专利名称：：一种检测伏马菌毒素b1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法
技术领域：
：—种检测伏马菌毒素Bl(FBI)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)
技术领域：
，用于对粮食，饲料以及食品中FBl含量的检
背景技术：
：伏马菌素(Fumonisins)是国际上于1988年首次报道的主要由串珠镰刀菌产生的一组新的真菌毒素，主要污染谷物，并在生长基质中繁殖代谢，产生多种真菌毒素。到目前为止，已发现有II种结构类似物，其中伏马毒素BJFB》是伏马菌毒素的主要组分，约占毒素总量的70%，是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。霉变玉米中总伏马菌毒素含量可高达52.670mg/kg。此外，大米、小麦、啤酒、牛奶等食品和饲料中也存在污染情况。伏马毒素可导致马脑白质软化症，猪肺水肿综合症，对其他多种动物也会造成毒性作用及诱发肿瘤；流行病学资料显示，人类膳食中FB工污染与食管癌高发有一定的关联。国际癌症研究中心已把FB划分到2B组，即人类可能致癌物。因此为了保障人们的健康，开展食品中FB工的卫生检测研究是很有必要的。人类接触伏马毒素是相当普遍的，但是在不同的玉米种植区有不同的接触程度。例如，尽管在美国、加拿大和西欧伏马毒素在玉米中同样发生，但在这些国家人们的消耗是适度的。在非洲的部分地区，中南美洲和亚洲，一些人消耗大量的玉米面作为能量来源，而这些地区的玉米污染伏马毒素是最高的。到目前为止，伏马毒素还没有一个广泛的限量标准。2001年，美国食品与药物管理局(FDA)发布了食品(2mg/kg)、动物饲料(150mg/kg)的FB1最高限量的指导性公告。欧盟相关的限量标准正在制定中。所以有必要积极开展高灵敏FBI的检测手段的研究，以保障我国人民的食品安全。目前伏马菌毒素Bl的测定方法有多种，如薄层色谱法TLC(灵敏度为500ng/g)，高效液相色谱法HPLC(灵敏度为80ng/g)，液质联用技术(灵敏度100ng/g)，但由于费时、灵敏度低、仪器设备昂贵、操作复杂且不适用于大批量样品检测等缺点，限制了其的推广应用。酶联免疫测定法ELISA(灵敏度为5ng/g)，由于特异性强灵敏度高、操作简便、不需直接接触毒素，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用，但检测的灵敏度和试剂的稳定性还难以达到要求。时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术。TRFIA原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成Eu3+标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancementsolution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的e-萘甲酰三氟丙酮(e-NTA)重新形成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。
发明内容本发明的目的在于提供一种检测FBI的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法，用于对粮食，饲料以及食品中FBI含量的检测。本发明的技术方案一种检测伏马菌毒素Bl，简称FB1，的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，该试剂盒是由1、包被有FB1-BSA的96或48孔包被板，2、缓冲液，3、FBI标准，4、FB1单克隆抗体冻干品，5、铕标记的羊抗鼠抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成。缓冲液(2):含8mmol/LNaC1、0.1%BSA、0.2%牛IgG、50iimol/L二乙烯三胺五乙酸、0.lmL/LTween-80禾P0.1%NaN3的pH7.8、50mmol/LTris—HCl溶液；6XFB1标准液(3):1.OmL/瓶，标准液浓度为0，1.0，10，100，500，1000ng/mL。洗涤液(6):含14.5mmol/LNaC1、0.2mL/LTween-80和0.2%NaN3的pH7.8、50mmol/LTris-HCl溶液。增强液(7):每升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15iimoll3-萘甲酰三氟丙酮，50iimol三正辛基氧化膦和lmL曲拉通X-IOO。本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测FB1。采用TRFIA的技术有FBl-BSA活性包被板的制备、Eu3+标记抗体的制备、FBl标准品的制备、增强液的制备。FB1-BSA活性包被板(1)的制备包被板包被固相抗原用pH9.6、50mmo1/LNa2C03_NaHC03缓冲液将OTA-BSA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100iiL，4t:放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150iiL含3g/LBSA的上述缓冲液封闭，4t:放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-2(TC冷冻保存。