专利名称：分析循环抗体的方法
技术领域：
本发明涉及一种分析循环抗体的方法。
背景技术：
快速、可靠、花劍氏廉的分析和诊断方法是非常需要的。
PCT/SE03/00919 (AmicAB)涉及一种微^^、统，它包含基底，基底上體 有至少一条流路，该流路包含复数个微型柱，它们从基底上向上伸出，微型柱 之间的间距足够小从而可以引起液体样品的毛细作用，迫使，液体移动。公 开了装置可包含更密集的区，其可以起到筛网的作用，阻止例如细M过。还 公开了关于微结构的实施方式，其中的形状、尺寸和/或中心到中心间距形成了 梯度使得细胞以及诸如此类的物质被迟滞或分离。
PCT/SE2005/000429 (AmicAB)公开了一种^g和方纟去，用来在检测液体 样品中的分析物之前对所述液##品中的成分进行分离，其中样品添加到基底 上的接收区，戶腿基底任选地还包含反应区，分别连接接收区和反应区并在基 底上形成了流路的皿^t显育区，其中所述基底是无 L基底，而且至少部分所
述流路由基本上垂直于戶;M基底表面的凸起区域组成，凸起区域具有高度、直
径和相互间距，从而在戶脱区实5^脱液勝品的横向毛细流动，并且分离部 件配置成与接收样品的区鄉比邻。公开了除去红细胞的实施方式。
PCT/SE2005/000787 (AmicAB)涉及处理液,品的，，包括带有至少 一个用于接收样品的区的流路、和錢鄉育区，戶脱区通过具有基本垂直于 其表面的凸起的区连接或包括这样的区，所，置衛，能接iB^f述液,品 的槽，戶腿槽包括具有基本垂直于其表面的凸起的区，并且戶脱槽适合于响应
外部影响并调节它接iB^M液体样品的能力。公开了该装置可以用于颗粒物质 如细lfe/人大量样品中分离。描述了红细胞能被分离且没有出现显著的破裂。
PCT/US2003/030965 (The General Hospital Corporation, and GPB Scientific LLC)公开了从样品中分离细胞的方法。还公开了具有不同性质的细胞的分离。该装置是封闭的，具有输入和输出通道和盖子。装置包括障碍物阵列，其能够 结合细胞群体。
US2007/0059718A1公开了用于检观,、鹏具有生物危险的分析物的方法， 如细菌、原生动物、病毒病原体和毒素。
目前需要E^有力和可靠的分析循环抗体的方法。
发明
本发明的一个目的是掛共改进的用于分析循环抗体的方法。 本发明提供了用于分析循环抗体的方法，包括如下步骤
a. 提供包含基底的分析装置，戶舰基底上设有至少一个加样品区，至少一 个阻留区，至少一个槽(sink)，至少一条连接加样品区、阻留区和槽的流路， 其中、 是开放的并包括基本上垂直于戶，基底表面并具有高度(H)、直径(D) 和相互间距(tl， t2)的凸起，从而实^^M样品的横向毛细流动并且细胞可以 流经凸起，其中所述阻留区包含至少一种结合细胞结构的亲和结合工具 CmeansX
b. 在加样品区加入至少一个样品，且
c. 读出结果，
其中针对细胞结构的循环抗術皮观啶。
有关本发明的更深入的方面和实施方式在所附的权禾腰求中被限定，在此 通过援引并入。
通^^f共包含联合了阻留区的凸起的基底，^E^M阻留区中颗粒和/或细胞
由于吸弓i力会穀y阻留，产生了^ra点。
这些凸起会使得基底产生很大的表面积，而且阻留区的大的表面积带来益 处，这是因为细胞能更有效的结合。凸起与亲和结合的齢使分t碟置的动力 学得到提高。
这些与亲和结合工具联合的凸起能够使得在装置中产生适宜的样品液体 流。这使得一些问题例如不希望的堵塞可以被避免。
本发明具有进一步的益处，根据本发明，在开放的系统中对结果读数更容 易。而且在开放的系统中不存在滞留气体的问题。
使用基本上垂直的凸起来分析细胞带来了另一个益处，这些凸起的设计使
