专利名称：化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法
化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法 技术领域-
本发明涉及一种血清小而密低密度脂蛋白检测方法。
背景技术：
目前检测sdLDL的方法主要包括梯度凝胶电泳(Gradient Gel Electrophoresis, GGE);密度梯度超速离心 (Density gradient ultracentrifugation， DGUC) 5核磁共振(Nuclear magnetic resonance, 丽R)光谱法等，这些方法都是针对sdLDL某一方面的特性进行检测， 各自有不同程度的局限性，如操作繁琐、耗时(需24小时以上)、需特 殊昂贵设备(有的仪器需100多万元)、操作要求极高等，因而这些方 法仅限于实验室研究使用，没有得到普及。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测sdLDL准确可靠的化学沉淀法检测 血清小而密低密度脂蛋白的方法。
本发明的技术解决方案是 一种化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是 包括下列步骤
1)测试前标本处理取肝素一镁试剂0.2ml加入0.2ml血清置于 1.5ml离心管中，混匀，试管密封置37'C孵育10min，立即转放置4。C冰 箱15min， 12 000rpm离心15min，取上清液作为待测标本；所述肝素一镁试剂是含145U/mL肝素、氯化镁79mmol/U 0. lg/L硫酸葡聚糖的试剂;
2)检测经过方法处理后待测样本中仅含sdLDL而无其他低密度 脂蛋白胆固醇，测定待测样本中LDL-C浓度即得该样本sdLDL浓度；具 体测试方法如下
采用包括R,、R2试剂的胆固醇试剂盒进行双试剂测定，R3式剂中含有 聚阴离子与sdLDL形成复合物而遮蔽sdLDL-C，血清中HDL在表面活性 剂作用下与酶试剂产生不完整的Trinder反应，反应中产生的&02在缺 乏偶联剂时被消耗而不显色；当加入R2试剂时，含对sdLDL-C有特异作 用的表面活性剂能水解sdLDL-C，释放出其胆固醇，参与完整的Trinder 反应，测定546nm处的吸光度与sdLDL-C的浓度成正比，测定仪器为全 自动生化分析仪。结果计算sdLDL-C (mniol/L)=标本吸光度/参考品 吸光度X参考品浓度(注各吸光度计算AA二A2—AJ
测定主要参数为采用二点终点法，定标模式采用二点定标，反应 方向为上升，主波长为546nm，副波长为600nm，反应温度为37。C。
采用包括R,、R2试剂的胆固醇试剂盒对待测样本进行双试剂测定时， 先将待测样本与R3式剂反应300秒，再与R2试剂反应300秒，待测样本、 R3式剂、R2试剂的体积比为1:75:25。
本发明
a)反应原理肝素与镁离子，并加入适量添加剂沉淀血清中大 部分含ApoB的脂蛋白[VLDL、 Lp (a)、大而轻低密度脂蛋白(large, buoyant LDL， 1LDL)]，而HDL与sdLDL不被沉淀，直接测定上清液中b) 试剂与仪器血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固 醇、低密度脂蛋白胆固醇试剂由上海北海生物技术工程有限公司提供； 载脂蛋白A1、 B试剂由上海捷门生物技术有限公司提供；葡萄糖试剂由 温州东瓯生物科技有限公司提供；氯化镁由上海凌峰化学试剂有限公司
提供，高密度胆固醇纯品、添加剂由Sigma公司提供，浓度为5. 9mg/ml。 全自动生化分析仪日立7600-020;低温超速离心机Beckman-Coulter公 司AllegraTM 64R;
c) 标本收集研究对象禁止荤食3天，早晨禁止饮食和喝水，取 静脉血2ml，置有盖密封试管，37。C静置30min，3000转/min离心10min， 取上层血清，密封，作为待测样本，2h内完成所有生化指标检测，若不 能完成需密封放置一7(TC保存，保存时间不超过2个月。
本发明准确可靠，为sdLDL的检测提供了一种简便、快速的方法。 下面结合实例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式
a) 反应原理肝素与镁离子，并加入适量添加剂沉淀血清中大部 分含ApoB的脂蛋白[VLDL、Lp(a)、大而轻低密度脂蛋白(large, buoyant LDL， 1LDL)]，而HDL与sdLDL不被沉淀，直接测定上清液中LDL-C浓 度即得sdLDL-C含量；
b) 试剂与仪器血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、
低密度脂蛋白胆固醇试剂由上海北海生物技术工程有限公司提供；载脂
