7-Ag阳性的萎縮性胃炎及异型增生患者随访，其转癌率显著增高(LiuJ,HuJL,FanDM"a/.IntJClinPract.2002;56(3):169-172)。国家973项目(G1998051203)通过严格"双盲"前瞻回顾性研究证实，胃粘膜上皮肠化生、异型增生呈MG7-Ag阳性表达者与阴性表达者相比较，病变进展危险性增加25—40多倍，提示MG7-Ag与胃癌发生发展和分化有良好的相关性，对于检测胃癌的高危个体有重要的应用价值。现有对于MG7-Ag的定量检测主要是通过酶联免疫(ELISA)方法，其包括包被、抗原抗体反应、二抗反应、显色、读板等步骤。由于血清中MG7-Ag属于微量抗原，含量很小，酶联免疫测定方法敏感度仅达ng水平，精度不高，容易出现误差，无法实现准确定量。实时荧光定量PCR技术出现于1996年，该技术的核心是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别；而后荧光的产生进入指数扩增期，荧光水平随之呈指数增长；最后在PCR到达平台期时荧光水平达到饱和，且由于PCR技术是指数扩大系统，微小误差的指数放大使终产物量存在较大的离散度。而实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统PCR只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。设定检测点荧光值在指数扩增阶段为荧光阈值，当荧光信号强度到达所设定的荧光阈值时，自动记录荧光信号达到荧光阈值所经历的循环数(C(T)值)。已经证实，每个模板的C(T)值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，C(T)值越小。因此利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线对未知样本进行定量测定。由于PCR循环在到达C(T)值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此C(T)值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的C(T)值是恒定的。基于以上两大特点，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。由于传统定量方法都是PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过指数期扩增到达平台期时，检测重现性极差，无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量、粗略定量的方法。外标法定量和内标法定量的方法学比较后的结论是内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。随着实时荧光定量PCR技术的不断推广和普及，该技术已被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等重要领域。主要集中在以下几个方面1、DNA或RNA的绝对定量分析，包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。2、基因表达差异分析，例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差异显示结果的确证。3.基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。但是，实时荧光定量PCR技术仅限于核酸定量。
发明内容本发明目的在于提供一种血清中MG7-Ag的定量检测方法。本发明通过以下技术方案实现一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，包括以下步骤1)包被将ELISA板孔分为标准品孔、检测样品孔；标准品孔加入梯度浓度稀释的MG7-Ag的标准品，每孔100|^1;检测样品孔加入90ial待测血清及10pl的IO倍稀释的包被缓冲液，混匀；ELISA板孔4"过夜，弃去液体，PBS-T液洗涤；2)封闭每孔加入5mg/mlBSA的封闭液，37。C孵育lh，PBS-T液洗涤；3)抗原抗体反应每孔加入100plMG7抗体，37。C孵育lh，PBS-T液洗漆；4)二抗反应每孔加入lOO)iil的生物素化的抗鼠源性二抗，37'C孵育lh，PBS-T液洗涤;5)链亲和素结合每孔加入100|Lil的链亲和素，37"C孵育45min,PBS-T液洗涤；6)生物素化DNA报告分子结合每孔加入30^1的生物素化DNA，37。C孵育lh，PBS-T液洗涤；7)实时荧光定量PCR反应以每孔所得生物素化DNA为模板分别进行实时荧光定量PCR反应，其中PCR反应条件为94"C预变性5min，94。C变性45s，60。C退火30s，72。C延伸30s;3540个循环结束后于72。