专利名称：泌乳素化学发光定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域，具体涉及一种用于泌乳素 (PRL)化学发光定量检测试剂盒及相关制备方法和使用方式。
背景技术：
人泌乳素(prolactin，PRL)是由199个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量为22kD， 其分子序列92%与hGH相同。成年人血中PRL浓度低于20μβ/1，半衰期约20min。PRL及 其受体在垂体外组织也有广泛分布。PRL的分泌受下丘脑PRF与PIF的双重调节，前者促进 PRL分泌，而后者则抑制其分泌。除PRF，TRH、VIP、甘丙肽等都具有促进PRL分泌的作用， 雌激素可通过刺激PRL细胞增殖和基因表达等环节影响PRL释放。而甲状腺激素则可抑制 PRL基因表达。PRL可促进乳腺发育，发动并维持乳腺泌乳。但在女性一生的不同时期，其作用有 所不同。在女性青春期乳腺发育中，生长激素、雌激素、孕激素、糖皮质激素、甲状腺激素和 PRL协同作用。在妊娠期，随着PRL、雌激素和孕激素分泌增多，使乳腺组织进一步发育，但 此时血中雌激素和孕激素水平很高，可抑制PRL的泌乳作用，故乳腺虽已具备泌乳能力却 不泌乳。分娩时，乳腺PRL受体可增加20倍左右。分娩后，血中雌激素和孕激素水平明显 降低，PRL才发挥其始动和维持泌乳的作用。PRL还可促进乳汁成分中酪蛋白、乳糖和脂肪 等重要成分的合成。PRL对性腺也有调节能力，且作用比较复杂。小剂量应用PRL对卵巢雌激素和孕激 素的合成有促进作用，但大剂量则有抑制作用。PRL对卵巢黄体功能的影响主要是刺激LH 受体的生成，调控卵巢内LH受体的数量，同时还可促进脂蛋白与膜上受体形成脂蛋白受体 复合物，为孕酮生成提供底物，促进孕酮生成，减少孕酮分解。患闭经溢乳综合征的妇女表 现为闭经、溢乳与不孕。这些症状因高催乳素血症所致，而高浓度的PRL可通过负反馈方式 抑制下丘脑&iRH的分泌，减少腺垂体FSH和LH的分泌，致使患者出现无排卵和雌激素水平 低下的情况。用溴隐亭治疗后即可恢复。在男性，PRL可维持和增加睾丸间质细胞LH受体 的数量，提高睾丸间质细胞对LH的敏感性，促进雄性性成熟。高催乳素血症时性兴奋减弱。PRL的作用十分广泛，除对乳腺、性腺发育和分泌起重要作用外，还参与对应激反 应和免疫的调节。PRL浓度的测定有助于下丘脑-垂体功能障碍的诊断，异常增高时应考虑垂体催 乳素瘤，需进一步检查。PRL兴奋或抑制试验可以区别PRL增高是由于下丘脑、垂体功能失 调，还是由于垂体肿瘤。高PRL水平一般与溢乳及闭经相关，闭经、不孕及月经失调者，无论 有无泌乳，均应测PRL，以除外高催乳激素血症。PRL水平升高还见于性早熟、原发性甲状腺 功能低下、卵巢早衰、黄体功能欠佳、长期哺乳、神经精神刺激、某些药物作用如氯丙嗪、避 孕药、大量雌激素、利血平等抗高血压药等因素均可引起PRL升高；PRL降低多见于垂体功 能减退、单纯性催乳激素分泌缺乏症。化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay, CLIA)于 1977 年问世，1985年第一代化学发光免疫试剂盒研制成功并投放市场。上世纪70年代中期Arakawe首 次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临 床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医 学的常规检测手段。化学发光免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合， 用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA)和 酶免疫(EIA)相似，不同之处是以发光物质作为底物，并藉助其自身的发光强度直接进行 测定。化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免 疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测 定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们 有各自的发光底物。HRP常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰胼，luminol)或其衍生 物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰胼)等，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧 化物酶及活性氧的存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。发光 强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光基本上为闪 光型且信号弱，通过加入某些特殊的增强剂可增强发光的信号并可大大延长发光的持续时 间。化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度(检测限度可达10_15 10_18mol/ L)，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作，且测试中不使用有害的试 剂。试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析 法中最有前途的方法之一。但是，国外的自动化学发光酶免疫分析仪及与之相匹配的试剂 盒多采用封闭体系配合使用，价格昂贵，操作复杂，在国内不易推广。
发明内容
本发明将化学发光技术与免疫分析技术相结合，提供了一种能够定量检测PRL的
试齐U盒。本发明技术方案如下一种泌乳素化学发光定量检测试剂盒，包括反应板，酶结合物，发光底物，校准品， 质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有泌乳素抗体。所述的校准品以泌乳素纯品配制，浓度优选为0、5、20、50、100、200ng/ml。所述的质控品以泌乳素纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I 的浓度为3-50ng/ml，质控品II的浓度为55_190ng/ml。所述的质控品I的浓度优选为9. ^ng/ml，质控品II的浓度优选为24. 83ng/ml。所述的酶结合物为HRP标记的泌乳素抗体，所述的反应板材质是不透明的聚苯 乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是 pH7. 0-pH8. 0的中性缓冲液。本发明提供的试剂盒具有开放性系统，可以应用于多种不同公司的化学发光检测 仪器，无需昂贵的专用配套仪器，并具有简便，快速，稳定的检测能力，易于在国内市场推
