专利名称：大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类异质雌核发育二倍体的筛选方法，尤其是涉及一种大黄鱼 (i^ewc/(wa'ae"a cracea)异质雌核发育二倍体的筛选方法。
背景技术：
异质雌核发育二倍体是指利用人工诱导雌核发育技术培育的特殊种质材料，即采用遗传 失活精子启动卵子发育，再利用染色体组加倍技术抑制第二次减数分裂得到的二倍体。异质 雌核发二倍体仅含有母本基因组，没有父本的遗传物质，因此得到的后裔全部表现母性性状。 异质雌核发育二倍体在水产生物遗传育种和种苗生产中有着广阔的应用前景，包括快速建 立纯系、实现规模化全雌养殖、遗传分析、提高产量；综合育种、加快育种速度等。
大黄鱼异质雌核发育二倍体的诱导方法已经建立，并应用于遗传学研究中([l]王晓清， 王志勇，柳小春，等.大黄鱼人工诱导雌核发育后代的微卫星标记分析[J].遗传，2006， 28(7): 831-837; [2]许建和，尤锋，吴雄飞，等.大黄鱼雌核发育二倍体的人工诱导[J].海洋科学, 2006， 30(12): 37-42; [3]王德祥，苏永全，王世锋，等.异源精子诱导大黄鱼雌核发育的研究 [J].高技术通讯，2006， 16(11): 1206-1210; [4] Xu J H, You F, Yan B L, " fl/. Effects of ultra-violet irradiation on sperm motility and diploid gynogenesis induction in large yellow croaker(尸sewifesc/aem)！ cracea) undergoing cold shock[J]. Aquae Int, 2007, 15: 371-382; [5] Li Y Y, Cai M Y, Wang Z Y, " a/. Microsatellite - centromere mapping in the large yellow croaker (i^eiw/oscz'aewa cracea) using induced gynogenetic diploid families[J]. Mar Biotech, 2008, 10: 83-90)。但人工诱导异质雌核发育二倍体，有时会混有普通二倍体。即少量精子未被遗传失 活，导致卵子正常受精，产生两性融合的普通二倍体。例如，王晓清等发现所分析的两个大 黄鱼异雌核发育家系中，有一个家系混有12.5%的普通二倍体([6]王晓清，王志勇，柳小春, 等.人工雌核发育大黄鱼CPw^oydae朋ctocm)的AFLP分析[J].海洋与湖沼，2007, 38(1): 22-28)。异质雌核发育二倍体作为宝贵的种质材料，如果混有普通二倍体，将大大影响其在 遗传研究和种苗生产中的应用价值，甚至导致规模化单性生产的失败，造成经济损失。因此， 在作为种质材料应用于种苗生产和遗传育种之前，要对异质雌核发育二倍体进行筛选，剔除 混在其中的普通二倍体。王晓清等于2007年在"海洋与湖沼"第38巻22-28页上发表的"人工雌核发育大黄鱼 (i^i^wd"e憩cracefl)的AFLP分析" 一文中，以及于2006年在"遗传"第28巻831-837页上 发表的"大黄鱼人工诱导雌核发育后代的微卫星标记分析" 一文中，分别提供了应用AFLP 和微卫星标记鉴别雌核发育二倍体和普通二倍体的方法(参考文献[1]和[6])。两种鉴别方法 都是基于亲子鉴定的原理，即将后裔的基因型与父母本基因型进行比较，将不含父本特有基 因的个体判定为异质雌核发育二倍体，含有父本特有基因的个体判定为普通二倍体。基于亲 子鉴定原理的异质雌核发育二倍体筛选方法存在以下问题
1) 材料培育过程有特殊要求。从纷杂的亲子关系中鉴别是否含有父本基因的难度和工作 量都是巨大的。要简化亲子鉴定工作量，确保鉴定准确性，材料需要按家系培育的方法进行 育苗与培养。但是实际操作中，异质雌核发育家系培育难度大、工作量大、费用高。
2) 对样品和系谱记录的保存要求高。要进行亲子鉴定需要保存完整且标识清晰的亲本 DNA样品，同时需要详实记录交配组合和后裔的系谱。 一旦样品或记录丢失或混杂，基于亲 子鉴定原理的鉴别方法就无法施行。要保证亲本DNA样本和操作记录的完整和清晰，必然 加大管理成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对材料培育过程、亲本DNA样品和记录保存均没有特殊要求 的大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法。