4得细胞可以被仔细的处理。 定义
在描述本发明的装置和方法之前，应明白本发明不受限于本文公开的特别 的构造、方法步骤和材料，因为该构造、方法步骤和材料可以有些变化。还应 明白本文所用的术謝又仅是用于描述特别的实施方式，并不作为限制，因为本 发明的范围只受限于所附上的权利要求以及其等同物。还必须指出，如本说明 书和所附权利要求洲顿的单数形式"一"和"该'繊織指示物，上下文中明 确指出的除外。因此，例如提到貪'一种抗体'的反应混合物，则包括两种或更 多种抗体的混，。
术语"约"用于数值上下文中，是指本领職术人员所熟悉和會繊受的准确
度区间。所述区间&10%。
在描述和请求f^t户装置和方法时，按照此处列举的定义使用以下术语。 在权禾腰求书和说明书中的术语"结合细胞的亲和结合工具"表示通过在结 合工具与细胞之间的吸弓l力与细胞结合的元件。
在权利要求书和说明书中的术语"分析'标至少一种分t胸被测定的过程。
在权利要求书和说明书中的术语"分析，"表示借助于其才能执行分析的 體。
在权禾腰求书和说明书中的术语"分析物表示在分析过程中其一种或更多 种性质被测定的物质或化学或生物组分。分析物或成分本身经常不会被测量， 但是分析物的可观懂盼顿会被测量。比如，可以观糧分析物的浓度。 在权利要求书和说明书中的术语"毛细流动",主要由毛细力产生的流动。 在权利要求书和说明书中的术语"壳罩"^^寸闭i分^^r^s的元件。 在权利要求书和说明书中的术语"循环抗体'，在溶液中的抗体。 在权禾腰求书和说明书中的术语"可检观隨团"表示存在于基底上时能够被 检测的樹可^^或原子排列。
在权利要求书和说明书中的术语" "表示其中液体能够在不同区之间流 动的装置上的区域。 在权利要求书和说明书中的术语"流体连接"，流体能在其中传送的连接。 在权利要求书和说明书中的术语"盖子"标盖住部分或^i^s的元件。在权禾腰求书和说明书中f顿的与毛细流动有关的术语"开放的"表示系统 是开放的，也就是系统不是封闭的。有关开放系统的例子包括其中没有盖子与 样品液体毛细接触的系统。在开放系统中盖子不会与样品液体毛细接触，即盖 子不会参与毛细力的产生。
在权禾腰求书和说明书中的术语"相互间距'标舭邻的凸起之间的间距。 在权利要求书和说明书中的术语"阻留区"表示至少部分样品在其中被阻留 的区域。
在权禾腰求书和说明书中的术语"样品"标被分析的混儒或溶液。 在权利要求书和说明书中的术语"加样品区"新样品被添加的区域。
在权利要求书和说明书中的术语"槽(sink)"标能接收液糊品的区域。 在权利要求书和说明书中的术语"物质' ^壬何纯的化学或生物实体，或包 含至少一种化学或生物实体的樹可混合物或溶液。
详细描述
首先一方面樹共了分析循环抗体的方法，包括如下步骤
a) 提供包含基底的分D^置，戶，基底上设有至少一个加样品区，至少一 个阻留区，至少一个槽，至少一条连接加样品区、阻留区和槽的流路，其中流 路是开放的并包括基本上垂直于所述基底表面并具有高度(H)、直径(D)和 相互间距(tl, t2)的凸起，从而实S^M样品的横向毛细流动并且细胞可以流 经凸起，其中戶脱阻留区包含至少一种结合细胞结构的亲和结合工具，
b) 在加样品区加入至少一个样品，且
c) 读出结果，
其中针对细胞结构的循环抗術皮测定。
相互间距(tl， t2) ^^El:角坐标系统中x和y方向上的相互间距。在一 个实施方式中所有的凸起在x方向和/或y方向上具有相同的间距。在可选择的 实施方式中凸起在x方向上具有不同的间距。在一个实施方式中不同凸起在x 方向上的间距为仏、tl2、 tl3……在另一实施方式中凸起在y方向上具有不同的 间距。在一个实施方式中不同凸起在y方向上的间距为t2！、 122、 t23......