蛋白A1、 B试剂由上海捷门生物技术有限公司提供；葡萄糖试剂由温州 东瓯生物科技有限公司提供；氯化镁由上海凌峰化学试剂有限公司提供，高密度胆固醇纯品、添加剂由Sigma公司提供，浓度为5.9mg/ml。 全自动生化分析仪日立7600-020;低温超速离心机Beckman-Coulter公 司AllegraTM 64R;
c) 标本收集研究对象禁止荤食3天，早晨禁止饮食和喝水，取静 脉血2ml，置有盖密封试管，37。C静置30min， 3000转/min离心10min， 取上层血清，密封，作为待测样本，2h内完成所有生化指标检测，若不 能完成需密封放置一7(TC保存，保存时间不超过2个月；
d) 测试前标本处理取肝素一镁试剂0.2ml加入0.2ml血清置于 1.5ml离心管中，混匀，试管密封置37。C孵育10min，立即转放置4。C冰 箱15min， 12 000rpm离心15min，取上清液作为待测标本；所述肝素一 镁试剂是含145U/mL肝素、氯化镁79mmol/L、 0. lg/L硫酸葡聚糖的试剂；
e) 检测经过方法处理后待测样本中仅含sdLDL而无其他低密度 脂蛋白胆固醇，测定待测样本中LDL-C浓度即得该样本sdLDL浓度；具 体测试方法如下
采用包括R'、R2试剂的胆固醇试剂盒进行双试剂测定，R3式剂中含有 聚阴离子与sdLDL形成复合物而遮蔽sdLDL-C，血清中HDL在表面活性 剂作用下与酶试剂产生不完整的Trinder反应，反应中产生的HA在缺 乏偶联剂时被消耗而不显色；当加入R2试剂时，含对sdLDL-C有特异作 用的表面活性剂能水解sdLDL-C，释放出其胆固醇，参与完整的Trinder 反应，测定546醒处的吸光度与sdLDL-C的浓度成正比，测定仪器为全 自动生化分析仪。
测定主要参数为采用二点终点法，定标模式采用二点定标，反应方向为上升，主波长为546nm，副波长为600nm，反应温度为37'C。
采用包括&、 R2试剂的胆固醇试剂盒对待测样本进行双试剂测定 时，先将待测样本与&试剂反应300秒，再与R2试剂反应300秒，待测样 本、Rrl式剂、fU式剂的体积用量分别为3 m、 225 "、 75 ul。
统计学处理:应用SPSS 11.5统计分析软件包，计量资料采用t检验，
并分别计算均数(；)、标准差")和变异系数，所得结果表示为均数士标 准差(；士s);计数资料采用xs检验，显著性差异的概率均设为P〈0.05。 还取健康体检者138例为对照组，年龄22 52岁，平均年龄(31.8 ± 8)岁，其中男性71例，女性67例，所有健康体检者无心脑血管疾病， 无糖尿病，以及其他影响脂质代谢的疾病，且近2个月未服用影响血脂 的药物如他汀类药物等；经冠状动脉血管造影证实初诊冠心病人30例， 均未使用如他汀类药物，男性16例，女性14例，年龄35 72岁，平均年 龄(51.8 ± 6.7)岁。采用上述方法进行sdLDL浓度检测，结果健康 体检者sdLDL浓度为O. 5±0. 28mmol/L，中位数为O. 48腿ol/L，最大浓 度l. 12腿ol/L。 sdLDL浓度与TG、 ApoB、 LDL、 HDL相关性分别为O. 642、 0.723、 0.812、 -0.256。 6名健康体检者sdLDL浓度为"0"，占总健康体 检者4.3% (6/138)。其中男性sdLDL浓度明显高于女性sdLDL浓度
(0. 57±0. 27， 0. 40±0, 32， P〈0.05)。 30例冠心病患者sdLDL浓度为 1.3士0.41鹏ol/L，中位数为1.28腿ol/L，在30例冠心病患者中占27%
(8/30)的患者LDL—C浓度超过正常范围，sdLDL浓度与与TG、 ApoB、 LDL、 HDL相关性分别为O. 742、 0.78、 0.672、 -0.231。见表l:表l对照组与病例组血脂检测结果
nCHOL (mmol/UTG (mm亂)LDL-C (nmiol/L〉HDL-C (訓ol/L)ApoB (mg/dl)sdLDL-C(mmol/L)
对照组1384- 13土0. 560, 96 ±0. 482, 47 ±0. 181. 17±0.2178±170.5±0. 28
冠心病组304. 24 ±0. 781. 64±0. 52*2. 75 ±0. 23"1. 26±0.,89±19w1. 3土0.41*
f) 方法特异性将HDL纯品配制成低值2.0ramol/L和高值 5. Ommol/L，超速离心制备得到的sdLDL纯品配制成低值0. 5腿ol/L和 高值2.0mmol/L以及超速离心制得不含sdLDL血清(LDL-C浓度为
4. l咖ol/L， HDL-C浓度为2. 2ramol/L)按照方法中所描述进行样本处理， 各样本重复测定5次，测得HDL低值2.0士0.05腿ol/L，高值
5. 0±0. l腿ol/L; sdLDL低值O. 5±0. 03mmol/L，高值2. 0±0. 09mmol/L， 不含sdLDL血清LDL-C浓度为0. 0隨ol/L， HDL-C浓度为2. 2 mmol/L ± 0. 09ramol/L，说明该法仅沉淀除sdLDL以外的其他含ApoB的胆固醇， 不能沉淀HDL与sdLDL;
