一种检测中成药中非法添加的对乙酰氨基酚的方法

专利名称：：一种检测中成药中非法添加的对乙酰氨基酚的方法
技术领域：
：本发明涉及药物分析检测
技术领域：
，特别涉及检测组合物中对乙酰氨基酚的方法。
背景技术：
：药品是人类用于预防、治疗、诊断疾病的特殊商品，关系到广大消费者的用药安全、健康，因此需要对其实施有效监管。中成药应是以中草药为原料，经制剂加工制成各种不同剂型的中药制品，包括丸、散、膏、丹各种剂型。但目前打着纯中药、无毒副作用的旗号暗地里添加化学原料药或成品西药造假的行为层出不穷，由于掺入的化学原料种类、数量、毒性不为人所知，服用人的安全无法保障，对个人、对社会已经造成了严重的危害。在中成药中非法添加对乙酰氨基酚可能致患者发生粒细胞缺乏症、高铁血红蛋白血症、过敏性皮炎(皮疹、皮肤瘙痒等)、肝炎、血小板减少等，因此，需要建立高效的方法检测部分中成药中非法添加的对乙酰氨基酚，及时发现药品质量问题，尽快消除药品安全隐患。文献报道的对乙酰氨基酚测定方法有容量分析法、紫外分光光度法和高效液相色谱法。由于难以将对乙酰氨基酚从中成药中提取出来，容量分析法及紫外分光光度法均不适用于中药复杂体系中对乙酰氨基酚的测定。
发明内容本发明的目的是提供一种检测组合物中非法添加的对乙酰氨基酚含量的方法。本发明所提供的检测组合物中对乙酰氨基酚的方法，包括如下步骤用高效液相色谱-质谱联用法通过监测以下离子来进行组合物中的对乙酰氨基酚的鉴别与结构确证母离子152.1、子离子110.1和子离子93.1，用高效液相色谱法进行对乙酰氨基酚的含量测定。所述高效液相色谱-质谱联用法中，采用的流动相的水相可为10-50mmol/L乙酸铵水溶液，有机相具体可为甲醇；所述水相优选为10mmol/L乙酸铵水溶液。所述高效液相色谱-质谱联用法中最好用所述流动相进行梯度洗脱，所述流动相的起始点为95%体积水相5%体积有机相，中间经过的点包括20%体积水相80%体积有机相，终点为95%体积水相5%体积有机相。3所述高效液相色谱-质谱联用法中，离子源电喷雾源；扫描模式多级反应监测；极性阳离子；以及碰撞能1020V。所述高效液相色谱法中的流动相的水相可为0.10.5%(质量百分含量)磷酸水溶液，有机相为甲醇；所述水相优选为0.1%磷酸水溶液。所述高效液相色谱法中用所述流动相进行梯度洗脱，所述流动相的起始点和终点中水相与有机相的体积比为(89%92%):(11%8%)。所述高效液相色谱法中包括如下步骤用50%-70%(体积百分含量)甲醇溶液对所述组合物进行提取，得到提取液，将所述提取液进行所述高效液相色谱检测。所述组合物可为中成药组合物，具体可为治感冒类中成药组合物或抗风湿类中成药组合物。本发明方法中高效液相色谱-质谱联用法通过3种离子峰的检测使对乙酰氨基酚的结构得到确证，检验结论准确无误；本发明方法对各种实验条件迸行了摸索优化，方法专属性强，灵敏度高、准确度高，稳定性好，实用性强。由于中药非法添加化学药物的违法现象还将持续，而分析检测技术的发展总体上未能超越掺假制假的发展速度。对治感冒中成药中化学药物非法添加的研究工作，是针对目前药品安全监管新情况新问题的检测方法的首创。因此，本发明方法在中成药等组合物的非法添加对乙酰氨基酚检测中将有广阔的应用前景。图1为对乙酰氨基酚的产物离子图。图2为多级反应监测模式下总离子流图。图3为多级反应监测模式下提取质谱图。图4为对乙酰氨基酚裂解过程图。图5为高效液相色谱图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、实验方法的选择及效果检测对照品(对乙酰氨基酚)购自中国药品生物制品检定所。一、实验方法的选择(一)对乙酰氨基酚高效液相色谱-质谱联用结构确证色谱条件用十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂；以10-50mmol/L乙酸铵水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱。质谱条件三重四极杆型质谱仪；离子源电喷雾源；扫描模式多级反应监测；极性阳离子；电子倍增器电压增益800V;干燥气温度350°C;干燥气流速91/min;雾化器压力40Psi;毛细管电压4000V;母离子152.1;子离子110,1;子离子93.1;碰撞能1020V;离子传输电压IOOV。对照品溶液的制备将对乙酰氨基酚对照品溶于甲醇，制成每lml含10Pg的溶液；取上述溶液5ml，置100ml容量瓶中，加1050mmol/L乙酸铵水溶液稀释至100ml，得到对照品溶液。供试品溶液的配制取供试品粉末O.lg，加入甲醇25ml，超声15分钟，过滤，取滤液5ml，置10ml容量瓶中，加1050mmol/L乙酸铵水溶液，稀释至10ml。测定法分别精密吸取对照品溶液3W与供试品溶液5W，注入高效液相色谱-质谱联用仪。