专利名称：大肠杆菌o157:h7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大肠杆菌0157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条，属于抗体检测试剂盒技术域。专用于鼠血清中大肠杆菌0157:H7抗体的快速检测，适用于动物养殖场、食品生产企业等地区调査与追溯鼠0157:H7感染状况时的现场检测以及在开展食品安全环境风险评估时使用。
二背景技术：
大肠杆菌(￡sc/jen'cWa co/,', ￡. co/!') 0157:H7是一种重要的人兽共患病原微生物，人感染0157:H7可患腹泻、出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡(夏兴霞，刘洁，王永山，诸玉梅，欧阳伟，何孔旺，张雪寒.动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究I.分泌抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立.江苏农业学报，2009,25(2):291-295)。 1982年在美国首次发现，在此后的20多年中，由0157:H7所致的疾病在全世界范围内都有散发和暴发，1996年曾在日本暴发流行。2001年，在中国江苏、安徽等地也发生了多次食源性感染0157:H7事件，导致177人死亡，弓l起了全社会的广泛关注。0157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，已成为全球性的公共卫生问题，世界卫生组织已将0157:H7列为新的食源性病原菌。
食源性以及与带菌动物接触是人感染0157:H7的主要途径，反刍动物是0157:H7的主要宿主，阳性率0.1%~16%，此外，从鹅、鸡、马、鹿、海鸥、绵羊、山羊、鸽子、鸭、兔、狗、猫的粪便中也可分离到0157:H7。鼠与食品生产和人类生活关系密切，在疫病传播中起重要作用，对食品安全和人类健康威胁极大，但至今缺乏有关鼠感染0157:H7的状况及其流行病学意义的研究资料。
本发明基于我国食品安全的严峻形势和对快速检测试剂盒的迫切需求，运用胶体金免疫层析技术，制备鼠血清0157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条，为监测动物养殖场、食品生产企业等地区鼠0157:H7的感染状况提供简便快速的抗体检测方法，为开展0157:H7流行病学追溯、调査以及食品安全环境风险评估提供技术支撑。
三、 发明内容技术问题
本发明针对当前我国部分动物养殖场、食品生产企业等地区鼠较多的环境现状，研制一种简便、快速、并适合于现场使用的监测鼠大肠杆菌0157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条，用于0157:H7流行病学调査、追溯以及食品安全环境风险评估。
技术方案本发明的具体实施方案如下
一种大肠杆菌(￡ ^en'c/i/aco/!、 ￡. co/f) 0157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条，由颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG制成胶体金垫、分别用0157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG包被的硝酸纤维素膜作为检测线和质控线、玻璃纤维素膜制成的样品吸收垫、吸水滤纸制成的吸收垫组装成的检测试纸条、阳性血清、阴性血清、血清样品稀释液和试纸条使用说明书组成。上述检测试纸条，其制备方法为
1) 大肠杆菌0157:H7抗原的制备
培养大肠杆菌0157:H7， 3500 r/min离心30min，用PBS重悬，0.5%甲醛灭活，PBS洗3次，沉淀重悬于PBS， -20(>(:冻存备用；
2) 免疫胶体金的制备
取20nm颗粒胶体金溶液(在波长521nm时的光吸收值为1.847， 4521 =1.847)20ml，在磁力搅拌(200 r/min)下缓慢加入已纯化的羊抗鼠IgG，在室温下搅拌30min，加质量体积比10%牛血清白蛋白BSA使其终浓度为质量体积比0.4%，室温搅拌5min，加质量体积比10% PEG使PEG终浓度为质量体积比0.2。/。，室温搅拌5min; 12000 r/min离心45min,吸取离心上清，沉淀溶于2ml保存液中，用0.45拜滤膜过滤，置4。C保存备用，制得胶体金标记抗体原液；
