专利名称：：血吸虫病快速测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种血吸虫病快速测定试剂盒，无需特殊的仪器和专业的技术人员,就可完成观l]定。本发明还涉及一种血吸虫病快速测定试剂盒的制备方法，避免了传统方法繁琐的操作，方便现场快速检测。
背景技术：
：血吸虫病是世界范围内广泛流行的一种严重危害人、畜健康的寄生虫病，其易感动物包括人、猪、兔、牛、羊等家畜及野生动物，家畜也是人体血吸虫病最主要的传染源，全世界约有6亿人口为血吸虫病高危人群。我国通过综合治理，疫情一度得到控制，但近年来发病率又呈上升趋势，同时在已经消灭血吸虫病的地区仍有长期巩固与监测的任务。目前我国约有6500万人生活在疫区，慢性血吸虫病人估计在100万以上。日本血吸虫感染宿主后，宿主会在2-4周内产生特异性抗体，并且血吸虫病经治愈后，宿主体内的抗体仍然会存在并持续很长时间。检出血吸虫抗体说明患者正被感染或既往感染，检测结果具有重要的病原学诊断意义。根据统计数据显示，大部分流行区的人畜血吸虫病感染率在3%-5%，局部地区人畜血吸虫病感染率可高达68%。血吸虫病传统的检测方法是粪检等病原学检测，需要投入较大的人力、物力和资金。现在主要使用的是免疫学检测，如环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、斑点酶联免疫吸附试验等，但均有一定的缺陷，所需检测时间比较长，一般需要40-240分钟，有的甚至长达72小时，需要仪器设备，不适合在现场广泛推广使用。中国专利200510050188.1提供了一种诊断血吸虫病的试剂盒及检测方法，该方法检测歩骤为检测时需采取血样滴于纸面，凉干后裁取干燥血纸在生理盐水中浸泡一段时间，得到的血样浸出液用玻璃毛细血管吸取后在硝酸纤维素膜上点样，室温下放置一段时间后再往硝酸纤维素膜上滴加血吸虫抗原胶体金，点样处显红色斑点为阳性，否则为阴性。这种方法缺点在于在检测时不仅需要其他的仪器设备，而且操作步骤繁琐，费时费力。在当前血吸虫病防治工作中，迫切需要一种快速、简便、准确、能用于现场检测的工具，以提高现场大规模的筛查速度。
发明内容本发明的目的是提供一种血吸虫快速测定试剂盒，仅需一步操作，省去了血液样本要经过离心步骤才能得到血清样本的步骤，大大提高了筛查的速度。本发明的另一个目的是提供一种血吸虫快速测定试剂盒的制备方法，解决传统检测耗材多、操作繁琐、检测时间长、对工作条件要求高的问题。对于血吸虫快速测定试剂盒，本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是血吸虫病快速测定试剂盒，包括底板，还包括硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水垫，所述吸水垫、硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫水平方向顺序相接并固定在底板上。水平方向连接方式有两种，一种是水平方向首尾连接，一种是水平方向的部分重叠连接。本发明的一个优选方式是如上所述的血吸虫快速测定试剂盒还包括盒体，底板置于盒体内，所述盒体盒面上对应于硝酸纤维素膜的位置设有观察窗，对应于样品垫的位置设有加样孔。所述观察窗为方形孔或透明片。本发明的另一个优选方式是如上所述的血吸虫快速测定试剂盒，吸水垫上方设有产品标签层，胶体金结合垫上方设有箭头标签层。本发明工作原理是将血吸虫虫卵抗原以条带状固定于硝酸纤维素膜上作为检测线，将标记有第二抗体的胶体金粒子吸附在胶体金结合垫上，当待测样品(血液)加到样品垫上后，红细胞在样品垫上发生凝集并固定在样品垫上，血浆样本通过毛细作用向前移动，与胶体金结合垫上的胶体金标记试剂相溶并相互反应，继续向前移动经过硝酸纤维素膜上含有相对应的检测抗原的区域时，如果血液样品含有血吸虫抗体，胶体金标记试剂复合物与抗原发生特异性结合而被截留，聚集在检测线上显色呈阳性；如果样品不含有血吸虫抗体，胶体金蛋白复合物与抗原不发生特异性结合，检测线上不显色呈阴性。