(二)高效液相色谱含量测定法实验条件的选择1、检测波长的选择对乙酰氨基酚对照品(浓度约O.lrag/ml)，在190370nm波长范围内进行扫描，在243nm处有最大吸收，故确定检测波长为243nm。2、流动相的选择用不同比例的流动相分离样品，当流动相的比例为磷酸水溶液(8992%)-甲醇(118%)的混合溶液时分离较好(即水相与有机相的体积比为(8992%):(118%))，阴性对照样品在对乙酰氨基酚相应出峰时间处无干扰；但供试品中成分复杂，待对乙酰氨基酚峰出完后再用梯度洗脱洗脱出其它组分。3、提取溶剂的选择取同一批号的样品，加入不同浓度的乙醇、甲醇各25ml，超声处理15分钟，测定，结果表明50%70%甲醇水溶液提取效果好，50%甲醇水溶液最佳。4、色谱条件与系统适用性试验用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.10.5%磷酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长243nm。二、实验效果的检测(一)具体的实验方法1.高效液相色谱-质谱联用法高效液相色谱条件Z0RBAXSB-C18(2.1X50mm，3.5Wn)色谱柱，填充介质为十八烷基硅烷键合硅胶；柱温30。C，以1O隱ol/L乙酸铵水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速0.3ml/min。表l、梯度洗脱步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>质谱条件离子源电喷雾源；扫描模式多级反应监测；极性阳离子；电子倍增器电压增益800V;干燥气温度350°C;干燥气流速91/min;雾化器压力40Psi;毛细管电压4000V;母离子152.1;子离子110.1;子离子93.1;离子传输电压100V;碰撞能15V。停留时间150ms;扫描时间Omin-泵停止时间。对照品溶液的制备称取对乙酰氨基酚对照品，加甲醇制成每lml含lOPg的溶液，量取上述溶液5ml，置100ml容量瓶中，加1Ommol/L乙酸铵水溶液稀释至100ml。供试品溶液的配制取供试品粉末O.lg，加入甲醇25ml，超声15分钟，过滤，取滤液5ml，置10ml容量瓶中，力卩10mmol/L乙酸铵水溶液，稀释至10ml。照上述方法试验，主要产物离子为110.1、93.1;碰撞能15V时对乙酰氨基酚的产物离子图最佳，见图l，推导对乙酰氨基酚产物离子110.1占优势。据此确定多级反应监测的3个识别点为母离子152.1;产物离子110.1、93.1。2、对乙酰氨基酚含量测定对照品溶液的制备将对乙酰氨基酚对照品溶于50%甲醇溶液，制成每lral含10Pg的溶液，得到对照品溶液。供试品溶液的制备取供试品粉末0.5g，加入5(^甲醇水溶液25ml，超声处理15分钟，过滤，取滤液，得到供试品溶液。测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液10W，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算对乙酰氨基酚的含量。色谱条件色谱柱为SUPELCODiscoveryC18(25cmX4.6mm,5Hm)色谱柱，填充介质为十八垸基硅垸键合硅胶；柱温35°C;梯度洗脱缓冲液为流动相C和流动相D的混合溶液流动相C为0.1%磷酸水溶流动相D为甲醇；流速为lml/min;梯度洗脱步骤如表2所示。检测器为DAD检测器，检测波长为243nm;表2、高效液相色谱定量检测的梯度洗脱步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(二)实验效果的检测1.液质联用结构确证法1.l专属性试验分别取阳性供试品、阴性供试品和对乙酰氨基酚对照品照上述方法测定，比较其总离子流图。总离子流图如图2所示(A表示对照品对乙酰氨基酚，B表示阳性样品天津XX药业有限公司样品，C表示阴性样品哈药XX制药厂样品)，结果阳性供试品总离子流图中在与对乙酰氨基酚对照品总离子流图主峰相同时间处有一峰，提取其质谱图，结果如图3所示(A表示对照品，B表示阳性样品天津XX药业样品)，阳性供试品与对照品相一致。阴性样品在与对乙酰氨基酚对照品总离子流图主峰相同时间处无峰，阴性样品提取质谱图亦未有对乙酰氨基酚母离子与子离子。对乙酰氨基酚裂解过程如图4所示。2.高效液相色谱含量测定法2.1专属性试验分别取阳性供试品、阴性供试品和对乙酰氨基酚对照品照上述方法测定，比较其色谱图。结果阳性供试品色谱图中在与对乙酰氨基酚对照品色谱图主峰相同时间处有一峰，对其进行了峰纯度分析，峰纯度为100.0%，阳性供试品色谱图中其它组分色谱峰与乙酰氨基酚峰能达到基线分离。而在阴性供试品中与在对乙酰氨基酚对照品溶液色谱峰相同时间处无色谱峰(见附图5，A表示对照品，B表示阳性样品，C表示阴性样品)。