专利名称：：一种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量pcr基因分型方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种荧光定量PCR基因分型方法及其试剂盒，特别是一种^r测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法及其试剂盒。
背景技术：
：原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界范围内高发病率的恶性肿瘤之一，在常见胂瘤中其发病率居第五位；HCC的年死亡数与同年新发病数大致相仿，在肿瘤相关的死亡率中占第三位，仅仅低于肺癌和胃癌。中国也是肝癌高发国家，HCC占我国原发性肝癌的90%，HCC是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人民群众的身体健康，因此也是我国重点研究的课题之一。目前所知，肝癌形成是一个多基因和多步骤的过程，涉及到染色体lp,4q,8p，8q,10q，lip,13q,16p,17p,19p和22q等染色体畸变(chromosomalaberrations)，导致控制细胞生长或抑制的一些基因功能发生改变。葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78,GRP78),又名70千道尔顿热休克蛋白5(heatshock70kDaprotein5，HSPA5),与热休克蛋白70(heatshockprotein70，HSP70)家族具有同源性，被认为是HSP70家族的成员之一。人类的GRP78基因定位于染色体9q33上。GRP78基因含有8个外显子7个内含子。在内质网中发现了GRP78的基因产物，在内质网内，它与免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)重链牢固结合,阻止未成熟重链的自身结合，直至重链和轻链结合。这证明GRP78蛋白是一个内质网驻留蛋白。作为一种应激(stress)相关的重要分子伴侣(chaperone),GRP78涉及到多种肿瘤(包括HCC)的演化。HCC组织中GRP78蛋白的表达升高，常常预示着预后的不良。但目前GRP78基因的多态性与HCC的风险和预后的关系，是目前还没有预测中国人原发性肝细胞癌易感性试剂盒及^f企测方法。
发明内容本发明的主要目的在于提供一种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法。该检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法包括如下步骤(1)针对GRP78基因第5个内含子rs430397位点的多态性，设计PCR反应引物和荧光探针；(2)在反应体系中加入所述步骤(1)中的PCR反应引物、荧光探针和PCR反应液；(3)将所述的步骤(2)得到的混合溶液置于荧光定量PCR仪上反应。通过NCBI数据库和dbSNP数据库获得GRP78基因参考序列及rs430397位点，设计该SNP的扩增引物和荧光探针。GRP78基因部分参考序列如下GTATGTTCCTTGTTTTCTGCTTTGCTAATGAGATCTCCTTAGACTCTGAATTCAGGACATTGCATCTAGATACTTAGATAACAGACATCACAGTAACCAT@TCTTTTTTCTAGGATCTGTTCCGGTCTACTATGAAGCCCGTCCAGAAAGTGTTGGAAGATTCTGATTTGAAGAAGTCTGATATTGA上面方框标出的位点即为多态位点。所述的PCR反应引物的序列如下正向引物5，-CCTTGTTTTCTGCTTTGCTAATGA—3，；反向引物5，一CATAGTAGACCGGAACAGATCCTAGA-3，。所述的荧光探针的序列如下5，—FAM-CATCACAGTAACCATATC-3，和5'-VIC-CATCACAGTAACCATGTC-3，。探针的5，末端标记焚光探针，一个等位基因标记VIC，另一个等位基因标记6-carboxyfluorescein(FAM)。所述的PCR反应引物的终浓度为500nM。所述的荧光探针的终浓度为200nM。所述步骤(3)的反应条件为92°C15秒、60°C1分钟，反应40个循环。本发明的第二个目的在于提供一种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法的试剂盒。该试剂盒包括PCR反应液，还包括正向引物5，—CCTTGTTTTCTGCTTTGCTAATGA-3，；反向引物5，—CATAGTAGACCGGAACAGATCCTAGA-3，；荧光探4十5，-FAM-CATCACAGTAACCATATC-3，和5，-VIC-CATCACAGTAACCATGTC-3，。探针的5，末端标记荧光探针，一个等位基因标记VIC,另一个等位基因标记6-carboxyfluorescein(FAM)。3，末端则标记偶联着小沟槽结合剂(minorgroovebinder,MGB)的非焚光淬灭剂(non-fluorescentquencher,NFQ)。