对于上述血吸虫病快速测定试剂盒的制备方法，本发明解决所述技术问题采用的技术方案是包括如下步骤1)样品垫的制备将浓度为0.5mg/ml-lmg/ml的植物凝集素或抗人红细胞抗体缓冲溶液处理包被载体，低温冻干，裁切成长条备用；2)胶体金结合垫的制备A.胶体金溶液的制备以纯化水、1%氯金酸溶液和1%柠檬酸钠溶液为原料，其中1%氯金酸溶液与1%柠檬酸钠溶液的体积相等，先将纯化水加热搅拌，再加入1%氯金酸溶液使氯金酸的终浓度为万分之一，待溶液微沸时，快速加入1%柠檬酸钠溶液，继续加热并搅拌，5-10分钟后停止加热，溶液冷却至室温，得到平均直径在40nm-50nm的胶体金溶液，4'C保存备用；7B.胶体金pH的调节上述歩骤得到的胶体金溶液调节PH在6-8;C.胶体金标记上述步骤得到的胶体金溶液中加入待标记蛋白，搅拌10-30分钟后，得到的每100ml溶液中加入10ml10%的牛血清白蛋白，混匀后8000-12000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀经处理得到胶体金蛋白复合物；D.胶体金结合垫的制备上述步骤得到的胶体金蛋白复合物均匀的铺在结合垫上，低温冻干，裁切成长条备用；3)血吸虫虫卵抗原的制备将血吸虫虫卵抗原研磨后，加入0.85%的生理盐水溶液中，置于-2(TC冷冻过夜，白天溶解，如此反复冻融5-10次后置于碎冰块中，用超声波破碎3分钟，反复破碎10次，12000rpm高速离心30分钟，取上清液即为血吸虫虫卵抗原；4)硝酸纤维素膜设置检测线和质控线用包被机将吸入到检测线注射泵中的lmg/ml血吸虫虫卵抗原和吸入到质控线注射泵中lmg/ml的抗人IgG包被到硝酸纤维素膜上分别形成检测线和质控线，于37。C干燥过夜后备用。所述沉淀是这样处理得到胶体金蛋白复合物的沉淀按照100ml:10ml的比例，每100ml胶体金用10ml含有1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙二醇、pH=8.2的PBS溶液悬浮。所述样品垫采用玻璃纤维膜或无纺布作为包被载体，胶体金结合垫采用玻璃纤维膜、无纺布或聚酯膜作为包被载体。所述硝酸纤维素膜采用尼龙膜、羧化纤维素膜或纯纤维素膜替代。本发明血吸虫病快速测定试剂盒的检测方法按照以下步骤操作将待测样本直接加入到试剂盒的加样孔中，再使用滴管滴加2-3滴稀释液于加样孔中，15分钟内观察窗内检测线显色即为阳性，检测线不显色为阴性。本发明的有益效果是(1)本发明将吸水垫、硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫顺序铺在底板上，体积小，制作方便；再置于盒体内，体积小、便于携带；(2)盒体上设有供样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗，根据是否显色判断检测结果，准确可靠，没有人为操作误差；(3)能大大血吸虫病縮短检测时间，具有快速、简单、现场、不需要昂贵仪器、不需要对人员进行专业培训等优点；(4)本发明将胶体金粒子标记在捕获抗体上，没有有害物质及放射性物质的参与，安全可靠，适用于血吸虫病的诊断；(5)不仅适用于检测人体血液样本中是否存在血吸虫抗体，还能检测牛、马、猪、兔等动物的血液样本是否存在血吸虫抗体，克服了其他试剂盒检测不同种属还需要制备不同的试剂盒的缺点；(6)可批量生产，可单人单份、也可多人单份，适用于临床快速诊断和现场大数量的快速检测；易于保存，有利于基层单位推广。图l是实施例l截面图；图2是实施例2截面图；图3是实施例3截面图；图4是实施例4剖视图。图中标记相对应的部件名称l-底板；2-硝酸纤维素膜；3-胶体金结合垫；4-样品垫；5-吸水垫；6-产品标签层；7-箭头标签层；8-观察窗；9-加样孔；10-盒体。