C延伸IO分钟，以PCR扩增生物素化DNA的Tm温度处读取荧光检测量，得到每孔对应的PCR扩增曲线；8)确定检测样品的循环数根据检测样品孔对应的一组PCR扩增曲线，得到每孔检测样品达到所述荧光检测阈值处的循环数；9)绘制标准曲线根据每个标准品孔的标准品浓度和其达到荧光检测阈值的循环数的对应关系，建立标准曲线；10)确定检测样品的MG7-Ag含量根据标准曲线，按照每孔检测样品的循环数确定其MG7-Ag含量。所述的生物素化DNA是生物素标记的非特异性序列DNA。所设定的荧光检测阈值处于PCR扩增曲线的指数阶段。所述标准品为纯化的MG7-Ag。所述标准品为表面表达MG7-Ag抗原的胃癌细胞的裂解液。与现有技术相比，本发明的有益的技术效果1、与酶联免疫法定量检测MG7-Ag相比，本发明所提供的方法兼具了抗原抗体反应的高敏感性、高特异性和荧光定量PCR精确定量的特点；在保持了抗原抗体反应的高特异性的同时，血清中MG7-Ag含量的信号得到放大，提高了微量抗原MG7-Ag定量检测的敏感性，敏感性比传统的ELISA方法高出103倍。2、实时荧光定量免疫PCR技术采用外标定量法，以含量确定的MG7-Ag作为标准品，精确定量患者血清中MG7-Ag含量。3、本发明所提供的方法利用单克隆抗体MG7检测血清中微量抗原MG7-Ag，该抗体的胃癌高特异性决定了该方法的高特异性。4、采用标准、规范的标准品是确保检测结果一致的必要条件，而实时荧光定量免疫PCR采用外标法定量，可统一检测标准，排除室间差异，从而保证了MG7-Ag定量检测的通用性和可重复性。图1是实时荧光定量免疫PCR反应流程示意图。图2是标准品(A3、B3、C3、D3、E3、F3、G3、H3)的一组实时荧光PCR扩增曲线图，其中横坐标代表循环数(Cycle)，纵坐标代表荧光检测值(Fluorescence)。图3是图2的标准曲线图，其中横坐标代表C(T)值，纵坐标代表抗原MG7-Ag抗原的浓度含量的对数值(LogQuantity)。图4是待检测样品(A4、B4、C3、D4、E4、F4、G4、H4)的一组实时荧光PCR扩增曲线图,其中横坐标代表循环数(Cycle)，纵坐标代表荧光检测值(Fluorescence)。具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明。本发明通过实时荧光定量免疫PCR检测方法来实现精确定量检测血清中痕量抗原MG7-Ag的含量。将实时荧光定量PCR技术与抗原抗体反应系统相结合，建立实时荧光定量免疫PCR技术。此项技术通过生物素、链亲和素的高亲和性将抗原抗体反应和荧光定量PCR技术相结合，利用抗原抗体反应的高敏感性、高特异性和荧光定量PCR精确定量的特点来定量检测血清中痕量抗原MG7-Ag，其反应流程如图l所示。以含量确定的梯度浓度稀释MG7-Ag的标准品，根据不同浓度的标准品与达到设定荧光检测阈值的循环数(C(T)值)的对应关系，建立标准曲线，然后根据待检测样品的C(T)值，在标准曲线上确定待检测样品的MG7-Ag的含量。建立的定量检测方法所需材料主要包括封闭液、MG7抗体、生物素化抗鼠源性二抗、链亲和素、生物素标记DNA、realtime-PCR试剂盒。具体为包被缓冲液pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液；封闭液5mg/ml牛血清白蛋白(BSA);稀释液含lmg/mlBSA的0.15MPBS缓冲液；洗涤缓冲液含0.05%Tween-20的pH7.4、0.15M磷酸盐缓冲液(PBS-T液)；MG7抗体为鼠源性单克隆抗体，公开文献FanDM，ZhangXY，ChenXTetal.JournalofGastroenerologyandHepatology.2005;20(3):360-365，实验室纯化制备；9抗鼠源性生物素化二抗、链亲和素、realtime-PCR试剂盒，均商购可得。其中，本实施例采用羊抗鼠生物素化二抗，商购于中杉试剂公司；链亲和素，商购于Thermo公司；realtime-PCR试剂盒，商购于TaKaRa公司；生物素标记DNA:所述DNA序列为非特异性序列，按照常规技术手段进行生物素标记。本实施例采用光敏生物素法标记DNA，并用乙醇沉淀法纯化；采用紫外分光光度计定量并计算标记DNA摩尔数。所述标准品采用确定含量的MG7-Ag:比如浓度确定的纯化的MG7-Ag;或者表面表达MG7-Ag的胃癌细胞的裂解液，如胃癌细胞SGC7901，MKN45,KATOin细胞系等；或者其他含有MG7-Ag的组织、体液、细胞等制备的标准品。以纯化的MG7-Ag作为标准品，定量检测血清中痕量抗原MG7-Ag的浓度含量；以胃癌细胞SGC7901作为标准品，定量检测血清中痕量抗原MG7-Ag的含量可以用胃癌细胞SGC7901的细胞数表示。以胃癌细胞SGC7901作为标准品时，首先对细胞悬浮液细胞计数，然后反复冻融后裂解细胞，得到细胞裂解母液；对母液进行梯度浓度稀释后分别加入到标准品孔，比如相当于l(^l(^细胞/孔的梯度浓度；根据标准曲线，待测血清中痕量抗原MG7-Ag的含量可表示为相应的胃癌细胞表达的抗原含量或者用胃癌细胞数表示。