2.2线性关系的考察称取以对乙酰氨基酚对照品，加流动相制成每lml含对乙酰氨基酚1.044mg的溶液，作为对照品溶液母液，将母液分别用50%甲醇稀释如下lml—lOrnl、2ml—25ml、lml—25ml、lml—50ml、lml—lOOral作为对照品溶液15;取对照品溶液5，分别用50%甲醇稀释如下5ml—10ml、2ml—10ml、lml—10ml作为对照品溶液68，精密吸取上述对照品溶液18各10"1，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，依次为4148.98926，3295.86523,1658.55945，832.39801，414.66922，208.18076，414.66922，208.18076，83.11439，41.40110;以峰面积积分值为纵坐标，对乙酰氨基酚进样浓度(yg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为对乙酰氨基酚Y=39.6337X+0.8179相关系数r=0.99999结果表明对乙酰氨基酚进样浓度在1.044104.g/ml范围内呈良好的线性关系。2.3精密度试验(重复性试验)取同一批次的6个样品(山东XX药业有限公司0712051批)，提取方法等同，以lOug/ml的对乙酰氨基酚做为对照品溶液，按前述高效液相色谱条件重复测定样品6次，外标法计算样品中含对乙酰氨基酚的量，测定结果为0.23744，0.24102，0.24055，0.23946，0.23687，0.24016mg/g;平均含量0.23925mg/g;RSD=0.72%(n=6)，结果表明此法重复性良好。2.4准确度试验(加样回收率试验)称取已知含量为0.23925mg/g的山东XX药业有限公司0712051批样品0.6g，分别加入对乙酰氨基酚对照品149.75^，按样品溶液的制备方法操作，测定其含量，并计算回收率，取批内6个样品进行实验，每个样品做2个平行，结果取平均数。结果如表3所示。测得回收率为100.877%、99.286%、99.132%、102.487%、100.321%、99.295%，平均值100.23%,RSD为1.3%(n=6)。表3、样品加样回收率试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.5样品溶液稳定性试验取室温下保存的山东XX药业有限公司0712051批供试品溶液，在2日内随机进样测定峰面积，峰面积积分值依次为442.33331，440.70630，441.53287,440.91956，442,73236，438.16318，438.96237，437.82404;平均值440.39675，RSD(%)=0.43%。测定结果表明，样品溶液在2日内基本稳定。2.6检测限的确定取线性关系考察下对照溶液8，用50%甲醇溶液稀释至不同浓度，各进样IOW，结果进样浓度为25.06ng/ml时，信噪比为3:1，因此，可近似认为，应用本方法，对乙酰氨基酚的最低检出浓度为25ng/ml。2.7定量限的确定取线性关系考察下对照溶液8，用50%甲醇溶液稀释至不同浓度，各进样IOW，结果进样浓度为83.52ng/ml时，信噪比为10:1，因此，可近似认为，应用本方法，对乙酰氨基酚的最低定量浓度为84ng/ml。实施例2、检测不同种中成药中的对乙酰氨基酚一、山东XX药业有限公司感冒XX颗粒中对乙酰氨基酚的检测(一)高效液相色谱-质谱联用进行定性测定1、供试品溶液的制备取样品袋内容物，称重，研细，取粉末O.lg，加入甲醇25ml，超声15分钟，过滤，取滤液5ml，置10ml容量瓶中，加1Ommol/L乙酸铵水溶液，稀释至10ml。2、对照品溶液制备将对乙酰氨基酚对照品溶于甲醇，制成每lml含10Pg的溶液；取上述溶液5ml，置100ml容量瓶中，加10mmol/L乙酸铰水溶液稀释至100ml，得到对照品溶液。3、测定条件(1)高效液相色谱色谱柱为ZORBAXSB-C18(2.1X50腿，3.5Mm)，填充介质为十八垸基硅烷键合硅胶；柱温3(TC;梯度洗脱液为流动相A为10mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇；流速为0.3ml/min;梯度洗脱步骤如表4所示;表4、梯度洗脱程序<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)质谱质谱条件三重四极杆型质谱仪；离子源电喷雾源；扫描模式多级反应监测；极性阳离子；电子倍增器电压增益800V;干燥气温度350°C;干燥气流速91/min;雾化器压力40Psi;毛细管电压4000V;母离子152.1;子离子110.1;子离子93.1;碰撞能15V;离子传输电压100V;停留时间150ms;扫描时间0-22min。