9具体实施例方式实施例1如图1所示，血吸虫病快速测定试剂盒，包括底板l，还包括硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3、样品垫4和吸水垫5，所述吸水垫5、硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3和样品垫4水平方向顺序相接并固定在底板1上，具体的，其连接方式是水平方向首尾连接的。吸水垫5上方设有产品标签层6，胶体金结合垫3上方设有箭头标签层7。实施例2如图2所示，血吸虫病快速测定试剂盒，包括底板l、硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3、样品垫4和吸水垫5，吸水垫5、硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3和样品垫4水平方向顺序相接并固定在底板1上，具体的，其连接方式是水平方向首尾连接的。还包括盒体IO，底板1置于盒体10内，所述盒体10盒面上对应于硝酸纤维素膜2的位置设有观察窗8，对应于样品垫4的位置设有加样孔9。实施例3如图3所示，所述吸水垫5、硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3和样品垫4水平方向顺序相接并固定在底板l上，具体的，其连接方式是部分重叠连接的。其余与实施例l相同。实施例4如图4所示，所述吸水垫5、硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3和样品垫4水平方向顺序相接并固定在底板l上，具体的，其连接方式是部分重叠连接的。其余与实施例2相同。实施例5血吸虫病快速测定试剂盒的制备方法如下(1)样品垫的制备以含有浓度为0.5mg/ml-lmg/ml的抗人红细胞抗体或植物凝集素缓冲溶液均匀处理玻璃纤维膜或纺布包被载体，包被方式可以采取用移液器将包被溶液均匀的铺到样品垫中，也可以采取将样品垫置于包被溶液中浸泡均匀。处理好的包被材料采用冷冻干燥、真空干燥或加热干燥的方式处理，再按照规格裁切成适当大小的长条后备用。(2)制备胶体金溶液胶体金结合垫的材料采用玻璃纤维膜、无纺布或聚酯膜作为包被载体。采用柠檬酸三钠还原法制备纳米胶体金溶液。洁净的圆底烧瓶中加入1L纯化水，加热并搅拌，取1%的氯金酸溶液10ml于圆底烧瓶中，待溶液沸腾时，快速加入1%的柠檬酸三钠溶液10ml,继续搅拌溶液并反应5-10分钟，溶液中的氯金酸逐渐被还原成金颗粒，溶液由无色到黑色，最后变成酒红色。停止加热将溶液冷却至室温后2-8。C保存备用。(3)胶体金标记最佳pH和最佳标记蛋白量在胶体金标记蛋白质之前，先要做好最佳标记PH和标记蛋白量的确定，达到用最小的蛋白用量与胶体金达到最佳的结合比例，既可以节省蛋白的用量，又可以降低标记后产生过多的游离标记蛋白，简化通过离心去除游离蛋白的纯化工作量。本试验方法采用目测法，取一系列离心管，每管中各加入lml胶体金溶液，具体按照下表操作表1胶体金一SPA最佳标记pH的确定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2胶体金一SPA最佳标记蛋白量的确定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从胶体金的溶液颜色变化可见，能保持胶体-SPA稳定的PH即为最佳pH，胶体金标记SPA的最佳PH为6.0，胶体金标记SPA最佳标记蛋白量为能够稳定胶体金的最小标记蛋白量的基础上再加10%-20%，可见，胶体金标记SPA的最佳标记蛋白量为10ug。