专利名称：一种氯霉素的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法
技术领域：
一种氯霉素的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于光激化学
发光免疫分析(LICLIA)技术领域，用于食品中CAP含量的检测。
背景技术：
氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是一种廉价高效的广谱抗生素，对革兰氏阳 性和阴性细菌都有很好的抑制作用，因此一度被广泛应用于农牧业中。但是动 物源性食品随着食物链被人体长期摄入，可引发多种疾病。轻者破坏人体内正 常菌群的平衡状态，菌群失调，使人体产生耐药菌珠，给今后患病使用抗生素 治疗带来不良影响；抗生素过敏体质的人会出现过敏反应，危及健康。严重时 可千扰骨髓细胞蛋白质的合成，并抑制幼稚细胞DNA合成，导致粒细胞减少， 引发再生障碍性贫血、溶血、紫癜等恶性疾病。
鉴于CAP的毒副作用，国际食品学界将其列为禁药，欧盟、美国等均在法 规中规定CAP残留限量标准为"零容许量"(Zerotolerance)，即不得检出，根 据欧盟"2002/657/EC"标准规定，动物源性食物中CAP的最小要求检出极限是 0.3pg/kg。不久美国FDA也做出相应的规定。我国农业部规定了CAP在所有食 品动物的可食用组织中不得检出，并将其从《中国兽药典》中删除，列为禁药。 并相应制定了 SN0219-93和SCT3018-2004行业标准，与国际接轨。
为适应更高的检测标准，检测技术水平必须相应的提高，近十年CAP检测 技术一直是国际专家学者研究的热门项目之一。CAP的检测方法分为物理化学 法和免疫化学法，前者有液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法 (MS)等，后者主要是酶免法(ELISA)，检测的灵敏度均达到ppb (Kig/kg)级 别。当前主流的检测方法是LC——我国行业标准所使用的方法，以及ELISA。 近几年，国内外学者又研发出液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱电 喷雾电离质谱法(LC-EITMS)、微生物分析等物理检测新方法，对ELISA方法的 应用也有了进一步研究。
光激化学发光免疫分析(LICLIA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一代 化学发光免疫技术，又称为AlphaLISA分析法，该项技术将被广泛地应用于研 究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术，它 具有快速、均相(免洗)、高灵敏、量程宽和操作简便的特点。LICLIA试剂由 含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约 188nm，表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增 加了反应的表面积，每个微粒表面覆盖成百上千个生物分子，可捕获目标分子。
LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680 nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存 时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200 nm)。当发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520 nm-620nm)。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回 落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是 LICLIA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微 粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微 粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受 体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测CAP的试剂盒及其检测方法，用于对蜂蜜 等产品中CAP含量的检测。
本发明主要采用光激化学发光免疫分析法(LICLIA)检测CAP。其技术方 案 一种氯霉素CAP的光激化学发光免疫分析试剂盒，由(l)白色不透明微孔板， (2)CAP标准品，(3)包被有CAP-OVA的发光微粒，(4)兔抗CAP的抗体冻干品， (5)生物素化羊抗兔抗体冻干品和(6)包被有链霉亲和素的感光微粒六件物品组 成。
包被有CAP-OVA的发光微粒(3)的制备在离心管中加入lmg发光微粒， 加入12.5 1% Tween-20， 0.05 mg CAP-OVA人工抗原，10pL硼氢化氰钠， 用0.1M、 pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将体积补充到20(VL， 37。C避光振 荡反应48小时，加入10pL0.3M、 pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液封闭未结 合位点，37"C避光孵育1小时，离心纯化，洗去未反应的试剂后，分离得到包 被有CAP-OVA的发光微粒，稀释后备用。