3) 金标抗体玻璃纤维素膜的制备
取胶体金标记抗体原液lml，加入工作液2ml稀释，混匀，均匀地加在玻璃纤维素膜上，制成金标抗体玻璃纤维素膜，即胶体金垫，37'C干燥，4'C保存备用；
4) 固相硝酸纤维素膜NC的制备
用0.01M pH7.2的PBS分别稀释大肠杆菌0157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG，用蛋白浓度为2.0 mg/ml大肠杆菌0157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG点样于NC膜上分别作为检测线和质控线，室温干燥，封闭，层析试验背景清晰；
5) 试纸条的组装
在宽2X长9cmPVC底板上(1)，中间段粘贴宽2X长3cm固相硝酸纤维素膜，即NC膜(2);靠近固相纤维素膜检测线T线一端的PVC底板表面粘贴2X2cm的胶体金-羊抗鼠IgG抗体结合物玻璃纤维膜(5)，此玻璃纤维素膜与NC膜(2)重叠O.lcm，另一端与2Xlcm的样品吸收垫(7)重叠0.2 11;靠近固相纤维素膜质控线C线一端的PVC底板表面黏贴2X3.5cm的吸水纸(6)，与NC膜重叠O.lcm;抗体固相硝酸纤维素膜NC膜(2)上划有一条大肠杆菌0157:H7抗原检测线T线(3)和一条鼠血清IgG质控线C线(4)。
T线划在长3cmX宽2cm NC膜一侧lcm的位置上，将浓度为2.0mg/mL的大肠杆菌0157:H7抗原装入划膜机，喷涂于NC膜上，另一喷头划质控线C线，浓度为2.0mg/mL的鼠血清IgG， C线划在NC膜另一侧lcm的位置上，检测线与质控线的距离为lcm,点样量均为5pl喷在硝酸纤维膜上，组装好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为2.5mm的条状，即为抗体检测试纸条成品。
上述检测试纸条的用法，其特征在于在检测抗体时，将待检鼠血清样本用含多联菌免疫兔血清的样品稀释液稀释100倍，取200^滴加于试纸条的反应区，若在检测线处和质控线处均出现红色条带，表明待检血清样本中含有大肠杆菌0157:H7抗体，判为阳性；若仅在质控线处出现红色条带，表明待检样品中不含大肠杆菌0157:H7抗体，则判为阴性；若质控线不出现红色条带，不论检测线是否出现红色条带，均表示实验失败或试纸条失效。
上述检测试纸条的用法中，使用含体积比2X多联菌免疫兔血清的0.01M pH7.2的PBS溶液稀释受试鼠血清样本。
有益效果本发明的特点和优点如下
大肠杆菌0157:H7是一种经食源传播和感染的病原菌，建立快速、敏感、特异的检测试剂是防控该病的重要措施之一。目前，国内外研制的检测试剂均以检测抗原或核酸为基础，尚缺乏抗体检测方法。
本发明针对当前我国食品卫生安全的主要问题和对快速检测试剂盒的迫切需求，运用先进的胶体金免疫层析技术，建立了大肠杆菌0157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条，该试纸条使用简便、快速、特异、敏感、实用，10分钟内即可获得结果，在0157:H7流行病学调査、追溯以及食品安全环境风险评估方面具有重要的应用价值。
四
图l胶体金免疫层析试纸条的结构
l.PVC底板；2.硝酸纤维素膜(NC膜)；3.检测线；4.质控线5.胶体金垫；6.吸收垫(吸水滤纸)；7.样品吸收垫(玻璃纤维素膜)
图2胶体金免疫层析试纸条结果判定标准图3.试纸条的检測结果
l.水；2.阴性鼠血清；3.阳性鼠血清
图4.试纸条的敏感性检测结果
1.阴性对照；2-7.分别为阳性鼠血清稀释度为1:1X1(^ 1:1X102
五具体实施方式
1实验材料
玻璃纤维素膜、硝酸纤维素(NC)膜和20nm颗粒胶体金溶液(在波长521nm时的光吸收值为1.847， J521 =1.847)购自上海捷宁生物科技有限公司；
纯化的鼠血清IgG系用硫酸酸铵盐析和DEAE纤维素方法(刘玉斌，苟仕金主编.动物免疫学实验技术.长春吉林科学技术出版社，1989， 8-15)从鼠血清中提取；
纯化羊抗鼠IgG系用纯化的鼠血清IgG注射免疫山羊4次后，制备免疫血清，进一步用硫酸酸铵盐析和DEAE纤维素方法纯化；