在异质雌核发育二倍体中，与着丝粒紧密连锁的基因的纯合度接近100%，而在普通二倍 体群体中相同基因的纯合度理论上在50%左右(参考文献[5]: LiYY,CaiMY,WangZY,e/a/. Microsatellite - centromere mapping in the large yellow croaker (i^ewt/(wc/ae"a cracea) using induced gynogenetic diploid families[J]. Mar Biotech, 2008, 10: 83-卯.)。基于此研究结果，本发
明所述大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法包括以下步骤
1) 模板DNA的提取采用酚-氯仿-异戊醇法提取大黄鱼基因组DNA，作为PCR反应所 需的DNA模板；
2) PCR扩增将上述模板DNA采用5 10个与着丝粒紧密连锁的微卫星标记引物分别进 行PCR扩增，得PCR反应产物；
3) 确定基因型将步骤2)所得PCR反应产物，用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳 结束后，将变性聚丙烯酰胺凝胶用硝酸银染色显带，根据显带结果，如果一个泳道上仅有l 个等位基因，则该个体在所检测基因座位上为纯合体；如果一个泳道上仅为2个等位基因，则 该个体在所检测基因座位上为杂合体；
54)筛选全部检测基因座均为纯合的个体，作为异质雌核发育二倍体选留；有一个以上 的基因座位是杂合的个体，作为大风险混杂个体剔除，不予选留。
在步骤l)中所述酚-氯仿-异戊醇法提取大黄鱼基因组DNA具体为剪取待筛选大黄鱼 组织10 20 mg，置于离心管中，剪碎后加pH 8.0 STE缓冲液600 1000 pl和20 40 mg/ml 蛋白酶K10pl，置于50 60。C下消化4 10h;再加入2 6 mg/ml的RNase A4 6 pl，混匀 后置于37 40 。C下反应1 2 h;再加入pH 8.0 Tris-饱和酚400 1000 pl，混匀后12000 rpm离 心lOmin，将上清液移到另一个离心管中，弃下层；加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25 : 24 :〗.)， 混匀后12000 rpm离心10 min，吸取上清液于另一个离心管中，弃下层；加等体积氯仿-异戊 醇(24: 1)，反复混匀，12000 rpm离心10min，将上清液移到另一个离心管中，弃下层；加 入2.5倍体积的无水乙醇，置于碎冰上沉淀10min以上；12000 rpm离心5 min，沉淀用20 pl 超纯水溶解，作为PCR反应所需的DNA模板。
在步骤2)中，所述PCR扩增具体为反应体系为步骤l)所抽提DNA模板50 100ng， 引物0.2nmol/L， TaqDNA聚合酶lu， 10xPCR反应缓冲液2 pl， 2 mmol/L的dNTPs 2.0 pl， 加入无菌去离子水，使总体积达到20nl。
PCR反应缓冲液的成分组成最好为100mmol/LTris-HCl， 100mmol/L KC1， 80 mmol/L (NH4) 2S04， 20mmol/LMgCl2， 0.5%NP-40， pH9.0。
在步骤2)中，PCR反应条件最好为预变性94'C5min; 30 40个热循环(每个循环条 件为94°C变性lmin， 50 57 °C退火30 s， 72°C延伸45 s); 72。C延伸10min;
在步骤3)中，所述变性聚丙烯酰胺凝胶的组成最好为60 g丙烯酰胺，3.2 g甲叉丙烯 酰胺，7mob尿素，10xTBE100ml，加蒸馏水至1L。
在步骤3)中，所述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法最好为在恒功率60 90W电泳45 90min，电泳缓冲液为lxTBE。
在步骤3)中，所述硝酸银染色显带具体为凝胶置于l M的冰乙酸中固定30min，用水 冲洗一遍后，转至染色液中染色lh，再转至显影液中显影，待凝胶显示出条带后取出。
染色液的组成最好为AgN03 lg，甲醛1.5 ml， 10mmol/L Na2S203 0.2 ml，加双蒸水 至1L。
显影液的组成最好为NaOH5g，甲醛1.5 ml，加双蒸水至1L。
与现有基于亲子鉴定原理的异质雌核发育筛选方法相比，本发明对材料培育过程、亲本 DNA样品和系谱记录保存均无特殊要求，可以简化大黄鱼异质雌核发育二倍体培育工艺，降 低生产和管理成本。