4、方法分别取对照品溶液与供试品溶液5W，注入高效液相色谱-质谱联用仪。取10个不同批次的样品，每个批次做2个平行，结果取平均数。供试品总离子流图在与对照品总离子流图相应出峰时间处，有一色谱峰，提取该色谱峰质谱图，检出152.1—110.1、152.1—93.1，即3个识别点为母离子152.1;产物离子110.1、93.1。(二)高效液相色谱定量测定1、供试品溶液的制备取实验(一)中的样品粉末0.5g，加入50。/。甲醇水溶液25ml，超声处理15分钟，过滤，取滤液，得到供试品溶液。2、对照品溶液的制备将对乙酰氨基酚对照品溶于50%甲醇溶液，制成每lml含10Pg的溶液，得到对照品溶液。3、色谱条件色谱柱为SUPELC0DiscoveryC18(25cmX4.6mm，5Mm)色谱柱，填充介质为十八烷基硅烷键合硅胶；柱温35'C;梯度洗脱液为流动相C和流动相D的混合溶液流动相C为0.1%磷酸水溶液，流动相D为甲醇；流速为lml/min;梯度洗脱步骤如表5所示。检测器为DAD检测器，检测波长为243nm;表5、高效液相色谱定量检测的梯度洗脱步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4、方法分别取对照品溶液与供试品溶液10W，注入液相色谱仪，测定，以外标法以峰面积计算对乙酰氨基酚的含量。取10个不同批次的样品，每个批次做2个平行，结果取平均数。照上述方法检测，根据对乙酰氨基酚的含量调整含量测定取样量。5、加样回收率试验称取含量测定取样量的1/2，分别加入根据含量测定结果计算得量的对乙酰氨基酚，按照步骤1中所述方法进行供试品溶液制备，在步骤中1所述条件下检测供试品溶液中对乙酰氨基酚的含量，并计算回收率。实验结果如表6所示。表6、山东XX药业有限公司感冒XX颗粒11批次的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>080202812.149550.19699.3%080202312.214150.11898.8%二、四川xX药业有限公司感冒Xx颗粒中对乙酰氨基酚的检测(一)高效液相色谱-质谱联用进行定性测定实验方法与一中所述方法相同，不同之处在于高效液相-质谱联用流动相水相采用20mmol/L乙酸铵水溶液，有机相采用甲醇，以水相为流动相A，有机相为流动相B，梯度洗脱步骤如表7所示；质谱条件碰撞能采用IOV。表7、梯度洗脱步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(二)高效液相色谱定量测定实验方法与一中所述方法相同，不同之处在于供试品溶液的制备中使用70%甲醇水溶液作为提取剂，流动相C为0.3。/。磷酸水溶液；梯度洗脱步骤如表8所示。表8、梯度洗脱步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>取080101批样品，重复2次，结果取平均数。结果表明，该厂家生产的080101批感冒XX颗粒中产品中检出对乙酰氨基酚，平均装量为12.0494g/袋，含量测定取样量为5g，含量为0.403mg/袋。三、天津XX药业有限公司感冒XX颗粒(无糖型)中对乙酰氨基酚的检测(一)高效液相色谱-质谱联用进行定性测定实验方法与一中所述方法相同，不同之处在于高效液相-质谱联用流动相水相采用30mmol/L乙酸铵水溶液，有机相采用甲醇，以水相为流动相A，有机相为流动相B，梯度洗脱步骤如表9所示；质谱条件碰撞能釆用16V。表9、梯度洗脱步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(二)高效液相色谱定量测定实验方法与一中所述方法相同，不同之处在于供试品溶液的制备中使用60%甲醇水溶液作为提取剂，流动相C为0.2%磷酸水溶液；梯度洗脱步骤如表10所示。表io、梯度洗脱步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>取0709051批样品，重复2次，结果取平均数。结果表明，该厂家生产的0709051批感冒XX颗粒(无糖型)产品中检出对乙酰氨基酚，平均装量为2.9601g/袋，含量测定取样量为约3g，含量为0.331mg/袋，加样回收率为99.2%。四、河北XXX药业有限公司感冒XX颗粒中对乙酰氨基酚的检测(一)高效液相色谱-质谱联用进行定性测定实验方法与一中所述方法相同，不同之处在于高效液相-质谱联用流动相水相采用25mmol/L乙酸铵水溶液，有机相采用甲醇，以水相为流动相A，有机相为流动相B，梯度洗脱步骤如表ll所示；质谱条件碰撞能采用20V。_表ll、梯度洗脱步骤_时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(二)高效液相色谱定量测定实验方法与一中所述方法相同，不同之处在于供试品溶液的制备中使用65%甲醇水溶液作为提取剂，流动相C为0.5%磷酸水溶液；梯度洗脱步骤如表12所示。