专利名称：SYBR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于体外核酸检测领域，在临床样本中检测沙眼衣原体感染的荧光 PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。
背景技术：
沙眼衣原体(chlamydia trachomatis, CT)为革兰氏阴性病原体，没有合成高能 化合物ATP的能力，必须由宿主细胞提供，因而是能量寄生物。衣原体是一类能通过细胞滤 器，有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，比病毒大，比细菌小，呈球形， 直径只有0. 3 0. 5mm。CT是重要的性传播疾病的病原体之一，它不仅会导致阴道、尿道感 染；上行的生殖道感染还可能累及子宫内膜、输卵管和邻近的盆腔结构，导致盆腔炎、输卵 管损伤直至不孕。此外，此种病原体还与人乳头瘤病毒(HPV)和人免疫缺陷病毒(HIV)的 感染有关。沙眼衣原体有独特发育周期，它的生长发育周期分两个阶段①原体(elementary body)，是发育周期的感染阶段，外有包壁，具感染力；②始体，又称网状体(initial body), 是在感染细胞内的繁殖阶段，无包壁，无感染性，具增殖力。原体(约0.3 μ m)与易感细胞 接触后通过吞饮作用进入细胞，形成空泡称为包涵体，包涵体外膜来自于感染细胞时的浆 细胞膜。此时结构致密的原体逐渐发育成结构疏松的始体(约1 μ m)，开始了 RNA与DNA的 合成并以二分裂方式开始增殖，经过M 7 增殖始体重新形成原体，包涵体溶解，细胞释 放出原体。沙眼衣原体引发的病变主要有沙眼由衣原体沙眼生物变种A、B、Ba、C血清型引起。主要经直接或间接接触传 播，即眼-眼或眼-手-眼的途经传播。当沙眼衣原体感染眼结膜上皮细胞后，在其中增殖 并在胞浆内形成散在型、帽型、桑椹型或填塞型包涵体。该病发病缓慢，早期出现眼睑结膜 急性或亚急性炎症，表现流泪、有粘液脓性分泌物、结膜充血等症状与体征。后期移行为慢 性，出现结膜瘢痕、眼睑内翻、倒睫、角膜血管翳引起的角膜损害，以致影响视力，最后导致 失明。据统计沙眼居致盲病因的首位。1956年中国学者汤飞凡等人用鸡胚卵黄囊接种法， 在世界上首次成功地分离出沙眼衣原体，从而促进了有关原体的研究。包涵体包膜炎由沙眼生物变种D-K血清型引起。包括婴儿及成人两种。前者系 婴儿经产道感染，引起急性化脓性结膜炎(包涵体脓漏眼)，不侵犯角膜，能自愈。成人感染 可因两性接触，经手至眼的的途径或者来自污染的游泳池水，引起滤泡性结膜炎又称游泳 池结膜炎。病变类似沙眼，但不出现角膜血管翳，亦无结膜瘢痕形成，一般经数周或数月痊 愈，无后遗症。泌尿生殖道感染经性接触传播，由沙眼生物变种D-K血清型引起。男性多表现为 尿道炎，不经治疗可缓解，但多数转变成慢性，周期性加重，并可合并副睾炎、直肠炎等。女 性能引起尿道炎、宫颈炎等，输卵管炎是较严重并发症。该血清型有时也能引起沙眼衣原体 性肺炎。
性病淋巴肉芽肿由沙眼衣原体LGV生物变种引起。LGV要通过两性接触传播，是 一种性病。男性侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。女性可侵犯 会阴、肛门、直肠，出现会阴，肛门，直肠组织狭窄。目前沙眼衣原体的培养检查法是经典的检查方法，但由于需要特殊的设备及试剂 且实验方法复杂，技术要求高，费时且费用较高而并不适合临床应用。目前检测衣原体技术 发展很快，方法日渐增多。检测抗原的有改良荧光检测法，金标男女两用衣原体快速检测试 剂盒，分子生物学技术应用于检测衣原体的方法更是日新月异，(1)连接酶链反应(LCR)， (2)转录介导的扩增试验(TMA), (3)酶放大免疫反应(PCE)，(4)聚合酶链反应(PCR)，(5) 半巢式聚合酶链反应-微空板杂交法，(6)巢式聚合酶链反应，(7)实时荧光聚合酶链反应 定量检测。荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA 杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普 通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 PCR产物污染的风险。荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针，SYBR Green法等，本方法涉及的是STOR技术。其工作原理是Green是一种结合于小沟中 的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物 的检测非常理想。STOR Green的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在 PCR反应体系中，加入过量STOR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧 光信号，而不掺入链中的STOR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加 与PCR产物的增加完全同步。
发明内容
为克服传统方法对CT检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成本低的检测产 品。本发明技术方案如下一种STOR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒，包括阴性参考品、阳 性对照品、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR 分型引物。所述的阳性对照品为含有插入沙眼衣原体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插 入的特异序列如下GACAGGGACT AAGGATGCCT CTATTGACTA CCATGAGTGG CAAGCAAGTT TAGCCCTTTC TTACAGATTAAATATGTTCA CTCCTTACAT TGGAGTTAAA TGGTCTAGAG TAAGTTTTGA TGCCGACAOG ATC0GTATCGCTCAGCCTAA ATTGGCTGAA GCAATCTTGG ATGTCACTAC TCTAAACCCG ACCATCGCTG GTAAAGGAACTGTGGTCGCT TCCGGAAGCG AAAACGACCT GGCTGATAC249bp所述的阳性对照品重组质粒的扩增结果循环值小于30. 0。所述的阴性参考品为沙眼衣原体阴性血清。所述的PCR分型引物序列如下扩增检测沙眼衣原体的正向引物GACAGGGACTMGGATGCCTCTAT 24;扩增检测沙眼衣原体的反向引物GTATCAGCCAGGTCGTTTTCG21。