具体实施方式
实施例1
1)模板DNA的提取
取待筛选的人工诱导的异质雌核发育二倍体大黄鱼(诱导程序参见参考文献[5]) 30尾和 按普通生产程序培育的大黄鱼30尾，分别剪取样品的背鳍14 18mg，置于离心管中，剪碎 后加pH 8.0 STE缓冲液600 pl和20 mg'ml'1蛋白酶K 10 pl，置于5(TC下消化10 h;再加入4 mg/ml的RNase A4 pl，混匀后置于37 'C下1 h;再加入pH 8.0 Tris-饱和酚600 pl，混匀后12000 rpm/min离心10min，将上清液移到另一个离心管中，弃下层；加入等体积Tris-饱和酚-氯仿 -异戊醇(25 : 24 : 1)，混匀后12000 rpm/min离心10min，吸取上清液于另一个离心管中；加 等体积氯仿-异戊醇(24:1)，反复混匀，12000 ipm/min离心10 min，将上清液移到另一个 离心管中，弃下层；加入2.5倍体积的无水乙醇，置于碎冰上沉淀10min; 12000 rpm离心5min， 沉淀用2(^1超纯水溶解，作为PCR反应所需的DNA模板。
2) PCR扩增
模板DNA分别采用如表1的引物进行PCR扩增。
表l微卫星座位名称正反向引物序列退火温度
LYC0004f:acctccagtgggatgtga55
r:ggctgtttgttataatttgtg
LYC0008f: gaaacaatagctcgctcctg55-57
r:gactctgccagcacattagtg
LYC0011f: cttttattggctecgtatga55
r:cactcacactagcacgcac
LYC0015f:acagtctaaagctgccagca55
r:tgagaccaaccacatttctgt
LYC0021f:gtccttccctaaagcgagg50-55
r:tgcgtaccaattcactgca
LYC0022f:agagataacgtagacatgattg50-55
r:cagcaaaagttcaaaatggag
LYC0025f:ggatggatggaggtagagag50-55
r:ctgcttgtgagggtaataact
LYC0027f:cacccaataatatcgccata50
r:gcacacacaatcatcatcatt
LYC0032f:gggagaagcagcaggaca50
r:gaaacaagagcactgagagcc
LYC0033f:ggatggaggagtgatgatgg50
r:gcactgagacctgaatgctcc
7LYC0004的PCR扩增。PCR反应体系为引物LYC0008 0.2 pmol/L，步骤1所抽提DNA模 板50 ng，Taq DNA聚合酶lu， 10xPCR反应缓冲液[成分组成100 mmol/LTris-HCl， 100 mmol/L KC1， 80誰ol/L (NH4) 2S04， 20 mmol/LMgCl2， 0.5% NP-40 pH 9.0] 2 pl， 2謹ol/L的dNTPs 2.0|il，加入无菌去离子水，使总体积达到20nl。 PCR反应条件为预变性95"C5min; 30个热 循环(条件为94°C变性lmin， 55。C退火30 s， 72 °C延伸45s ); 72。C延伸10min。
LYC0008、 LYCOOll、 LYC0015、 LYC0021、 LYC0022、 LYC0025、 LYC0027、 LYC0032 和LYC0033的扩增。同LYC0004的扩增，仅将微卫星标记引物和热循环的退火更换，参见表2。
3) 确定基因型
上述所得PCR反应产物采用6。/。的变性聚丙烯酰胺凝胶(6%丙烯酰胺，0.32%甲叉丙烯 酰胺，7mol/L尿素，lxTBE)电泳，在恒功率80 W下电泳45min。电泳结束后，凝胶置于1% 的冰乙酸中固定30min;用水冲洗一遍后，转至染色液(AgN03 lg，甲醛1.5ml， 10mmol/L Na2S203 0.2 ml,加双蒸水至1L)中染色lh;再转至显影液(NaOH 5g，甲醛1.5ml，加双蒸 水至1L)中显影至凝胶显示出条带。根据显带结果， 一个泳道上仅为l个等位基因即该个体在 所检测基因座位上为纯合体，一个泳道上仅为2个等位基因即该个体在所检测基因座位上为杂 合体。
4) 结果
30尾待筛选人工诱导的异质雌核发育二倍体大黄鱼中，有12尾在LYC0004、 LYC0008、 LYC0011 、 LYC0015、 LYC0021、 LYC0022、 LYC0025、 LYC0027、 LYC0032和LYC0033等 IO个基因座上都是纯合。这12尾鱼经AFLP亲子鉴定和倍性分析确证为雌核发育二倍体。
