以酿酒酵母作为生物识别元件快速测定bod的方法

专利名称：：以酿酒酵母作为生物识别元件快速测定bod的方法
技术领域：
：本发明属于环境污染监测领域，涉及到水体有机污染的快速监测，具体是利用固定化酿酒酵母carew/ae)作为BOD快速测定仪的生物识别元件，拓宽对废水中有机污染物的测量范围，提高测定结果的稳定性和重现性，并延长生物识别元件的使用寿命的一种以酿酒酵母作为生物识别元件快速测定BOD的方法。
背景技术：
：水中的有机污染物种类繁多，难以分别测定各种组分的定量数值，因此在水质评价过程中，生化需氧量(biochemicaloxygendemand,BOD)是一个重要的参数，它是指一定体积水体中的有机物在微生物作用下氧化所消耗的溶解氧的量，单位是mg/L。从以上定义可以看出，BOD代表水体中有机污染物的污染程度。由于BOD可间接表示微生物氧化有机物的含量，所以BOD成为水污染控制领域最广泛采用的监测指标之一。目前国内外均采用5天20"c培养法测定水样中的BOD值，它包括水样采集、水样充氧、培养、测定等步骤。简单地说，就是将水样密封于试验瓶中，在20±1。C下培养5天，然后分别测定样品培养前后的溶解氧，这两者之差即为5d的生化需氧量B0D5。这种方法存在许多不足之处，如测定周期长、操作复杂、重现性差、不宜现场监测等。因此，迫切需要一种操作简单、准确、快速、自动化程度高、适用范围广的新方法来测定BOD。BOD生物传感器快速测定仪就是利用生物传感器的原理，以微生物作为识别材料，当样品进入测量室时，水样中的有机物与微生物接触并被微生物分解。微生物在分解有机物的过程中会消耗水中的溶解氧，导致溶解氧浓度降低，利用相应的换能器可以检测到溶解氧浓度的变化，产生相应的信号。这一信号变化的大小与样品中BOD浓度存在一定的线形关系，通过对信号进行处理，可以得到水样的B0D值。由于测定过程在较高温度(一般为20-30。c)下进行，同时对水样进行曝气，因此微生物反应速度加快，大幅度縮短了BOD的测定时间。这就是生物传感器BOD快速测定仪的基本原理。1977年，日本学者Kariibe等利用微生物传感器原理研制出BOD测定仪。该仪器由固定化土壤菌群与氧电极构成，可在15min内测得废水的BOD值。但由于微生物酶对固定化微生物膜的破坏，10d后，传感器便失去活性。此后，Clark等改用多孔醋酸纤维素膜固定微生物制成BOD传感器,主要用于测定高浓度废水，可连续使用17d。基于生物传感器原理的BOD测定方法和测定仪器具有快速、测试简单方便、便于携带等特点，因此，自1977年以来，BOD快速测定仪获得了广泛的研究，并取得了很大进展。BOD生物传感器的基本组成主要包括生物识别元件和换能器。生物识别元件是BOD生物传感器的核心部件，其中包含了生化反应所需要的微生物。因此，生物识别元件在很大程度上决定了BOD传感器的性能和测定的准确性。国内外在BOD传感器识别元件的选择方面做了大量的研究。目前，用作BOD生物传感器识别原件的微生物主要有丁酸梭菌("as^^必i/范6^7ri'w/2)、假单孢菌(/^e〃ob/ff朋assp.)、异常汉逊氏酵母菌(Zfe/7se刀"7aa/70/aaJa)、皮状丝孢酵母菌(Wc力。砂o/W2c由"i咖)等o生物传感器可以縮短水体BOD测定周期，节省人力、物力和财力，更重要的是能及时反映地表水、工业废水和生活污水的污染程度，为管理和决策部门掌握水体污染现状(尤其是事故发生时)提供科学的决策依据，同时也为工业企业的废水治理，污水处理厂的工艺设计、控制、改进处理效率等及时提供参数。因此，开发具有自主知识产权的、适合我国国情的、性能优越且价格合理的生物传感器B0D快速测定仪是一项非常必要和迫切的任务，为我国水体有机污染的快速监测及废水处理厂的运行控制提供技术保障，并产生较大的经济效益、环境效益和社会效益。我们经过多年研究，发明了一种BOD快速测定方式(发明专利生化需氧量生物传感器，专利号ZL00132125.0)以及利用固定化技术制备微生物颗粒的方法(发明专利一种聚乙烯醇固定化酶/微生物的方法，专利号ZL00132126.9;发明专利一种抑制聚乙烯醇固定化微生物颗粒水溶膨胀性的方法，专利号ZL200610011608.X)，并研制出B0D快速测定仪。本发明提出了一种利用酿酒酵母作为测定B0D的生物识别元件,力求拓宽对于多种废水的测定范围，满足更多行业的使用需要。此外，利用PVA固定化酿酒酵母制备活性高、选择性强的生物识别元件，以提高生物响应的稳定性，并保证识别元件的一致性，从而提高B0D传感器的商品化程度。