实施例采用梯度浓度稀释的纯化的MG7-Ag的标准品时，其纯化方法如下1)组织匀浆的制备新鲜胃癌组织在4。C水浴或冰浴中用生理盐水洗去血迹及污物，去除包膜或结缔组织，将洗净的组织剪成0.30.5cm"j、块，加入适量生理盐水，装入捣碎机筒内制成组织匀浆。组织匀浆经3000r/min离心10min后，去除细胞及组织碎片，上清液存留待用。或者细胞破碎收集胃癌细胞株SGC7901或MKN45，细胞计数后，将细胞置液氮中10分钟，然后取出在37。C融化，反复操作三次冻融细胞；去除细胞碎片，经3000r/min离心10min后，上清液存留待用。2)MG7-Ag粗提饱和硫酸铵盐析组织匀浆或细胞裂解上清液，使硫酸铵饱和度达50%，沉淀4。C过夜，用pH7.2，O.15mol/LPBS透析三次，过DEAE凝胶柱粗提，对MG7-Ag进行初步纯化。3)亲和层析纯化MG7-Ag:制备MG7亲和层析柱，将MG7-Ag粗提物用pH7.2，0.15mol/LPBS透析过夜，上样后经pH7.2，0.15mol/LPBS平衡的MG7亲和层析柱，流速0.5ml/分钟；然后用0.15mol/LPBS流洗至洗脱液OD280《0.02，再用pH2.4、0.1mol/L甘氨酸-HCl洗脱，洗脱液立即转至pH7.2，0.15mol/LPBS中透析过夜即得，并测定其蛋白浓度、纯度和活性。实施例以胃癌细胞SGC7901中的MG7-Ag作为标准品，定量检测的待测血清中的MG7-Ag含量，具体包括以下步骤1)包被将ELISA板孔分为标准品孔、检测样品孔；标准品孔梯度浓度稀释MG7-Ag的标准品，每孔100pl;检测样品孔加入90pl待测血清及10pl的IO倍稀释的包被缓冲液，混匀；ELISA板孔4'C过夜，弃去液体，PBS-T液洗涤3次，每次5min。具体为胃癌细胞SGC7901中的MG7-Ag作为标准品，以每孔107、106、105、104、103、102、101、0个细胞的浓度梯度稀释加入标准品孔(A3、B3、C3、D3、E3、F3、G3、H3);制备待测血清抽取2ml血液，室温静置30分钟，3000rpm20分钟，吸取上清置4。C待用；加入上述制备的待测血清及10的10倍稀释的包被缓冲液，混匀。2)封闭每孔加入5mg/mlBSA的封闭液，37。C孵育lh，PBS-T液洗涤3次，每次5min。3)抗原抗体反应每孔加入2pg/ml10(HilMG7抗体，37t:孵育lh，PBS-T液洗涤3次，每次5min。4)二抗反应每孔加入5jLig/mllO(^l的生物素化的羊抗鼠二抗，37°C孵育lh，PBS-T液洗涤3次，每次5min。5)链亲和素结合每孔加入3pg/mllOOpl的链亲和素，37。C孵育45min,PBS-T液洗涤3次，每次5min。6)生物素化DNA报告分子结合每孔加入lpg/ml30^1的生物素化DNA，37i:孵育lh，PBS-T液洗涤3次，每次5min。具体为以ROBOl基因(NM—002941)的cDNA作为DNA报告分子，对其进行生物素化后加入到ELISA板孔中，标记MG7抗原抗体反应；其进行PCR扩增得到248bp大小的片段，扩增的引物对为正向弓I物P:gctctagagcatccctgtcttaactg反向弓I物R:gctctagagcaaacgcttctcaacat7)实时荧光定量PCR反应以每孔所得生物素化DNA为模板分别进行实时荧光定量PCR反应，其中PCR反应条件为94匸预变性5min，94°C变性45s，6(TC退火30s，72。C延伸30s;3540个循环结束后于72"C延伸IO分钟，以PCR扩增生物素化DNA的Tm温度处读取荧光检测量，得到每孔对应的PCR扩增曲线。具体为所选ROBOl基因cDNA的Tm温度为84°C，其在Tm温度时具有最高荧光值，所以每个循环读取荧光检测的温度为84"C，得到real-timePCR仪记录的扩增曲线8)确定检测样品的循环数根据检测样品孔对应的一组PCR扩增曲线，得到每孔检测样品达到所述荧光检测阈值处的循环数；9)绘制标准曲线根据每个标准品孔的标准品浓度和其达到荧光检测阈值的循环数的对应关系，建立标准曲线；10)确定检测样品的MG7-Ag含量根据标准曲线，按照每孔检测样品的循环数确定其MG7-Ag含量。按照上述步骤8)、9)、10)，本实施例得到如图2所示的标准品的一组扩增曲线和如图4所示的检测样品的一组扩增曲线，其中取荧光检测阈值为0.020，得到以下实验数据(a)标准品WellDyeTypeLabelC(T)MG7-Ag(number)A3Run1:SYBStandard3.100107B3Run1:SYBStandard3.987106C3Run1:SYBStandard9.750105D3Run1:SYBStandard12.540104E3Run1:SYBStandard16.120103F3Run1:SYBStandard18.102102G3Run1:SYBStandard19.473101H3Run1:SYBStandard22.9410))检测样品WellDyeTypeLabelC(T)MG7-Ag(number)A4Run1:SYBSample13.5322547.62B4Run1:SYBSample13.1033546.11C4Run1:SYBSample13.2523162.52D4Run1:SYBSample14.926跳5E4Run1:SYBSample14.979835.871F4Run1:SYBSample15.386610.595G4Run1:SYBSample13.0683642.73H4Run1:SYBSample12.1697283.78从标准品的一组扩增曲线得到不同浓度的标准品达到设定荧光检测阈值的循环数(C(T)值)；标准品的MG7-Ag的浓度的对数值与C(T)值成线性关系，如图3所示的标准曲线，横坐标是C(T)值、纵坐标是抗原MG7-Ag含量的对数值。