30尾按普通生产程序培育的大黄鱼，未检测到在LYC0004、 LYC0008、 LYC0011 、 LYC0015、 LYC0021、 LYC0022、 LYC0025、 LYC0027、 LYC0032和LYC0033等10个基因 座同时为纯合体的个体。
实施例2
1)模板DNA的提取
按实施例1所述方法提取PCR反应所需的DNA模板。
2) PCR扩增
按实施例1所述方法步骤2)进行PCR扩增，扩增引物换为5对，分别为LYC0008、 LYC0011 、 LYC0022、 LYC0025和LYC0033，序列和退火温度参见表l。
3) 确定基因型
按实施例1步骤3)所述方法确定待测个体基因型。4)结果
30尾待筛选人工诱导的异质雌核发育二倍体大黄鱼中，有22尾在LYC0008、 LYCOOll、 LYC0022、 LYC0025和LYC0033等5个基因座位都是纯合体。这22尾鱼经AFLP亲子鉴定和倍 性分析确证为雌核发育二倍体。
30尾按普通生产程序培育的大黄鱼，未检测到在LYC0008、 LYCOOll、 LYC0022、 LYC0025 和LYC0033 5个基因座同时为纯合体的个体。序列表
实施例l:模板DNA进行PCR扩增的引物
序列编号微卫星座位名称正反向引物序列退火温度
1LYC0004f:acctccagtgggatgtga55
2r:ggctgtttgttataatttgtg
3LYC0008f:gaaacaatagctcgctcctg55-57
4r: gactctgccagcacattagtg
5LYC0011f:cttttattggctccgtatga55
6r:cactcacactagcacgcac
7LYC0015f:acagtctaaagctgccagca55
8r:tgagaccaaccacatttctgt
9LYC0021f:gtccttccctaaagcgagg50-55
10r:tgcgtaccaattcactgca
11LYC0022f:agagataacgtagacatgattg50-55
12r:cagcaaaagttcaaaatggag
13LYC0025f:ggatggatggaggtagagag50-55
14r:ctgcttgtgagggtaataact
15LYC0027f:cacccaataatatcgccata50
16r:gcacacacaatcatcatcatt
17LYC0032f:gggagaagcagcaggaca50
18r:gaaacaagagcactgagagcc
19LYC0033f:ggatggaggagtgatgatgg50
20r: gcactgagacctgaatgctcc
权利要求
1.大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法，其特征在于包括以下步骤1)模板DNA的提取采用酚-氯仿-异戊醇法提取大黄鱼基因组DNA，作为PCR反应所需的DNA模板；2)PCR扩增将上述模板DNA采用5～10个与着丝粒紧密连锁的微卫星标记引物分别进行PCR扩增，得PCR反应产物；3)确定基因型将步骤2)所得PCR反应产物，用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳结束后，将变性聚丙烯酰胺凝胶用硝酸银染色显带，根据显带结果，如果一个泳道上仅有1个等位基因，则该个体在所检测基因座位上为纯合体；如果一个泳道上仅为2个等位基因，则该个体在所检测基因座位上为杂合体；4)筛选全部检测基因座均为纯合的个体，作为异质雌核发育二倍体选留；有一个以上的基因座位是杂合的个体，作为大风险混杂个体剔除，不予选留。
2. 如权利要求1所述大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法，其特征在于在步骤1)中 所述酚-氯仿-异戊醇法提取大黄鱼基因组DNA具体为剪取待筛选大黄鱼样品组织10 20 mg，置于离心管中，剪碎后加pH8.0STE缓冲液600 100 0ti1和20 40 mg/ml蛋白酶K 10 fil，置于50 60。C下消化4 10h;再加入2 6mg'ml"RNaseA4 6nl，混匀后置于37 40 。C下反应1 2 h;再加入pH 8.0 Tris-饱和酚400 1000 pl，混匀后12000 rpm离心10 min， 将上清液移到另一个离心管中，弃下层；加入等体积Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇(25 : 24 : 1)， 混匀后12000 rpm离心10 min，吸取上清液于另一个离心管中；加等体积氯仿-异戊醇(24: 1)，反复混匀，12000 rpm离心10min，将上清液移到另一个离心管中，弃下层；加入2.5倍 体积的无水乙醇，置于碎冰上沉淀10min; 12000 rpm离心5 min，沉淀用20 pl超纯水溶解， 作为PCR反应所需的DNA模板。