所述的荧光PCR反应液加入了 SBRY Green的荧光染料。如此可以通过荧光信号 的收集判断有无沙眼衣原体的存在。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果①具有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直 观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶 电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 PCR产物污染的风险；②STOR Green与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设 计的程序通用性好，且价格相对较低；③利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增 产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定；④检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时，操作步骤简单；⑤可同时进行高通量的样本检测。 总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在 两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取 代传统细胞检测或者普通PCR检测进行CT的早期诊断。
图为临床样本的CT荧光PCR扩增曲线。
具体实施例方式应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员 常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂 商所建议的步骤和条件。实施例1 试剂盒的制备1.引物设计与合成使用I^rimer premier5. 0，针对CT的外膜主蛋白基因(研究表明外膜主蛋白基因 的特异性极好)，设计上下游引物。引物委托专业公司(生工)合成，其中引物为PAGE纯 化。扩增序列如表1 表1.特异性引物序列
序列名称寡核苷酸序列(5’ -3’)碱基长度(bp)CT正向引物CCATGAGTGGCAAGCAAGTTTAGC24CT反向引物CAGCGATGGTCGGGTTTAGAG212. CT质粒阳性参考品的制备本实施例中CT质粒作为阳性模板用于阳性对照品。根据步骤1中合成的扩增CT特异性序列的引物，在整个外膜蛋白基因的序列中选 取一段覆盖设计引物的序列进行分片段合成，然后将合成好的片段序列进行拼接，拼接好 的序列经过纯化连接到PGEM-Teasy载体(购自TAKARA)上；然后转化至大肠杆菌JM109感 受态细胞(购自TAKARA)中；通过蓝白斑筛选，构建CT的重组质粒DNA作为阳性参考品。构 建的CT重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释到2. OX 101°拷贝/微升于-20°C保存。3.对照品选择使用无CT血清为阴性对照；CT重组质粒QX IO6拷贝/微升)为 阳性对照。4.荧光PCR反应液组成表2. PCR反应液组成
原料名称终浓度PCR Buffer(0. 8-2) XMgCl22-5mMdNTP0. 1-0. 5mMCT引物0. 1-0. 50 μ MSYBR Green0. 1-0. 50 μ MTaq酶0. 5-3UH2O适量DNA模版2μ L总体积20 μ L实施例2 试剂盒的使用1.样本提取使用DNA提取液提取待测样品中的CT病毒核酸1)样本前处理拭净宫颈口过多的分泌物，用生理盐水浸润的棉拭子紧贴宫颈口 粘膜稍用力转动2周以取得分泌物和脱落细胞，将取样后的棉拭子放入备有Iml无菌生理 盐水的EP管中充分漂洗，贴壁挤干。碱裂解法提取CT病毒。裂解液配方:60mmol/LTrisHCl, pH 8. 0 ；0. 5% SDS ；200mmol/L NaCl ；2)操作步骤取500 μ 1分泌物混勻于13000rpm离心lOmin，弃上清；加50 μ 1裂 解液，100°C保温20min, 13000rpm离心lmin，取上清1 μ 1做PCR反应。2. CT阳性对照品的准备将CT质粒阳性对照品用去离子水进行稀释，浓度为2. OX IO6拷贝/ml。3.样本检测分别取步骤1中提取的核酸，步骤2中获得的阳性对照品，作为DNA模板，加入到 荧光反应液中，组成PCR反应体系。反应体系如下表3.反应体系
PCR反应液19μ[
DNA模版1 μ
总体积20 μ 4.反应程序设置收集STOR荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪(ΑΒΙ7500)开 始扩增，反应程序如下表4. PCR反应程序
权利要求
1.一种STOR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括阴性 参考品、阳性对照品、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应 液包括PCR分型引物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品为含有插入沙眼衣原 体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插入的特异序列如下GACAGGGACT AAGGATGCCT CTATTGACTA CCATGAGTGG CAAGCAAGTT TAGCCCTTTC TTACAGATTAAATATGTTCA CTCCTTACAT TGGAGTTAAA TGGTCTAGAG TAAGTTTTGA TGCCGACACG ATCCGTATCGCTCAGCCTAA ATTGGCTGAA GCAATCTTGG ATGTCACTAC TCTAAACCCG ACCATCGCTG GTAAAGGAACTGTGGTCGCT TCCGGAAGCG AAAACGACCT GGCTGATAC249bp。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品重组质粒的扩增结 果循环数小于30.0。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的阴性参考品为沙眼衣原体阴性血清。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR分型引物序列如下 扩增检测沙眼衣原体的正向引物GACAGGGACTAAGGATGCCTCTAT 24 ； 扩增检测沙眼衣原体的反向引物GTATCAGCCAGGTCGTTTTCG21。
6.如权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光PCR反应液加入了SBRY Green的荧光染料。
全文摘要
本发明公开了一种SYBR Green法检测沙眼衣原体感染的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸诊断试剂盒领域。该试剂盒包括阴性参控品、阳性对照品、荧光聚合酶链式反应液、Taq酶和DNA提取液。本发明包括一个以荧光PCR技术为基础的PCR反应体系，包含针对沙眼衣原体特异序列的正、反向引物和荧光染料SYBR Green，可以简便快速地在临床样本中检测沙眼衣原体感染，特异性高，对沙眼衣原体的早期检出有很大的临床价值。
文档编号G01N21/64GK102094073SQ20091020039
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者汪宁梅, 穆宇豪, 穆海东, 黎飒 申请人:上海裕隆临床检验中心有限公司