多联菌免疫兔血清系用肠炎沙门氏菌(&/mo"e//a e"feWcfl )、大肠杆菌(Esc/ie/vc/Ka co") K88、 K99、 0159、 0141、 TOPIO、 B121、 BJ5183和猪链球菌(S/r印tococc"sj"&) SS-1混合抗原(所述菌株均购自南京天邦生物科技有限公司)，注射免疫4次后的兔血清；
50份0157:H7免疫鼠血清(阳性血清)系用0157:H7免疫BALB/c小鼠方法制备；20份阴性血清采自清洁级小鼠。以上动物均购自扬州大学比较医学中心。2大肠杆菌0157:H7抗原的制备
大量培养大肠杆菌0157:H7500mL， 3500 r/min离心30min，用PBS重悬，0.5%甲醛灭活，PBS洗3次，沉淀重悬于PBS， -20°(:冻存备用(夏兴霞，刘洁，王永山，诸玉梅，欧阳伟，何孔旺，张雪寒.动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究I.分泌抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立.江苏农业学报，2009,25(2):291-295)。
3免疫胶体金的制备
3.1胶体金标记的最佳pH测定
取lmg/mL羊抗鼠3pL,分别加入100 ^LpH值为7.0、 8.0、 9.0、 10.0的胶体金中，混匀，室温下放置10 15min;再分别加入10。/。NaCl溶液2(HiL，混匀，静置2h后观察结果，确定金标记最适pH值。当胶体金pH值为7.0、 8.0、 9.0、 10.0时，免疫胶体金溶液稳定，颜色鲜艳，胶体金标记蛋白时pH值为7.0 (步骤3.3中用到的标记最适PH)。
3.2最适标记蛋白浓度的测定
取10支试管，各加入l.Oml胶体金溶液。将羊抗鼠IgG用0.01M PB pH7.2分别稀释成50pg/ml、 45ng/ml、 40pg/ml、 35ng/ml、 30pg/ml、 25ng/ml、 20pg/ml、 15ng/ml、10ng/ml，各取l.Oml按顺序加入上述胶体金溶液中。对照管加入lml稀释液(不含蛋白质)，混匀。放置5min后，在上述每试管中加入10%氯化钠水溶液0.1ml。混匀室温静置1 2小时，观察结果。稳定胶体金的最小蛋白用量为25ng/ml。在此基础上再增加10% 20%即为待标记蛋白的实际用量，本试验所用的蛋白量为27.5ng/ml (步骤3.3用到的标记最适蛋白浓度)。
3.3胶体金的标记
取20nm颗粒胶体金溶液20ml，在磁力搅拌下缓慢加入已纯化的羊抗鼠IgG，在室温下搅拌30min。力n 10% BSA使其终浓度为0.4%，室温搅拌5min。力tl 10% PEG使其终浓度为0.2%，室温搅拌5min。 12000 r/min离心45min，小心吸取离心上清，沉淀溶于2ml保存液中(保存液配制方法O.lg四硼酸钠、0.25g BSA、 0.025g NaN3加水溶解后用6N HC1调pH至7.4，补水至250ml，用0.45nm滤膜过滤后，4'C保存)，用0.45阿滤膜过滤，置4'C保存备用。
4大肠杆菌0157:H7抗体胶体金免疫层析试纸条的制备
4.1金标抗体玻璃纤维素膜的制备
取金标抗体原液lml，加入工作液2ml稀释(工作液配制方法6.1gNa2HP04.12H20、 8.5gNaCl、 5.0gPVP40、 2.1g硼酸、1.0gPEG4000、 0.5gBSA加水溶解后用6N HC1调pH至7.4，补水至1000ml，用0.45卿滤膜过滤后，4'C保存)，混匀，均匀的加在玻璃纤维素膜上，制成金标抗体玻璃纤维素膜(胶体金垫)，37'C干燥，4'C保存备用。
4.2固相硝酸纤维素膜(NC)的制备
用0.01M pH7.2的PBS分别稀释大肠杆菌0157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG，以不同的蛋白浓度点样于NC膜上分别作为检测线和质控线，在检测线的一端做好标记，室温干燥。以0157:H7免疫鼠血清为检测样品进行层析试验，观察显色情况，优化点样蛋白浓度。用蛋白浓度为2.0 mg/ml大肠杆菌0157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG点样f NC膜上分别作为检测线和质控线，室温干燥，封闭，层析试验背景清晰。
4.3试纸条的组装