胶体金标记鼠抗人IgG最佳PH和蛋白量的确定取一系列离心管，每管中各加入lml胶体金溶液，具体按照下表操作:表l胶体金一鼠抗人IgG最佳标记pH的确定试管兮123456胶体金1ml1ml1ml1ml1ml1ml标记PH5.56.06.57.07.58.0蛋白量30吗30吗30昭30吗30吗30|iig10%氯化钠0.1ml0,1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml溶液颜色变化红一紫红_紫红一紫红一紫红一红红一红表2胶体金一鼠抗人IgG最佳标记蛋白量的确定试管号123456胶体金1ml1ml1ml1ml1ml1ml标记PH7.57.57.57.57.57.5蛋白量2吗4吗G叫8吗10pg12吗10%氯化钠0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml溶液颜色变化红一紫红一紫红一紫红一红红一红红一红从胶体金的溶液颜色变化可见，能保持胶体一鼠抗人IgG稳定的pH即为最佳pH，胶体金标记鼠抗人IgG的最佳pH为7.5，体金标记鼠抗人IgG最佳标记蛋白量为能够稳定胶体金的最小标记蛋白量的基础上再加10%-20%，可见，胶体金标记SPA的最佳标记蛋白量为10ug。胶体金溶液屮加入最佳标记蛋白量的捕获抗体，如羊抗人IgG、鼠抗人IgG、SPA、SPG蛋白，搅拌10-30分钟后，按照每100ml溶液10ml的比例加入10%的牛血清白蛋白或按照每100ml溶液10ml的比例加入1%的聚乙二醇，混匀后8000-12000转/分离心30分钟，弃上清，红色沉淀按照每100ml胶体金10ml的比例，用含有1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙二醇、pH=8.2的PBS溶液悬浮。(4)胶体金结合垫的制备上述步骤得到的胶体金蛋白复合物均匀的铺在结合垫上。将包被好的胶体金结合垫采用冷冻干燥、真空干燥或加热干燥的方式处理，再按照规格裁切成适当大小的长条备用。(5)硝酸纤维素膜的包被将血吸虫虫卵抗原研磨后，用0.85%的生理盐水溶液，置于-20。C冷冻过夜，白天溶解，如此反复冻融5-10次，将溶液置于碎冰块中，用超声波破碎3分钟，反复破碎10次。12000转/分高速离心30分钟，取上清液即为血吸虫虫卵抗原。将lmg/ml的血吸虫虫卵抗原吸入到检测线注射泵中，lmg/ml的抗人IgG吸入到质控线注射泵中，用包被机按照0.5-lpl/cm的包被速度，将血吸虫虫卵抗原和抗人IgG包被到硝酸纤维素膜适当的位置，于37'C过夜干燥后备用。所述硝酸纤维素膜可由尼龙膜或羧化纤维素膜或纯纤维素膜作为替代材料。6)血吸虫病快速测定试剂盒的制备将吸水垫5及按照上述步骤制备好的硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3和样品垫4水平方向顺序相接并粘贴到底板1上，在胶体金结合垫3上粘贴箭头标签层7，在吸水垫5上方粘贴产品标签层6，切条宽度为3mm，得到半成品，将一人份半成品和一人份千燥剂装入铝塑袋中，再将铝塑袋开口端热封即可。实施例6将吸水垫5和实施例3得到的硝酸纤维素膜2、胶体金结合垫3和样品垫4水平方向顺序相接并粘贴到底板1上，切条宽度为4mm，得到半成品。将一人14份半成品转入盒体10中，盒体10表面与硝酸纤维素膜2对应的位置设有观察孔8，与样品垫4对应的位置设有加样孔9，再与一人份干燥剂、一人份滴管装入铝塑袋中，再将铝塑袋开口端热封即可。检测操作程序取患者的全血样本于洁净的试管中，采用微量移液器或定量毛细血管吸取lpl全血样本、血清或血浆样本，将待测样本直接加入到加样孔中，再使用滴管滴加2-3滴稀释液于试剂盒的加样孔中。10-15分钟后观察检测线是否显色，检测线显色即为阳性，检测线不显色为阴性。权利要求1、血吸虫病快速测定试剂盒，包括底板(1)，其特征在于，还包括硝酸纤维素膜(2)、胶体金结合垫(3)、样品垫(4)和吸水垫(5)，所述吸水垫(5)、硝酸纤维素膜(2)、胶体金结合垫(3)和样品垫(4)水平方向顺序相接并固定在底板(1)上。2、根据权利要求1所述的血吸虫病快速测定试剂盒，其特征在于，还包括盒体(10)，底板(1)置于盒体(10)内，所述盒体(10)盒面上对应于硝酸纤维素膜(2)的位置设有观察窗(8)，对应于样品垫(4)的位置设有加样孔(9)。