CAP标准品(2)，从CAP纯品中稀释得到，稀释液为含有质量浓度10%甲醇 的0.05 mmol/L、 pH 7.4的PBS, CAP标准品的CAP浓度分别为0 ng/mL， 0.02 ng/mL， 0.1 ng/mL，1 ng/mL， 10ng/mL， 25 ng/mL。
用所述的试剂盒检测CAP的方法，测定的基础是标记免疫反应。顺次向白 色不透明微孔板中加入包被有CAP-OVA的发光微粒，CAP标准品或处理好的 被测样品，兔抗CAP抗体及生物素化羊抗兔抗体进行免疫反应；接着加入包被 有链霉亲和素的感光微粒进行反应后检测光信号，以加入CAP标准品的检测值 绘制标准曲线，以加入被测样品的检测值从标准曲线计算被测样品的CAP含量。
所述的检测CAP的方法，其操作为取包被有CAP-OVA的发光微粒，CAP
5标准品或处理好的被测样品、 一定浓度的兔抗CAP抗体和生物素化羊抗兔抗体 共四种试剂各20^iL加到白色不透明微孔板，37。C孵育20分钟；加入175pL包 被有链霉亲和素的感光微粒，37X:孵育10分钟；在光激化学发光检测仪上检测 光信号，从标准曲线计算出被测样品中的CAP含量。 所述的检测CAP的方法，其样品处理
蜂蜜样品处理2g样品与4mL蒸馏水充分混合，加入4mL乙酸乙酯，加 塞震荡10min， 3000g离心10min;取2mL上清到干净玻璃管，5(TC温和氮流蒸 干，残留物充分溶解于lmL稀释标准品用的稀释液待测；
鸡蛋样品处理3g样品均质后，加入6mL乙酸乙酯，震荡10min， 3000g 离心10min;取2mL上清液到干净玻璃管，50。C温和氮流蒸干，用lmL正己垸 溶解干燥的残留物，加入lmL稀释标准品用的稀释液充分混合，3000g离心 10min;吸取下层水相用于检测；
牛奶样品处理5mL牛奶样品，2000rpm离心15min,取2.5mL下层脱脂 奶与5mL乙酸乙酯充分混合，震荡10min，再静置5 10min;转移4mL上层溶 液到干净玻璃管中，温和氮流蒸干；残留物溶解于200pL稀释标准品用的稀释 液，待测。
本发明的有益效果该检测试剂盒结构简单，操作简便、检测时间短、灵 敏度高。
图l检测CAP的试剂盒示意图。1、白色不透明微孔板，2、 CAP标准品， 3、包被有CAP-OVA的发光微粒，4、兔抗CAP的抗体冻干品，5、生物素化羊 抗兔抗体冻干品，6、包被有链霉亲和素的感光微粒。
图2 CAP- LICLIA反应示意图。
图3 CAP- LICLIA标准曲线图。
具体实施例方式
实施例1制备试剂盒
包被有C AP-OVA的发光微粒制备
在离心管中加入lmg发光微粒，加入12.5 jiL 1% Tween-20， 0.05 mg CAP-OVA人工抗原，10^iL硼氢化氰钠，用0.1M、 pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸 (MES)缓冲液将体积补充到20(VL，37。C避光振荡反应48小时。加入10pL 0.3 M、 pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37-C避光孵育1 小时后离心，分离得到已包被有CAP-OVA的发光微粒，稀释后备用。
CAP标准品试剂的配制(Ong/mL， 0.02 ng/mL， 0.1 ng/mL， 1 ng/mL， 10 ng/mL， 25 ng/mL)，从CAP纯品中稀释得到，稀释液为含有10%甲醇的PBS(0.05 腿ol/L、 pH7.4)。试剂盒的组成
(1) 、白色不透明微孔板(12条X8孔，可以拆分为单孔)。
(2) 、 1X包被有CAP-0VA的发光微粒2mL。
(3) 、 6XCAP标准品，1.0mL/瓶，标准品CAP浓度为0， 0.02， 0.1， 1， 10， 25ng/mL。
(4) 、 1X兔抗CAP抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。
(5) 、 1X生物素化羊抗兔抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。
(6) 、 1X包被有链霉亲和素的感光微粒20mL。 测定时注意事项
1. 使用之前将所有试剂回升至室温(18-3(TC)。
2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8°C。
3. 在所有恒温孵育过程中避免光线照射。 实施例2:检测蜂蜜、鸡蛋、牛奶样品 样品处理
蜂蜜样品处理2g样品与4mL蒸馏水充分混合，加入4mL乙酸乙酯，加 塞震荡10min, 3000g离心10min。取2mL上清到干净玻璃管，50。C温和氮流蒸 干，残留物充分溶解于lmL标准品稀释液，备用。
鸡蛋样品处理3g样品均质后，加入6mL乙酸乙酯，震荡10min， 3000g 离心10min。取2mL上清液到干净玻璃管，5(TC温和氮流蒸干，用lmL正己垸 溶解干燥的残留物，加入lmL标准品稀释液充分混合。3000g离心10min。吸 取下层水相用于检测。
牛奶样品处理5mL样品，2000rpm离心15min，取2.5mL下层脱脂奶与 5mL乙酸乙酯充分混合，震荡10min，再静置5-10min。转移4mL上层溶液到 干净玻璃管中，温和氮流蒸干。残留物溶解于200nL标准品稀释液，待测。