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 :PRL化学发光定量检测试剂盒的制备(1)抗PRL的抗体包被板制备a.包被取 lmol/L Na2HPO4 77. 4ml 和 lmol/L NaH2PO4 22. 6ml 混勻，加入去离子 水定容至IOOOml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量PRL单抗(购买自Meridian lifescience)混勻，然后加入到微孔板板孔中，100 μ 1/孔，4°C 16小时；b.封闭弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3% BSA和0.05%防腐剂 (Procl in 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4), 200 μ 1/ 孔，37°C 2 小时；c.封袋弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进 行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2-8°C保存。(2)酶标记物的制备用含有2. 5% BSA、1. 5%的脱脂奶粉和0. 05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐 缓冲液(pH 7.4)配制缓冲系统。PRL抗体(购买自Meridian lifescience)用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶 交联。(3) PRL校准品的制备用含有3% BSA和0. 05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)配制 缓冲系统。用PRL纯品配制校准品工作液(PRL纯品购买自Meridian lifescience)，分别 为 0、5、20、50、100、200ng/ml 共 6 个浓度。G) PRL质控品的制备小牛血清与去离子水6 4混合，并添加0. 05%防腐剂(Proclin 300)，配制成 质控品缓冲液。用PRL纯品制备质控品工作液(PRL纯品购买自Meridian lifescience)分装 9.28、24. 83ng/ml。(5)化学发光底物液的制备使用 PIERCE 公司的Supedignar ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate
作为配套检测液。A液、B液各1瓶。(6) 20 X浓缩洗涤液制备取NaCl 170g吐温-20 IOml加水定容至IL即成，临用前稀释20倍。(7)半成品及成品组成上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品，成品还需 抽检，合格后才能出厂。实施例2 泌乳素(PRL)定量检测试剂盒的使用方法1.试剂和样本准备(1)试剂准备
a.将试剂盒置室温(1846°C )平衡20分钟。b.从试剂盒中取出浓缩洗涤液，用新鲜的纯化水1 20稀释后加入洗板机的洗液 瓶中。(2)样本准备使用前将待测的合格血清或血浆置室温(1846°C )平衡20分钟。2.操作步骤a.取出所需的PRL抗体包被微孔板置于微孔架上b.加入校准品1-6、质控品1-2和待测样本，每孔25 μ 1。c.加入酶标记物100 μ 1/孔。d.轻柔震荡混勻。e.室温孵育30分钟。f.弃去孔内废液。手工洗涤弃去孔内液体，洗涤液注满各孔、静置5秒，甩干，重复5次后拍干；洗板机洗涤每孔350 μ 1，重复4次，洗涤后拍干。g.加发光底物A、B每孔各50μ 1，充分混勻，立刻加入化学发光仪中检测信号值。3.实验结果的计算可以采用作图法或计算法进行结果计算作图法以标准品抗原含量的Ig值为横坐标⑴，以其对应的信号值为纵坐标⑴ 绘制出标准曲线，然后根据检测样本测得的信号值在标准曲线上查出相应的抗原含量Ig 值，再计算出抗原含量。计算法以标准品抗原含量的Ig值为自变量(X)，以其对应的信号值为因变量 (Y)，求出回归方程，将待测标本的信号值带入回归方程，求得相应的抗原含量。
权利要求
1.一种泌乳素化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括反应板，酶结合物，发光底 物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被抗泌乳素抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的校准品以泌乳素纯品配制，浓度为 0、5、20、50、100、200ng/ml。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品以泌乳素纯品配制，由质控 品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为3-50ng/ml，质控品II的浓度为55-190ng/ ml ο
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品I的浓度为9.^ng/ml，质 控品II的浓度为24. 83ng/ml
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为HRP标记的泌乳素抗 体，所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺 或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7. 0-pH8. 0的中性缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种泌乳素化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒包括泌乳素检测反应板，反应板包被有泌乳素抗体。泌乳素定量检测试剂盒，还包括酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液。本发明可以专一的定量检测出病人血清泌乳素的含量，用于辅助诊断垂体肿瘤、高催乳素血症、性早熟、原发性甲状腺功能低下、卵巢早衰、黄体功能欠佳、单纯性催乳激素分泌缺乏症等疾病。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。
文档编号G01N33/53GK102095721SQ200910200388
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者汪宁梅, 王通, 穆宇豪, 穆海东 申请人:上海裕隆生物科技有限公司