g) 添加剂的影响将sdLDL纯品低值O. 5ramol/L和高值2. 0mmol/L 用不含0. 1%添加剂的沉淀剂处理后测得其浓度为低值0.41 ± 0.04 咖ol/L和高值1. 53±0. 11咖ol/L (f5);用含0. lg/LM硫酸葡聚糖的 沉淀剂处理后测得其浓度为低值0.5土0.03mmol/L，高值2.0 ± 0.09 mmol/L (n二5)。不含0. lg/L硫酸葡聚糖的沉淀剂处理标本时，约使 209&sdLDL被沉淀(处理后/处理前)，从而导致sdLDL检测结果偏低；
h〉精密度实验将方法中所制备的sdLDL纯品用生理盐水分别稀 释成高值1.6 mmol/L和低值0. 6咖ol/L，分别测定批内和日间标准差 (s〉、 CV。其中高值批内s、 CV分别为0.01、 2.0%，批间s、 CV分别
9为0.023、 2.7%;低值批内s、 CV分别为0.026、 6.7%，批间s、 CV 分别为0.031、 4.5%;
i)检测范围取sdLDL纯品，用生理盐水作稀释，使sdLDL的含 量分别为原来纯品的1/20、 1/10、 2/10、 4/10、 6/10、 8/10、 10/10， 各稀释液平行测定2次，以预测值为X，实测值为Y，进行线性相关分 析，方程为Y=0.987X + 0. 006， r=0.997。说明本法的sdLDL检测浓度 可报告范围达到2. 2mmol/L;
j)干扰实验主要观察整个样本处理和检测过程中、血红蛋白和
胆红素对sdLDL结果的影响。将HDL-C、 VLDL—C、血红蛋白和胆红素分 别加入只含sdLDL，使其终浓度分别为HDL-C (lmmol/L) 、 VLDL—C (lmmol /L)、血红蛋白(500mg/dl)、胆红素(40mg/dl)，按照上述方法进行样 本处理，检测加入干扰物前后sdLDL浓度(平行处理测定2次)，结果分 别为99. 2%、 99. 7%、 97.1%、 97.6%。结果显示HDL-C、 VLDL—C对该 法测定sdLDL无干扰，血红蛋白《500mg/L、胆红素《40mg/L不影响测定 结果。
k)回收实验在900 u LsdLDL浓度为l. lmmol/L血清中加入100p LsdLDL纯品液系列。sdLDL纯品液浓度高值二 3 mmol/L，中值=1. 2mmol/L, 低值=0. 5mmol/L,测定样本中的sdLDL浓度，结果该方法的平均回收率在 97. 9 %。
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权利要求
1、化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是包括下列步骤1)测试前标本处理取肝素—镁试剂0.2ml加入0.2ml血清置于1.5ml离心管中，混匀，试管密封置37℃孵育10min，立即转放置4℃冰箱15min，12000rpm离心15min，取上清液作为待测标本；所述肝素—镁试剂是含145U/mL肝素、氯化镁79mmol/L、0.1g/L硫酸葡聚糖的试剂；2)检测经过方法处理后待测样本中仅含sdLDL而无其他低密度脂蛋白胆固醇，测定待测样本中LDL-C浓度即得该样本sdLDL浓度；具体测试方法如下采用包括R1、R2试剂的胆固醇试剂盒进行双试剂测定，R1试剂中含有聚阴离子与sdLDL形成复合物而遮蔽sdLDL-C，血清中HDL在表面活性剂作用下与酶试剂产生不完整的Trinder反应，反应中产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色；当加入R2试剂时，含对sdLDL-C有特异作用的表面活性剂能水解sdLDL-C，释放出其胆固醇，参与完整的Trinder反应，测定546nm处的吸光度与sdLDL-C的浓度成正比，测定仪器为全自动生化分析仪。
2、 根据权利要求1所述的化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是测定主要参数为采用二点终点法，定标模式采用二点定标，反应方向为上升，主波长为546nm，副波长为600nm,反应温度为37°C。
3、 根据权利要求1或2所述的化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是采用包括Rb R2试剂的胆固醇试剂盒对待测样本进行双试剂测定时，先将待测样本与R3式剂反应300秒，再与R2试剂反应300秒，待测样本、R3式剂、R2试剂的体积比为1:75:25。
全文摘要
本发明公开了一种化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，包括样本的预处理、血清测定等步骤。本发明准确可靠，可作为一种准确可靠sdLDL检测方法。
文档编号G01N33/92GK101482570SQ20091002898
公开日2009年7月15日 申请日期2009年2月8日 优先权日2009年2月8日
发明者辉 丛, 王惠民, 鞠少卿 申请人:南通大学附属医院