取包被有CAP-OVA发光微粒、CAP标准品或处理好的样品、 一定浓度的 兔抗CAP抗体和生物素化羊抗兔抗体共四种试剂各20pL加到白色不透明微孔 板，37'C孵育20分钟；加入175pL包被有链霉亲和素的感光微粒，37'C孵育 10分钟;在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线测算出样品中的CAP 含量。结果见表l，由标准曲线求得该例蜂蜜、鸡蛋、牛奶样品所含CAP浓度 分别为0.748、 0.334、 0.017ng/mL。
表l
标准品蜂蜜样品鸡蛋样品牛奶样品
荧光值(cps) 38909 CAP浓度(ng/mL) 035887 33672 21145 7352 0.02 0.11 104306 23100 25 0.74828176 0.33435969 0.01权利要求
1、一种氯霉素CAP的光激化学发光免疫分析试剂盒，其特征是由(1)白色不透明微孔板，(2)CAP标准品，(3)包被有CAP-OVA的发光微粒，(4)兔抗CAP的抗体冻干品，(5)生物素化羊抗兔抗体冻干品和(6)包被有链霉亲和素的感光微粒六件物品组成。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是包被有CAP-OVA的发光微粒 (3)的制备在离心管中加入lmg发光微粒，加入12.5 |iL l%Tween-20， 0.05 mg CAP-OVA人工抗原，l(HiL硼氢化氰钠，用0.1M、 pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸 缓冲液将体积补充到200nL， 37r避光振荡反应48小时，加入10pL0.3M、 pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液封闭未结合位点，37。C避光孵育l小时，离心纯 化，洗去未反应的试剂后，分离得到包被有CAP-OVA的发光微粒，稀释后备用。
3、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是CAP标准品(2)，从CAP纯品 中稀释得到，稀释液为含有质量浓度10。/。甲醇的0.05mmol/L、 pH7.4的PBS， CAP标准品的CAP浓度分别为Ong/mL， 0.02 ng/mL， 0.1 ng/mL， 1 ng/mL， 10 ng/mL， 25 ng/mL。
4、 一种用权利要求1所述的试剂盒检测CAP的方法，其特征是顺次向白 色不透明微孔板中加入包被有CAP-OVA的发光微粒，CAP标准品或处理好的 被测样品，兔抗CAP抗体及生物素化羊抗兔抗体进行免疫反应；接着加入包被 有链霉亲和素的感光微粒进行反应后检测光信号，以加入CAP标准品的检测值 绘制标准曲线，以加入被测样品的检测值从标准曲线计算被测样品中的CAP含 量。
5、 根据权利要求4所述的检测CAP的方法，其特征是操作为取包被有 CAP-OVA的发光微粒，CAP标准品或处理好的被测样品、 一定浓度的兔抗CAP 抗体和生物素化羊抗兔抗体共四种试剂各20pL加到白色不透明微孔板，37。C孵 育20分钟；加入175pL包被有链霉亲和素的感光微粒，37。C孵育10分钟；在 光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算出被测样品中的CAP含量。
6、 根据权利要求4或5所述的检测CAP的方法，其特征是样品处理 蜂蜜样品处理2g样品与4mL蒸馏水充分混合，加入4mL乙酸乙酯，加塞震荡10min， 3000g离心10min;取2mL上清到干净玻璃管，5(TC温和氮流蒸 干，残留物充分溶解于lmL稀释标准品用的稀释液待测；鸡蛋样品处理3g样品均质后，加入6mL乙酸乙酯，震荡10min， 3000g 离心10min;取2mL上清液到干净玻璃管，50'C温和氮流蒸干，用lmL正己烷 溶解干燥的残留物，加入lmL稀释标准品用的稀释液充分混合，3000g离心 10min;吸取下层水相用于检测；牛奶样品处理5mL牛奶样品，2000rpm离心15min，取2.5mL下层脱脂 奶与5mL乙酸乙酯充分混合，震荡10min，再静置5-10min;转移4mL上层溶 液到干净玻璃管中，温和氮流蒸干；残留物溶解于20(HiL稀释标准品用的稀释 液，待测。
全文摘要
一种氯霉素(CAP)的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于光激化学发光免疫分析技术领域。向不透明白色微孔板顺序加入包被有CAP-OVA的发光微粒、CAP标准品或待测样品、兔抗CAP抗体及生物素化羊抗兔抗体，避光反应，再加入包被有链霉亲和素的感光微粒，孵育后检测。发光微粒上的CAP-OVA与游离CAP竞争连接到CAP抗体，再与生物素化羊抗兔抗体及包被链霉亲和素的感光微粒形成复合体，在红光激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，用光激化学发光检测仪检测，光信号强度与样品中CAP浓度成反比，对照标准曲线测得样品中CAP含量。本发明用于蜂蜜、牛奶、鸡蛋等食品中CAP含量的检测，试剂盒结构简单，检测时间短、灵敏度高、操作简便。
文档编号G01N1/28GK101603961SQ20091018228
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月7日 优先权日2009年7月7日
发明者彬 周, 珏 张, 艺 张, 赵卫国, 坚 金, 飚 黄 申请人:江苏省原子医学研究所