发明内容本发明的目的是提出了以酿酒酵母作为生物识别元件快速测定B0D的方法，其特征在于，该方法包括选择酿酒酵母作为生物识别元件、利用PVA固定化酿酒酵母制备生物识别元件工艺和利用PVA固定化酿酒酵母生物识别元件对BOD的快速测定；所述选择酿酒酵母作为生物识别元件是选择酿酒酵母作为快速测定B0D生物识别材料的主要原因如下1)酿酒酵母是一种高活性的好氧微生物，同化碳水化合物的能力很强，目前已广泛应用于高浓度有机工业废水的综合治理；2)酿酒酵母自身无毒害作用，不会对环境产生二次污染；3)酿酒酵母的培养条件要求不高，并生长迅速，因此宜于获得；4)酿酒酵母可以长期干燥保存，并能长久保持酶的活力；5)酿酒酵母细胞具有耐渗透压的特点，可适用于海洋污染的监测；所述利用PVA固定化酿酒酵母制备生物识别元件工艺将酿酒酵母细胞悬浮于去离子水中，其浓度为10—20g/100mL(w/v)，然后与溶解好的PVA溶液混合，得到均匀的混合液，PVA的最终浓度为8—10%(w/v)，将该混合液滴入饱和硼酸溶液500mL中，充分交联反应10—12小时后取出，用去离子水冲洗3遍，得到作为生物识别元件的固定化酿酒酵母颗粒，放置冰箱中冷藏备用；所述利用PVA固定化酿酒酵母生物识别元件对BOD的快速测定测量时，固定化微生物颗粒与待测样品在测量室中混合，用微量曝气管进行搅拌和曝气，使其中溶解氧饱和，固定化微生物颗粒在分解有机污染物的过程中分解水体中可生物降解的有机污染物，并且消耗水体中的溶解氧，使溶解氧浓度不断降低，导致溶解氧逐级降低至一个新的稳定状态；根据两个稳态之间的溶解氧差值，通过标准曲线即可计算出所测水样的BOD值。其中两个稳态是指第一个稳定状态设定为水样达到预定的测量温度时，第二个稳定状态设定为连续3次电流值读数的变化范围小于0.001)LiA。所述固定化微生物颗粒为固定化酿酒酵母颗粒。本发明的有益效果是与目前使用的BOD快速测定仪的生物识别元件相比，本发明提出的酿酒酵母弥补了其诸多不足(1)酿酒酵母的代谢活性高，分解有机污染物的能力强，拓宽了对多种废水的测量范围；(2)根据水样的污染程度不同，改变固定化微生物颗粒的量可以调整有效测量范围；(3)固定化微生物颗粒的使用寿命更长，微生物的活化和保存也更简单、方便；(4)固定化酿酒酵母细胞具有耐渗透压的特点，因此，以酿酒酵母作为生物识别元件适用于对海洋水体有机污染的快速监测。图1是B0Ds为5-50mg/L范围的海水的标准曲线。具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明-实施例1用本发明提出的酿酒酵母作为B0D快速测定的生物识别元件，进行了标准B0D样品的测定。分别配置B0D浓度为5，20,25，40，50，75，100，125，150，175，200mg/L的标准GGA溶液，测定条件为温度控制在30±1*€，曝气量为200-500mL/min。利用固定化酿酒酵母颗粒为生物识别材料，利用溶解氧电极测定上述BOD标准溶液的浓度。测定结果表明，DO值的变化与样品的BOD值之间具有良好的线性关系，线形相关系数大于0.99，满足BOD快速测量要求。实施例2用本发明提出的酿酒酵母作为BOD快速测定的生物识别元件，配置BOD浓度为50mg/L的标准GGA溶液，测定条件为温度控制在30士厂C，去离子水稀释，曝气量为200mL/inin。测定结果的重现性如表1所示。表1固定化酿酒酵母对BODs为50mg/L的GGA溶液响应的重现性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通过对表中的数据进行分析可以看出，重现性试验的测量次数为8次，溶解氧降低值的平均值为0.34mg/L，最大相对偏差为10.7%，满足BOD快速测量要求。