装置包括基底。在一个实施方式中基底部分或全部由壳罩或盖子封闭。如 果使用了壳罩或盖子，它们与基底之间的距离使得罩壳或盖子对作用在样品液体上的毛细力没有影响。
至少有一个用于加液体样品的加样品区。流路与加样品区、阻留区和槽形 成流体连接。
在一个实施方式中样品在、2^各内流动从加样品区纟S1阻留区至U达槽。
在一个实施方式中阻留区被设置成穿过样品液体流经的全部路径，这样样 品液体就不能避过阻留区。在一个可选择的实施方式中阻留区被设置成部分样 品液体乡M阻留区但是不与阻留区发生倒可基本的相互作用。
在一个实施方式中a)加样品区、b)阻留区和c)槽中的至少一^括基本 上垂直于戶，基底表面并具有高度(H)、直径(D)和相互间距(tl, t2)的凸 起从而实5I0M样品的横向毛细流动并且细胞可以流经凸起。
在一个实施方式中a)流路、b)加样品区、c)阻留区和d)槽的高度、直 径和相互间距是相同的。在一个可选择的实施方式中，a) ^ 各、b)力口样品区、 c)阻留区和d)槽中的至少一个的高度、直径和相互间距是不同的。
在一个实施方式中亲和结合工具选自抗体、适配体、受体、配体、单链抗 体、抗体片断和麟素。
在一个实施方式中微型柱被排列成微型柱间距为5-200(im。在另一实施方式 中微型柱间距设为20-100pm。
在一个实施方式中微型柱被排列成微型柱高度为l-1000pm。在另一实施方 式中微型柱高度设为l(MOOMm。
在一个实施方式中液体样品选自人或动物血液、尿液、肺液、滑液、伤口 液、唾液、泪液和汗液。
在一个实施方式中液体样品是取自人的血液。
在一个实施方式中细胞结构是部分血液抗原系统。
在一个实施方式中细胞结构是部分涉及HIV感染或检测的抗原。
在一个实施方式中液体样品是取自人的血液，并且被用于针对细菌、病毒 或小粒径单或多细胞传染性介质的循环抗体的测定。
在一个实施方案中液##品是取自人的，。
对本领域技术人员来说，在阅读了说明书和实施例后，本发明的其它特点 和应用以及它们连带的优点^M而易见的。
必须理解的是本发明并不限于此处公开的特定实施方式。下面的例子只是用来提供例示的作用而不是为了限定本发明的保护范围，本发明的保护范围只 受限于所附上的权利要求以及其等同物。
实施例 实施例1
细胞与根据本发明的分t ^a的附着 芯片上的凸起具有不同的中心到中心间距，在流动方向上具有最大间距。
凸起向着顶部逐iW小。凸起的高度为65pm。凸起的底部的直径为70Mm，顶 部的直径为50nm。凸起间在凸起底部的间距为tl=!2=31.77nm，在凸起顶部的 间距为tl=t2=51.77nm。
细胞附着到装置表面的原理以红细胞(RBC)的牢固结合为例说明。在自 由流动歪U芯片的规定区域的过程中，RBCs M不同原理包括RBC 7驗素、电 荷和针对表面抗原的抗体被牢固的附着。
取少量(O.ImJ)的 素浓度为lmg/ml的50mM磷,缓冲液加入芯片上 单通道，pH值为7.5，然后20pl 0.8%RBCs悬浮液被加入，并让它们 1^包含 7麟素的检测区。结果显示RBC与不同 麟素(PHA-E、 PHA-M、 WGA、榴 莲凝素)的结合是不同的，其中最有效的是WGA。在使用了包括如0.1%洗涤 剂吐温20的缓冲液50m1冲洗后，剛艮清晰可见的结合的RBCs仍为附着的。通 过加入10nl兔抗人RBC齢10^1 Cy5山羊抗兔IgG即可定量测定结合的RBCs。
ili^顿针对RBC表面抗原例如血型糖蛋白， 一种主要的人RBC表面蛋 白，的抗体也可以使得芯片表面牢固结合RBC。
在细胞培养中通常用来牢固结合细胞的大分子量聚赖氨酸也可以用于与 RBC结合，在数量上可与WGA相比。
RBC与4castohip的附着也可以通过i顿生物素f恭己的RBC g沉淀的链 霉亲和素来实现。链霉亲和素(0.13^1的2mg TO亲和素/ml)置于pH7.5的PBS 中，加入芯片上的单通道中。利用磺基-NHS-生物素的生物素标记的20^1 1.6%RBCs 、舰包含链霉亲和素的检测区。结果显示RBC与鶴亲和素清楚可 见的牢固结合，并且在使用80^含例如0.1%洗涤剂吐温20的缓冲液冲洗后， 臓保持附着。
8实施例2