表12、梯度洗脱步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>取4个批次的样品，每批次取2个样品，结果取平均数。结果表明，该厂家2007至2008年生产的四批产品中检出对乙酰氨基酚，测定结果见表13。表13、河北XXX药业有限公司感冒XX颗粒中对乙酰氨基酚的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>五、江西xxx药业有限公司感冒xx颗粒中对乙酰氨基酚的检测(一)高效液相色谱-质谱联用进行定性测定实验方法与一中所述方法相同，不同之处在于高效液相-质谱联用流动相水相采用15mmol/L乙酸铵水溶液，有机相采用甲醇，以水相为流动相A，有机相为流动相B，梯度洗脱步骤如表14所示；质谱条件碰撞能采用14V。_表14、梯度洗脱步骤_l"寸间(分钟)流动相A(%)流动相B(y。)095510208015208017955(二)高效液相色谱定量测定实验方法与一中所述方法相同，不同之处在于供试品溶液的制备中使用55%甲醇水溶液作为提取剂，流动相C为0.4y。磷酸水溶液；梯度洗脱步骤如表15所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>取20080202批样品，重复2次，结果取平均数。该厂家生产的20080202批产品中检出对乙酰氨基酚，平均装量为12.1033g/袋，含量测定取样量为约5g，含量为O.皿mg/袋，加样回收率为99.87%。权利要求1、一种检测组合物中对乙酰氨基酚的方法，包括如下步骤用高效液相色谱-质谱联用法通过监测以下离子来进行组合物中的对乙酰氨基酚的鉴别与结构确证母离子152.1、子离子110.1和子离子93.1，用高效液相色谱法进行对乙酰氨基酚的含量测定。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱-质谱联用法中，采用的流动相的水相为10-50mmol/L乙酸铵水溶液，有机相为甲醇；所述水相优选为10mmol/L乙酸铵水溶液。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱-质谱联用法中用所述流动相进行梯度洗脱，所述流动相的起始点为95%体积水相5%体积有机相，中间经过的点包括20%体积水相80%体积有机相，终点为95%体积水相5%体积有机相。4、根据权利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱-质谱联用法中，离子源电喷雾源；扫描模式多级反应监测；极性阳离子；以及碰撞能1020V。5、根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱法中的流动相的水相为O.10.5%(质量百分含量)磷酸水溶液，有机相为甲醇；所述水相优选为0.1%磷酸水溶液。6、根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱法中用所述流动相进行梯度洗脱，所述流动相的起始点和终点中水相与有机相的体积比为(89%92%):(11%8%)。7、根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱法中包括如下步骤用50%-70%(体积百分含量)甲醇溶液对所述组合物进行提取，得到提取液，将所述提取液进行所述高效液相色谱检测。8、根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述组合物为中成药组合物。9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述中成药组合物为治感冒类中成药组合物或抗风湿类中成药组合物。.全文摘要本发明公开了一种检测组合物中非法添加的对乙酰氨基酚的方法。该方法包括如下步骤用高效液相色谱-质谱联用法通过监测以下离子来进行对乙酰氨基酚的结构确证母离子152.1、子离子110.1和子离子93.1，用高效液相色谱法进行对乙酰氨基酚的含量测定。本发明方法中高效液相色谱-质谱联用法通过3种离子的检测使检出的对乙酰氨基酚结构得到确证，检验结论准确无误；本发明方法对各种实验条件进行了摸索优化，方法专属性强，灵敏度、准确度高，稳定性好，实用性强。因此，本发明方法在中成药中非法添加对酰氨基酚检测中将有广阔的应用前景。文档编号G01N30/36GK101566608SQ200910083948公开日2009年10月28日申请日期2009年5月11日优先权日2009年5月11日发明者刘成红,艳吴,闯徐,武向锋,王亚南,罗晓茹,魏立平申请人:中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所