实施例3用本发明提出的酿酒酵母作为BOD快速测定的生物识别材料，进行了海水BOD标准样品的测定。海水BOD标准样品的配置步骤完全与GGA溶液的配置步骤相同(实施例l)，仅将配置所用去离子水换为标准海水。此标准海水取自远海海平面下50m处，然后进行沙滤，最后进行紫外线消毒。测定条件为温度控制在30±1t:,去离子水稀释，曝气量为200-500mL/min。测定结果如图l所示。可以看出，DO值的变化与样品的BOD值之间具有良好的线性关系，线形相关系数大于0.99，满足BOD快速测量要求。实施例4用本发明提出的酿酒酵母作为BOD快速测定的生物识别材料，进行了实际生活污水样品的BOD测定。实验所用生活污水取自清华大学学生区的生活污水。采用GGA标准溶液标定过的测试系统对所取的生活污水进行测量，测得该生活污水的BOD值分别为48.5mg/L，采用五日标准稀释法的测定结果为42.4mg/L。可以看出，利用本发明的酿酒酵母作为BOD快速测定的生物识别材料，BOD快速测定值与五日BOD标准稀释测定值在生活污水的测定中结果是近似的。权利要求1.一种以酿酒酵母作为生物识别元件快速测定BOD的方法，其特征在于，该方法包括选择酿酒酵母作为生物识别元件、利用PVA固定化酿酒酵母制备生物识别元件工艺和利用PVA固定化酿酒酵母生物识别元件对BOD的快速测定；所述选择酿酒酵母作为生物识别元件是选择酿酒酵母作为快速测定BOD生物识别元件的主要原因如下1)酿酒酵母是一种高活性的好氧微生物，同化碳水化合物的能力很强，目前已广泛应用于高浓度有机工业废水的综合治理；2)酿酒酵母自身无毒害作用，不会对环境产生二次污染；3)酿酒酵母的培养条件要求不高，并生长迅速，因此宜于获得；4)酿酒酵母可以长期干燥保存，并能长久保持酶的活力；5)酿酒酵母细胞具有耐渗透压的特点，可适用于海洋污染的监测；所述利用PVA固定化酿酒酵母制备生物识别元件的工艺将酿酒酵母细胞悬浮于一定量的去离子水中(浓度范围10-20g/100mL(w/v)为)，然后与溶解好的PVA溶液混合，得到均匀的混合液，PVA的最终浓度为8-10％(w/v)，将该混合液滴入饱和硼酸溶液500mL中，充分交联反应10-12小时后取出，用去离子水冲洗3遍，得到作为生物识别元件的固定化酿酒酵母颗粒，放置冰箱中冷藏备用；所述利用PVA固定化酿酒酵母生物识别元件对BOD的快速测定测量时，固定化微生物颗粒与待测样品在测量室中混合，用微量曝气管进行搅拌和曝气，使其中溶解氧饱和，加热控制温度条件，使固定化微生物颗粒在分解有机污染物的过程中分解水体中可生物降解的有机污染物，并且消耗水体中的溶解氧，使溶解氧浓度不断降低，导致溶解氧逐级降低至一个新的稳定状态；根据两个稳态之间的溶解氧差值，通过标准曲线-线性回归方程即可计算出所测水样的BOD值。2.权利要求1所述以酿酒酵母作为生物识别元件快速测定B0D的方法，其特征在于，所述固定化微生物颗粒为固定化酿酒酵母颗粒。3.权利要求1或2所述以酿酒酵母作为生物识别元件快速测定B0D的方法，其特征在于，所述固定化酿酒酵母颗粒可用于天然水体、工业废水、生物污水以及海水中B0D值的快速测定，水样不经稀释直接测量的范围为B0D值为5—200mg/L。全文摘要本发明公开了属于环境污染监测
技术领域：
的以酿酒酵母作为生物识别元件快速测定BOD的方法。该方法包括选择酿酒酵母作为生物识别元件、利用PVA固定化酿酒酵母制备生物识别元件工艺和利用PVA固定化酿酒酵母生物识别元件对BOD的快速测定；本发明选择酿酒酵母作为测定BOD的识别元件，可以拓宽对多种废水的测定范围、BOD的快速测定结果稳定性和重现性好；利用PVA固定化酿酒酵母制备活性高、选择性强的生物识别元件，可以提高生物响应的稳定性，并保证识别元件的一致性、机械强度和使用寿命，生物识别元件的使用寿命达到3-6个月。本发明可应用于天然水体、工业废水、生物污水以及海水中BOD值的快速测定。文档编号G01N33/18GK101644702SQ20091009064公开日2010年2月10日申请日期2009年9月2日优先权日2009年9月2日发明者王建龙,俊胡申请人:清华大学