如图1所示，在约宽2X长9 cm PVC底板上(1)，中间段粘贴宽2X长3cm固相硝酸纤维素膜(NC膜2);靠近固相纤维素膜检测线(T线) 一端的PVC底板表面粘贴2X2cm的胶体金-羊抗鼠IgG抗体结合物玻璃纤维膜(5)，此玻璃纤维素膜与NC膜(2)重叠0.1cm，另一端与2Xlcm的样品吸收垫(7)重叠0.2cm;靠近固相纤维素膜质控线(C线) 一端的PVC底板表面黏贴2X3.5cm的吸水纸(6)，与NC膜重叠O.lcm;抗体固相硝酸纤维素膜(NC膜2)上划有一条大肠杆菌0157:H7抗原检测线T线(3)和一条鼠血清IgG质控线C线(4)。
T线划在长3cmX宽2cm NC膜一侧lcm的位置上，将浓度为2.0mg/mL的大肠杆菌0157:H7抗原装入划膜机，喷涂于NC膜上，另一喷头划质控线C线，浓度为2.0mg/mL的鼠血清IgG， C线划在NC膜另一侧lcm的位置上，检测线与质控线的距离为lcm，点样量均为5pl喷在硝酸纤维膜上。组装好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为2.5皿的条状，即为抗体检测试纸条成品。
4.4试纸条的使用
在抗体检测时，将待检鼠血清样本用含2%多联菌免疫兔血清的0.01M PBS pH7.2溶液进行1:100稀释，取200nl滴加于试纸条的反应区，若在检测线处和质控线处均出现红色条带，表明待检样品中含有大肠杆菌0157:H7抗体，判为阳性；若仅在质控线处出现红色条带，表明待检样品中不含大肠杆菌0157:H7抗体，则判为阴性；若质控线不出现红色条带，不论检测线是否出现红色条带，均表示实验失败或试纸条失效(图2)。用组装成的试纸条分别检测0157:H7阳性鼠血清、阴性鼠血清和水三种检测样品，只有0157:H7阳性鼠血清样品在检测线处出现红色条带，结果清晰易辨(图3)。
5胶体金免疫层析试纸条的特异性检测
用试纸条检测大肠杆菌0157:H7免疫鼠血清样本，均为阳性；检测沙门氏菌、大肠杆菌K88、 K99、 0159、 0141、 TOPIO、 BL21、 BJ5183和链球菌SS-1免疫的鼠血清、清洁级鼠血清以及纯净水，全部为阴性，表明本试纸条具有良好的特异性。
6胶体金免疫层析试纸条的敏感性检测
将大肠杆菌0157:H7免疫鼠血清样本从1:1 X 102对数倍比稀释至1:1 X 107，将每一稀释度取200nl分别点样于胶体金免疫试纸条的点样处，10min后观察结果。同时用大肠杆菌0157:H7抗原包被的间接ELISA检须ij，比较两者的检测结果。用试纸条检测1:1乂102 1:1乂106稀释度的0157:H7免疫鼠血清，在检测线与质控线处均出现红色条带，表明抗体检测结果为阳性；而1:1乂107稀释度的血清，仅在质控线处出现明显的红色条带，表明抗体检测结果为阴性，与阴性对照相同(图4)。在ELISA平行对照检测实验中，阳性鼠血清的效价为1X105，与胶体金免疫层析试纸条检测方法的敏感度相当。本试纸条操作简便、快速、IO分钟内可获得结果；而用ELISA检测，从加入待检血清到判定结果至少需2小时。7胶体金免疫层析试纸条的稳定性检测
将试纸条置于干燥器内，4'C密封干燥保存，每隔30d抽取一批，与新制备的试纸条平行检测阳性和阴性鼠血清样本，比较两者的检测结果。胶体金试纸条在4'C干燥保存6个月后，与新制备的试纸条对比检测阳性和阴性鼠血清，特异性和敏感性均没有发现降低，说明本试纸条具有良好的稳定性。
权利要求
1、一种大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)O157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条，由颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG制成胶体金垫、分别用O157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG包被的硝酸纤维素膜作为检测线和质控线、玻璃纤维素膜制成的样品吸收垫、吸水滤纸制成的吸收垫组装成的检测试纸条、阳性血清、阴性血清、血清样品稀释液和试纸条使用说明书组成。