铕标记的羊抗鼠抗体(5)的制备取溶解于pH7.0、50mmol/LPBS的5g/L羊抗鼠抗体l-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为pH8.5-9.0、含0.155mol麵Cl的50mmol/LNa2C03-NaHC03缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2g/L，取500-1000yL稀释后的羊抗鼠抗体加入含O.2_0.4mg的Eu"-N2-[p-异氰酸_苄基]_二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30°C磁力搅拌反应16h，反应液经用pH7.8、80mmol/LTris-HCl缓冲液平衡的1X40cm的S印hadex-G50柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。测定方法测定的基础是标记免疫反应。包被有FB1-BSA的微孔板，加入FBI标准或已处理好的样品到各自的微孔中、再加入FB1单克隆抗体，振荡反应，游离的FB1与微孔板上的FB1-BSA竞争FB1单克隆抗体，洗涤液洗涤，没有连接的FB1单克隆抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的￡113+-羊抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的FBI浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中FBI的量。本发明的有益效果该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.05ng/mL以上。图1:检测伏马菌毒素B1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒示意图。1、包被有FB1-BSA的96或48孔包被板，2、缓冲液，3、FBI标准，4、FBI单克隆抗体冻干品，5、铕标记的羊抗鼠抗体，6、洗涤液，7、增强液。图2:FB1-TRFIA标准曲线图。具体实施例方式实施例l制备试剂盒和检测玉米样品试剂盒提供的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下(1).1X96孔板(8条X12孔，可以拆分为单孔)包被有FB1-BSA。(2).6XFB1标准液，1.0mL/瓶，标准液浓度为0，1.0，10，100，500，1000ng/mL。(3).IXFBI单克隆抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。(4).1XEu3+_羊抗鼠抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。(5).IX增强液15mL。(6).IX洗涤液30mL，用时以蒸馏水1:25稀释。(7).IX缓冲液30mL。实验室应自备的试剂甲醇。70%甲醇溶液30mL蒸馏水或去离子水和70mL纯甲醇混合制备70%甲醇溶液。蒸馏水或去离子水。测定之前注意事项1.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30°C)。2.使用之后立即将所有试剂放回2-8t:。3.如果样品量大建议使用多通道移液器。4.在所有恒温孵育过程中避免光线照射，用盖子盖住微孔。5.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8°C。具体检测步骤如下先将样品进行处理将玉米样品粉碎至20目，取5克粉碎后玉米样品放在试管中，加入提取液25mL(甲醇水=7:3)。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取lmL滤液用9mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。取FB1-BSA板条，加入50yL的FBI标准或处理好的样品到各自的微孔中，加缓冲液l:20稀释的FBl单克隆抗体50iiL，25t:振荡1小时，洗涤液洗3次，加缓冲液1:20稀释的Eu3+-羊抗鼠抗体100i！L，25t:振荡1小时，用洗涤液洗6次，加200yL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的FBI含量，见表l，该例的样品浓度为51.7ng/m"2585ng/g)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2试剂盒提供的试剂足够进行48个测量，其中盒中的包被板为1X48孔板(4条X12孔，可以拆分为单孔)包被有FB1-BSA。试剂盒提供的其余试剂与实施例l相同，用于检测小麦样品。具体检测步骤如下先将小麦样品进行处理将小麦样品粉碎至20目，取5克粉碎的小麦样品放在试管中，加入提取液25mL(甲醇水二7:3)。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取lmL滤液用9mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。取FB1-BSA板条，加入50yL的FBI标准或处理好的样品到各自的微孔中，加缓冲液l:20稀释的FBl单克隆抗体50iiL，25t:振荡1小时，洗涤液洗3次，加缓冲液1:20稀释的Eu3+-羊抗兔抗体100i！