3、根据权利要求2所述的血吸虫病快速测定试剂盒，其特征在于，所述观察窗(8)为方形孔或透明片。4、根据权利要求1所述的血吸虫病快速测定试剂盒，其特征在于，所述吸水垫(5)上方设有与之直接接触的产品标签层(6)，胶体金结合垫(3)上方设有与之直接接触的箭头标签层(7)。5、一种如权利要求1所述的血吸虫病快速测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)样品垫的制备-将浓度为0.5mg/ml-lmg/ml的植物凝集素或抗人红细胞抗体缓冲溶液处理包被载体，低温冻干，裁切成长条备用；2)胶体金结合垫的制备A.胶体金溶液的制备以纯化水、1%氯金酸溶液和1%柠檬酸钠溶液为原料，其中1%氯金酸溶液与1%柠檬酸钠溶液的体积相等，先将纯化水加热搅拌，再加入1%氯金酸溶液使氯金酸的终浓度为万分之一，待溶液微沸时，快速加入1%柠檬酸钠溶液，继续加热并搅拌，5-10分钟后停止加热，溶液冷却至室温，得到平均直径在40nm-50nm的胶体金溶液，4"C保存备用；B.胶体金pH的调节上述步骤得到的胶体金溶液调节pH在6-8;C.胶体金标记上述步骤得到的胶体金溶液中加入待标记蛋白，搅拌10-30分钟后，得到的每100ml溶液中加入10ml10%的牛血清白蛋白，混匀后8000-12000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀经处理得到胶体金蛋白复合物；D.胶体金结合垫的制备上述步骤得到的胶体金蛋白复合物均匀的铺在结合垫上，低温冻干，裁切成长条备用；3)血吸虫虫卵抗原的制备将血吸虫虫卵抗原研磨后，加入0.85%的生理盐水溶液中，置于-2(TC冷冻过夜，白天溶解，如此反复冻融5-10次后置于碎冰块中，用超声波破碎3分钟，反复破碎10次，12000rpm高速离心30分钟，取上清液即为血吸虫虫卵抗原；4)硝酸纤维素膜设置检测线和质控线用包被机将吸入到检测线注射泵中的lmg/ml血吸虫虫卵抗原和吸入到质控线注射泵中lmg/ml的抗人IgG包被到硝酸纤维素膜上分别形成检测线和质控线，于37'C干燥过夜后备用。6、根据权利要求5所述的血吸虫病快速测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述沉淀是这样处理得到胶体金蛋白复合物的沉淀按照100ml:10ml的比例，每100ml胶体金用10ml含有1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙二醇、pH=8.2的PBS溶液悬浮。7、根据权利要求6所述的血吸虫病快速测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述样品垫采用玻璃纤维膜或无纺布作为包被载体，胶体金结合垫采用玻璃纤维膜、无纺布或聚酯膜作为包被载体。8、根据权利要求6所述的血吸虫病快速测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述硝酸纤维素膜采用尼龙膜、羧化纤维素膜或纯纤维素膜替代。全文摘要本发明公开了一种血吸虫病快速测定试剂盒及其制备方法。本发明将吸水垫、硝酸纤维素膜、胶体金结合垫和样品垫水平方向顺序相接并固定在底板上。底板置于盒体内，所述盒体对应于硝酸纤维素膜的位置设有观察窗，对应于样品垫的位置设有加样孔。使用本发明仅需一步操作，不仅可以检测血清、血浆样本，还可以检测全血样本，省去了血液样本要经过离心步骤才能得到血清样本的步骤，大大提高了筛查的速度，还能检测牛、马、猪、兔等动物是否有血吸虫病，克服了其他试剂盒检测不同种属还需要制备不同的试剂盒的缺点。文档编号G01N33/558GK101620226SQ200910060300公开日2010年1月6日申请日期2009年8月7日优先权日2009年8月7日发明者刘东泽,刘廷勇,包德全,唐涪嘉,王保宁申请人:四川省迈克科技有限责任公司