本发明的TaqMan荧光探针基因分型检测方法和试剂盒简单、快速、高通量、高敏感、特异性强，适用于HCC易感人群的大规模筛查，并为基因治疗提供潜在的靶标，有利于指导HCC的预防和治疗。本发明揭示与原发性肝细胞癌密切相关的GRP78多态位点，对基于遗传学背景的个体化治疗奠定了十分重要的基础，并将带来十分可，见的社会和经济效益。具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。本发明的检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法和-险测试剂盒的一个优选实施例具体如下1、DNA的提取血标本来自于中山大学肿瘤医院和眼科医院。使用DNA血标本提取试剂盒(QIAampDNAbloodminikit)提取白细胞基因组DNA。针对rs430397位点，我们检测了428个原发性肝细胞癌患者，及年龄和性别与之匹配的410个正常人的基因型。2、实时荧光定量PCR反应利用本发明的检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型检测试剂盒来进行在一个优选实施例中，该试剂盒含有PCR反应液，PCR引物和荧光探针，PCR反应液为不含UNG的TaqMan基因分型主反应液(TaqManGenotypingMasterMixwithoutUNG(AppliedBiosystems)),PCR引物的序列如下正向引物5，—CCTTGTTTTCTGCTTTGCTAATGA-3，；反向引物5，—CATAGTAGACCGGAACAGATCCTAGA-3，。荧光探针的序列如下5，-CATCACAGTAACCATATC-3'和5'-CATCACAGTAACCATGTC-3，。20plPCR反应体系中包括50ng的基因组DNA和不含UNG的TaqMan基因分型主反应液(TaqManGenotypingMasterMixwithoutUNG(AppliedBiosystems))，含500nM的上述引物和200nM的上述探针。96孔的ABI专用反应4反置于7900HT快速实时PCR仪系统(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)内，以92°C15秒、60。C1分钟，反应40个循环。3、数据统计与分析病例组和对照组之间(或不同的病例组之间)等位基因和基因型的分布差异使用年龄、性别校正后的无条件logistic回归冲莫型，并同时计算优势比(oddsratios,ORs)和95%可信区间(confidenceintervals,CIs)。所有的斥企-睑都是双側检马全，以P=0.05为具有统计学意义。为了保证所选的对照组和病例组都来自于同一汉族人群，先进行了Hardy-Weinberg平衡检验。结果见表l,表l为正常对照组及原发性肝细胞癌组GRP78基因rs430397基因型频率及HWE(Hardy-Weinbergequilibrium)检验结果表，结果表明，所选择的人群符合孟德尔群体遗传学原理。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>;HWE:Hardy-Weinbergequilibrium才全验的P值哈迪-温伯格定律(Hardy-WeinbergLaw)是指在随机交配群体中，设一基因座有两种等位基因A和a的频率分别为p和q,基因型AA、Aa和aa的频率分别为p2,2pq和q2,则该群体为遗传平衡群体，不随世代变化。在世代间，遗传平衡群体的等位基因频率(群体中，一基因座某种等位基因数与该基因座全部等位基因数之比)与基因型频率(群体中，某基因型个体^:与该群体全部个体数之比)的这种恒定关系，是由英国数学家哈迪(D.H.Hardy)和德国医生温伯格(W.Weinberg)于1908年分别独立发现的，称为哈迪-温伯格定律，也称遗传平衡定律(geneticequilibriumlaw)。维持遗传平衡的条件是群体无限大，没有突变、选择、迁移和遗传漂变。哈迪-温伯格定律的意义，在理论上，是群体遗传和数量遗传理论的基石，遗传学这两个分支学科的遗传模型和参数估算，就是根据该定律推导出来的。在实践上，它提示我们在引种、留种、分群和建立近交系时，不要使群体过小，否则，就会导致群体的等位基因频率和基因型频率的改变，从而导致原品种(品系)"种性，，或一些优良经济性状的丧失。OR值的全称是oddratio，OR值是相对危险度，又称比值比、优势比，对于发病率很低的疾病来说，OR值即是相对危险度的精确估计值。当我们已知疾病的发生状况，比较疾病组与非疾病组危险因素暴露的情况差异时(即回顾性研究时)，用OR进行定量描述。OR是否有意义还要看其P值，一般95。/。CI上限小于1时说明可能是保护因素，相反如果下限大于1则说明可能是危险因素。logistic回归中，OR值4，表示该因素对疾病的发生不起作用；OR值大于1,表示该因素是一个危险因素；OR值小于l，表示该因素是一个保护因素。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>校正了年龄和性别的logistic回归分析表2是Rs430397的等位基因和基因型与HCC发病风险的相关性结果表，表2显示，rs430397的等位基因A和基因型AA显著增加HCC的患病风险(OR=1.42，95%CI=1.09-1.84,P=0.009;OR=2.26，95%CI=1.10-3.46,P=0.013)。