2、 根据权利要求1所述的检测试纸条，其制备方法为1) 大肠杆菌0157:H7抗原的制备培养大肠杆菌0157:H7， 3500 r/min离心30min，用PBS重悬，0.5%甲醛灭活， PBS洗3次，沉淀重悬于PBS， .20'C冻存备用；2) 免疫胶体金的制备取20nm颗粒胶体金溶液，加入已纯化的羊抗鼠IgG，在室温下搅拌30min，加 质量体积比10°/。牛血清白蛋白BSA使其终浓度为质量体积比0.4%，室温搅拌5min, 加质量体积比10。/。PEG使PEG终浓度为质量体积比0.2。/。，室温搅拌5min; 12000 r/min 离心45min，吸取离心上清，沉淀溶于2ml保存液中，用0.45nm滤膜过滤，置4'C保 存备用，制得胶体金标记抗体原液；3) 金标抗体玻璃纤维素膜的制备取胶体金标记抗体原液lml，加入工作液2ml稀释，混匀，均匀地加在玻璃纤维 素膜上，制成金标抗体玻璃纤维素膜，即胶体金垫，37'C干燥，4。C保存备用；4) 固相硝酸纤维素膜NC的制备用0.01M pH7.2的PBS分别稀释大肠杆菌0157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG， 用蛋白浓度为2.0 mg/ml大肠杆菌0157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG点样于NC膜上 分别作为检测线和质控线，室温干燥，封闭，层析试验背景清晰；5) 试纸条的组装在宽2X长9cmPVC底板上(1)，中间段粘贴宽2X长3cm固相硝酸纤维素膜， 即NC膜(2);靠近固相纤维素膜检测线T线一端的PVC底板表面粘贴2X2cm的胶 体金-羊抗鼠IgG抗体结合物玻璃纤维膜(.5)，此玻璃纤维素膜与NC膜(2)重叠O.lcm, 另一端与2Xlcm的样品吸收垫(7)重叠0.2cm;靠近固相纤维素膜质控线C线一端 的PVC底板表面黏贴2X3.5cm的吸水纸(6)，与NC膜重叠0.1cm;抗体固相硝酸 纤维素膜NC膜(2)上划有一条大肠杆菌0157:H7抗原检测线T线(3)和一条鼠血 清IgG质控线C线(4)。T线划在长3cmX宽2cm NC膜一侧lcm的位置上，将浓度为2.0mg/mL的大肠 杆菌0157:H7抗原装入划膜机，喷涂于NC膜上，另一喷头划质控线C线，浓度为 2.0mg/mL的鼠血清IgG, C线划在NC膜另一侧lcm的位置上，检测线与质控线的 距离为lcm，点样量均为5pl喷在硝酸纤维膜上，组装好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为2.5mm的条状，即为抗体检测试纸条成品。
3、 权利要求1或2所述的检测试纸条的用法，其特征在于 在检测抗体时，将待检鼠血清样本用含多联菌免疫兔血清的样品稀释液稀释100倍，取200nl滴加于试纸条的反应区，若在检测线处和质控线处均出现红色条带，表 明待检血清样本中含有大肠杆菌0157:H7抗体，判为阳性；若仅在质控线处出现红色 条带，表明待检样品中不含大肠杆菌0157:H7抗体，则判为阴性；若质控线不出现红 色条带，不论检测线是否出现红色条带，均表示实验失败或试纸条失效。
4、 根据权利要求3所述检测试纸睾的用法，其特征在于使用含体积比2%多 联菌免疫兔血清的0.01MpH7.2的PBS溶液稀释受试鼠血清样本。
全文摘要
本发明涉及一种大肠杆菌O157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条，属于抗体检测试剂盒技术领域。由颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG制成胶体金垫、分别用大肠杆菌O157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG包被的硝酸纤维素膜作为检测线和质控线、玻璃纤维素膜制成的样品吸收垫、吸水滤纸制成的吸收垫组装成的检测试纸条、阳性血清、阴性血清、血清样品稀释液和试纸条使用说明书组成。该试纸条使用简便、快速、敏感，10分钟内即可获得检测结果，适用于在动物养殖场、食品生产企业等地区调查与追溯鼠O157:H7感染状况时的现场检测以及在开展食品安全环境风险评估时使用。
文档编号G01N33/569GK101666799SQ200910181759
公开日2010年3月10日 申请日期2009年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者何孔旺, 洁 刘, 夏兴霞, 张雪寒, 王永山, 费荣梅 申请人:江苏省农业科学院