从检测样品的一组扩增曲线得到不同浓度的检测样品达到设定荧光检测阈值的循环数(C(T)值)；根据标准曲线，按照待检测样品所得C(T)值确定待测样品的MG7-Ag的浓度含量。具体数据如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>ROBOl基因PCR扩增的引物对核苷酸序列表<110>中国人民解放军第四军医大学<120>—种血清中MG7-Ag的定量检测方法<160>2<210>1<211>26<212>DNA<213>ROB01基因PCR扩增的正向引物<400>1gctctagagcatccctgtcttaactg26<210>2<211>26<212>DNA<213>ROB01基因PCR扩增的反向引物<400>1gctctagagcaaacgcttctcaacat2权利要求1、一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤1)包被将ELISA板孔分为标准品孔、检测样品孔；标准品孔加入梯度浓度稀释的MG7-Ag的标准品，每孔100μl；检测样品孔加入90μl待测血清及10μl的10倍稀释的包被缓冲液，混匀；ELISA板孔4℃过夜，弃去液体，PBS-T液洗涤；2)封闭每孔加入5mg/mlBSA的封闭液，37℃孵育1h，PBS-T液洗涤；3)抗原抗体反应每孔加入100μlMG7抗体，37℃孵育1h，PBS-T液洗涤；4)二抗反应每孔加入100μl的生物素化的抗鼠源性二抗，37℃孵育1h，PBS-T液洗涤；5)链亲和素结合每孔加入100μl的链亲和素，37℃孵育45min，PBS-T液洗涤；6)生物素化DNA报告分子结合每孔加入30μl的生物素化DNA，37℃孵育1h，PBS-T液洗涤；7)实时荧光定量PCR反应以每孔所得生物素化DNA为模板分别进行实时荧光定量PCR反应，其中PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸30s；35～40个循环结束后于72℃延伸10分钟，以PCR扩增生物素化DNA的Tm温度处读取荧光检测量，得到每孔对应的PCR扩增曲线；8)确定检测样品的循环数根据检测样品孔对应的一组PCR扩增曲线，得到每孔检测样品达到所述荧光检测阈值处的循环数；9)绘制标准曲线根据每个标准品孔的标准品浓度和其达到荧光检测阈值的循环数的对应关系，建立标准曲线；10)确定检测样品的MG7-Ag含量根据标准曲线，按照每孔检测样品的循环数确定其MG7-Ag含量。2、如权利要求1所述的一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，所述的生物素化DNA是生物素标记的非特异性序列DNA。3、如权利要求1所述的一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，所设定的荧光检测阈值处于PCR扩增曲线的指数阶段。4、如权利要求1所述的一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，所述标准品为纯化的MG7-Ag。5、如权利要求1所述的一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，所述标准品为表面表达MG7-Ag的胃癌细胞的裂解液。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，涉及血清中MG7-Ag的检测方法，公开了一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，具体包括以下步骤1)包被标准品、检测样品；2)封闭；3)抗原抗体反应；4)二抗反应；5)链亲和素结合；6)生物素化DNA报告分子结合7)实时荧光定量PCR反应，得标准品和检测样品对应的两组PCR扩增曲线；8)根据荧光检测阈值，确定检测样品的循环数；9))根据荧光检测阈值，确定标准品的循环数，并绘制标准曲线；10)根据标准曲线，按照每孔检测样品的循环数确定其MG7-Ag含量。文档编号G01N33/577GK101533010SQ200910021300公开日2009年9月16日申请日期2009年2月27日优先权日2009年2月27日发明者乔泰东,吴开春,李泉江,锐杜,樊代明,君贴,峥陈申请人:中国人民解放军第四军医大学