表明rs430397等位基因A和基因型AA是原发性肝细胞癌的易感标记位点，也说明rs430397是HCC的易感位点。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的才支术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<120>—种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法及其试剂盒<160>5<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>187<212>DNA<213>GRP78<400>1gtatgttccttgttttctgctttgctaatgagatctccttagactctgaattcaggacat60tgcatctagatacttagataacagacatcacagtaaccatgtcttttttctaggatctgt120tccggtctactatgaagcccgtccagaaagtgttggaagattctgatttgaagaagtctg180atattga187<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2ccttgttttctgctttgctaatga24<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>3catagtagaccggaacagatcctaga26<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4catcacagtaaccatatc18<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5catcacagtaaccatgtc18权利要求1、一种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法，其特征在于，包括如下步骤(1)针对GRP78基因第5个内含子rs430397位点的多态性，设计PCR反应引物和荧光探针；(2)在反应体系中加入PCR反应液和所述步骤(1)中的PCR反应引物、荧光探针；(3)将所述的步骤(2)得到的混合溶液置于荧光定量PCR仪上反应。2、根据权利要求书1所述的检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法，其特征在于，所述的PCR反应引物的序列如下正向引物5，—CCTTGTTTTCTGCTTTGCTAATGA-3，；反向引物5，-CATAGTAGACCGGAACAGATCCTAGA-3，。3、根据权利要求书1所述的检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法，其特征在于，所述的荧光探针的序列如下5，-FAM-CATCACAGTAACCATATC-3，和5'-VIC-CATCACAGTAACCATGTC-3，。4、根据权利要求书1所述检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法，其特征在于，所述的PCR反应引物的终浓度为500nM。5、根据权利要求书1所述检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法，其特征在于，所述的荧光探针的终浓度为200nM。6、根据权利要求书1所述检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法，其特征在于，所述步骤(3)的反应条件为92。C15秒、60°C1分钟，反应40个循环。7、一种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，还包括正向引物5，-CCTTGTTTTCTGCTTTGCTAATGA—3，；反向引物5，-CATAGTAGACCGGAACAGATCCTAGA-3，；荧光才果针5，-FAM-CATCACAGTAACCATATC-3，和5'-VIC曙CATCACAGTAACCATGTC-全文摘要本发明公开了一种检测原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法，针对GRP78基因第5个内含子rs430397位点的多态性，设计PCR反应引物和荧光探针；在反应体系中加入PCR反应引物、荧光探针和PCR反应液；置于荧光定量PCR仪上反应。本发明还公开了一种原发性肝细胞癌的易感基因的荧光定量PCR基因分型方法的试剂盒。该试剂盒包括PCR反应液，还包括PCR反应引物和荧光探针。本发明的TaqMan荧光探针基因分型检测方法和试剂盒简单、快速、高通量、高敏感、特异性强，适用于HCC易感人群的大规模筛查，并为基因治疗提供潜在的靶标，有利于指导HCC的预防和治疗。文档编号G01N21/64GK101575641SQ20091003986公开日2009年11月11日申请日期2009年5月31日优先权日2009年5月31日发明者孔祥复,廖奕佶,伟朱,萧朱,武鸿美,王金龙,童铸廷,丹谢,邓海霞申请人:中山大学