L，25t:振荡1小时，用洗涤液洗6次，加200yL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的FBI含量，见表2，该例的样品浓度为6.2ng/mL(310ng/g)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求一种检测伏马菌毒素B1，简称FB1，的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征是试剂盒由以下几个部分包被有FB1-BSA的96或48孔包被板(1)，缓冲液(2)，伏马菌毒素B1标准(3)，伏马菌毒素B1单克隆抗体冻干品(4)，铕标记的羊抗鼠抗体(5)，洗涤液(6)和增强液(7)所组成；FB1-BSA活性包被板(1)的制备包被板(1)包被固相抗原用pH9.6、50mmol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液将OTA-BSA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/LBSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存；缓冲液(2)含8mmol/LNaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/LTween-80和0.1％NaN3的pH7.8、50mmol/LTris-HCl溶液；6×FB1标准液(3)1.0mL/瓶，标准液浓度为0，1.0，10，100，500，1000ng/mL；铕标记的羊抗鼠抗体(5)的制备取溶解于pH7.0、50mmol/LPBS的5g/L羊抗鼠抗体1-2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为pH8.5-9.0、含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2g/L，取500-1000μL稀释后的羊抗鼠抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力搅拌反应16h，反应液经用pH7.8、80mmol/LTris-HCl缓冲液平衡的1×40cm的Sephadex-G50柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用；洗涤液(6)含14.5mmol/LNaCl、0.2mL/LTween-80和0.2％NaN3的pH7.8、50mmol/LTris-HCl溶液；增强液(7)每升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100。2.—种用权利要求1所述的试剂盒检测伏马菌毒素B1的方法，其特征在于在包被有FB1-BSA的微孔包被板上，加入伏马菌毒素B1标准或处理好的待测样品到各自的微孔中，再加入伏马菌毒素B1单克隆抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加铕标记的羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加增强液振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的伏马菌毒素B1含量。3.根据权利要求2所述的检测伏马菌毒素Bl的方法，其特征在于(1)谷物样品处理将谷物样品粉碎至20目，取5克粉碎后的谷物样品放在试管中，加入提取液25mL，提取液为甲醇水体积比7:3的溶液，加塞振荡3min，过滤，滤纸采用新华1号纸，取lmL滤液用9mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用；(2)检测操作取包被有FB1-BSA的微孔包被板，加入50iiL的伏马菌毒素Bl标准或处理好的待测样品到各自的微孔中，伏马菌毒素B1单克隆抗体以缓冲液(2)作稀释剂进行1:20稀释，微孔中再加入50iiL稀释后的伏马菌毒素Bl单克隆抗体溶液，25t:振荡lh，洗涤液洗3次，加以缓冲液(2)进行l:20稀释的Eu"-羊抗鼠抗体100i!L，25t:振荡lh，用洗涤液洗6次，加200iiL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算待测样品中的伏马菌毒素B1含量。全文摘要一种检测伏马菌毒素B1(FB1)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)
技术领域：
，用于对粮食，饲料以及食品中FB1含量的检测。本发明配制的试剂盒，采用TRFIA检测FB1。微孔板包被有FB1-BSA，加FB1标准或样品，再加FB1单克隆抗体。游离的FB1与微孔板上的FB1-BSA竞争FB1单克隆抗体，没有连接的FB1单克隆抗体洗涤除去，加Eu3+-羊抗鼠抗体，标记免疫反应后没有连接的Eu3+-羊抗鼠抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的FB1浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中FB1的含量。本发明提供的试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.05ng/mL以上。文档编号G01N33/577GK101699293SQ20091021281公开日2010年4月28日申请日期2009年10月28日优先权日2009年10月28日发明者周彬,张珏,王柯,金坚,陈蕴,黄飚申请人:江苏省原子医学研究所