3. 如权利要求l所述大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法，其特征在于步骤2)中，所 述PCR扩增的反应体系为引物0.2^mol/L，步骤l)所抽提DNA模板50 100 ng， TaqDNA 聚合酶lu， 10xPCR反应缓冲液2 nl， 2 mmol/L的dNTPs 2.0 pi,加入无菌去离子水，使总体 积达到20 pl。
4. 如权利要求l所述大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法，其特征在于在步骤2)中， PCR扩增的反应条件为预变性94'C5min; 30 40个热循环，每个循环条件为94°C变性 lmin， 50 57°C退火30 s， 72°C延伸45 s; 72。C延伸10min。
5. 如权利要求l所述大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法，其特征在于在步骤2)中， 所述PCR扩增的反应缓冲液的成分组成为100 mmol/L Tris-HCl， 100 mmol/L KC1， 80 腿ol/L (NH4) 2S04， 20 mmol/LMgCl2， 0.5%NP-40 pH 9.0。
6. 如权利要求l所述大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法，其特征在于在步骤3)中， 所述变性聚丙烯酰胺凝胶的组成为60 g丙烯酰胺，3.2 g甲叉丙烯酰胺，7 moL尿素，10xTBE 100 ml，加蒸馏水至1L。
7. 如权利要求l所述大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法，其特征在于在步骤3)中， 所述变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳的方法为在恒功率60 90W电泳45 90min，电泳缓冲 液为lxTBE。
8. 如权利要求l所述大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法，其特征在于在步骤3)中， 所述硝酸银染色显带的方法具体为凝胶置于l。/。的冰乙酸中固定30min;用水冲洗一遍后，转至染色液中染色lh;再转至显影液中显影，待凝胶显示出条带后取出。
9. 如权利要求9所述大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法，其特征在于在步骤3)中， 所述硝酸银染色显带所用的染色液的组成为AgN03lg，甲醛1.5 ml， 10mmol/LNa2S2O30.2 ml，加双蒸水至1L;所述硝酸银染色显带所用的显影液的组成为NaOH5g，甲醛1.5 ml， 加双蒸水至1L。
全文摘要
大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法。提供一种对材料培育过程、亲本DNA样品和记录保存均没有特殊要求的大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法。采用酚-氯仿-异戊醇法提取大黄鱼基因组DNA，作为PCR反应的DNA模板，采用5～10个与着丝粒紧密连锁的微卫星标记引物进行PCR扩增得PCR反应产物，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用硝酸银染色显带，若一个泳道上仅有1个等位基因，则该个体在所检测基因座位上为纯合体；若一个泳道上仅为2个等位基因，则该个体在所检测基因座位上为杂合体；全部检测基因座均为纯合的个体，作为异质雌核发育二倍体选留；有一个以上的基因座位是杂合的个体，作为大风险混杂个体剔除，不予选留。
文档编号G01N21/78GK101597648SQ20091011208
公开日2009年12月9日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者王志勇, 蔡明夷 申请人:集美大学