针对RBC表面抗原的可溶性A^体的检测(间MC珠蛋白实验，IAT) 抗懒观啲原理以在AJ&清中低滴定度存在的抗D抗体的检测为例说明。 分析原理涉^M;沉积有传染性的例如针对RBC表面抗原抗懒每存活的RBCs 牢固附着或结合到芯片表面。这里^ffi了与实施例1相同的装置。于是，通过 自由流过芯片上的微柱而转运的RBCs被设在检测区的芯片结合抗体俘获。少 量(IOmO的AifiL清样品，其已经以1:100的比例在含有0，/。明胶的LISS缓冲 液稀释，戶皿样品含有不同滴度的抗D抗体，Mffi于敏化RBCs。洗涤(30pl) 之后RBC表面IgG的存在4顿lOpl缀合了 transfluosphere的抗人珠蛋白抗体 (AHG)进行检测。结果显示了相对于抗D抗体的滴度，AHG缀合物与RBCs 的齐懂 性结合。在没有洗涤剂的存^a使用了含有0.5%明胶的低离子强度 盐(LISS)洗涤缓冲液时达至撮佳敏化。
在高敏感性IAT分析中，利用AHG缀^t;的检测iM:具有极大斯托克斯位 移(激发峰位和发射峰位之间的间距)的荧光染料组合而进行，比如在 Transfluosphere和铕的缀^tl中。
实施例3
abo血型抗原实验
在RBCs上的ABO血型抗原被高度特异地检测。从供体血液样品中取得的 RBCs用LISS缓冲液洗涤两次后重悬浮得到0.8%的RBC溶液。在LISS缓冲液 中的洗涤后的供体RBCs (4%， 20Ml)iM 沉积的Ml型糖蛋白(lm^ml， 0.13mJ/ 芯片)附着到装置。先〗細10Ml单克隆的抗RBC-A和RBC-B抗体，接着l顿 10mJ的Cy5缀合的抗小鼠IgM抗体，分别检测a-和B-抗原。最后使用60pl分 析缓沖液(20mMTris， 0.135MNaCl， 10mMEDTA， 0.1%吐温20， 1%BSA， pH7.4)洗涤芯片。4顿了抗RBC-A抗体时A阳性RBCs的荧光信号在635nm 处为明显正值，B阳性RBCs的荧光信号在635nm处为负值(等于背景信号)。 在B阳性RBCs的实验中得到了同样的高特异性。
9
权利要求
1、一种分析循环抗体的方法，包括如下步骤a)提供包含基底的分析装置，所述基底上设有至少一个加样品区，至少一个阻留区，至少一个槽，至少一条连接加样品区、阻留区和槽的流路，其中流路是开放的并包括基本上垂直于所述基底表面并具有高度(H)、直径(D)和相互间距(t1，t2)的凸起，从而实现所述样品的横向毛细流动并且细胞可以流经凸起，其中所述阻留区包含至少一种结合细胞结构的亲和结合工具，b)在加样品区加入至少一个样品，且c)读出结果，其中针对细胞结构的循环抗体被测定。
2、 根据权禾腰求l的方法，其中戶腿液條品选自人或动物血液、尿液、 肺液、滑液、伤口液、唾液、泪液和汗液。
3、 根据权利要求1-2中任一项的方法，其中Blf^液储品取自人的血液。
4、 根据权禾腰求1-3中任一项的方法，其中戶脱细胞结构是部分血液抗原 系统。
5、 根据权利要求14中任一项的方法，其中戶腿细胞结构是部分涉及HIV 感染或检测的抗原。
6、 根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述液##品取自人的血液并 且Mffi于针对细菌、病毒或小粒径单或多细胞传染性介质的循环抗体的测定。
7、 根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述液体样品取自人的骨髓。
全文摘要
本发明提供了一种分析循环抗体的方法，包括如下步骤a)提供包含基底的分析装置，所述基底上设有至少一个加样品区，至少一个阻留区，至少一个槽，至少一条连接加样品区、阻留区和槽的流路，其中流路是开放的并包括基本上垂直于所述基底表面并具有高度(H)、直径(D)和相互间距(t1，t2)的凸起，从而实现所述样品的横向毛细流动并且细胞可以流经凸起，其中所述阻留区包含至少一种结合细胞结构的亲和结合工具，b)在加样品区加入至少一个样品，且c)读出结果，其中针对细胞结构的循环抗体被测定。
文档编号G01N33/569GK101672843SQ20091016397
公开日2010年3月17日 申请日期2009年7月3日 优先权日2008年7月3日
发明者C·彼得森, G·伦德斯特伦, I·门德尔-哈特维格 申请人:阿米克股份公司