专利名称：高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及筛选抗结核药物的方法，尤其是一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖 胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病(tuberculosis) 的病原菌，据WHO报道，目前全球有近1/3的人已感染结核分枝杆菌，每年新发结核病人约 9000 力。(multi drug resistant, MDR) Μ^&Γ&ΜΜ (extensive drug resistant, XDR)菌株的出现，现有一些一线及二线抗结核药物都无法有效地治愈结核病， 导致每年约有200万人死亡，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。目前，新药研制已由过去大多数随机、偶然和被动的药物发现过程变为主动的以 明确靶标为依据的新药开发过程，以细菌代谢途径中的酶或蛋白质作为靶标来筛选先导化 合物，是目前研发新的抗生素的一种策略。研究表明，分枝杆菌与革兰氏阴性菌和革兰氏阳 性菌相比，具有特殊的细胞壁结构，其核心结构由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三种 大分子所构成。分枝菌酸由含70-90碳原子的脂类分子组成，形成致密的低通透性外层，肽 聚糖位于细胞壁的最内层并与细胞质膜相连。分枝菌酸与中层的聚阿拉伯糖(由呋喃型阿 拉伯糖残基聚合而成)及聚半乳糖(由呋喃型半乳糖残基聚合而成)连接后再通过衔接二 糖(L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺L-Rhamnose-N-GlcNAc)共价连接到肽聚糖大分子上。因此， 衔接二糖是维持分枝杆菌细胞壁完整性的重要结构。N-乙酰葡糖胺既是二糖衔接分子的组成成分，又是肽聚糖的组成成分，其糖基供 体为UDP-N-乙酰葡糖胺。UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成途径包括由三种酶所催化的四步 反应，其中以glmU基因编码的GlmU蛋白酶是双功能酶，其基因C端具有葡糖胺磷酸乙 酰基转移酶活性，N端具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶活性，分别催化第三步的转乙 酰反应及第四步的转尿苷反应。乙酰化作用将乙酰CoA中的乙酰基转移给葡糖胺-1-磷酸， 生成N-乙酰葡糖胺-1-磷酸；转尿苷反应将UTP的α -磷酸转移给N-乙酰葡糖胺-1-磷 酸，生成UDP-乙酰葡糖胺。现有技术构建了 glmU基因敲除菌株，并通过测定其在允许温度和非允许温度条 件下的生长曲线，确定glmU是分枝杆菌生长必需基因[1]，与Sassetti等人的高密度突变实 验的结果一致[2]。GlmU蛋白是N-乙酰葡糖胺赖以存在的必要条件，亦是维持分枝杆菌细 胞壁完整性的关键，尤其是葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶并不存在于人体细胞中，如以葡 糖胺-ι-磷酸乙酰基转移酶为靶酶所研发的抗结核药物既能杀灭结核分枝杆菌又不会对 人体产生毒副作用。但是，迄今为止还没有以葡糖胺-ι-磷酸乙酰基转移酶为抗结核药物 的作用靶标，从已有组合化合物库及中药中筛选出有效的葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑 制剂的相关报道。
发明内容
本发明是以参与结核分枝杆菌细胞壁中关键组分生物合成的葡糖胺-1-磷酸乙 酰基转移酶为对象，提供一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制 剂的方法。本发明的技术解决方案是一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基 转移酶抑制剂的方法，其特征在于依次按如下步骤进行a.用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中克隆glmU基因，从glmU基因 的5，端进行DNA序列删除，获得保留3，端的glmU基因片段glmU_C ；b.将基因片段glmU-C克隆到pET载体，构建出pET-glmU_C表达载体；c.将pET-glmU-C表达载体转化到大肠杆菌中，构建出表达葡糖胺-1-磷酸乙酰转 移酶的工程菌株 MTGC08 (Escherichia coli MTGC08)，保藏编号 CGMCC3419 ；d.将工程菌株MTGC08接种到卡那霉素的LB培养基中，在37°C培养4小时，用浓 度为0. 2mM的IPTG进行诱导表达GlmU-C蛋白；e.收获细菌，超声破碎细胞，离心后取上清，采用组氨酸-Ni2+亲和层析技术纯化 得到GlmU-C蛋白；f.将 2ug GlmU-C 蛋白与 pH 7. 5 的 50mM Tris-HCl、0. 4mM 乙酰 CoA 及 0. 4mM 葡糖 胺-1-磷酸构成50 μ 1的酶促反应体系，将被筛选物按0. 1 5ug/ml浓度加入酶促反应体 系中，在30°C孵育5分钟，加入50 μ 1 6Μ盐酸胍终止反应，再加入50 μ 1 DTNB显色剂显色 10分钟，用酶标仪检测405nm处的吸光度值；g.将所测吸光度值与反应条件同f步骤、酶促反应体系中无被筛选物时测得的 GlmU-C蛋白在405nm处的标准吸光度值进行对比，筛选结核分枝杆菌葡糖胺磷酸乙酰 基转移酶抑制剂。本发明是以结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶为靶标所建立的筛选新 型抗结核药物的方法，可在小体积反应体系中对葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的活性进行 测定，因此，可在96孔板中同时完成96个酶促反应，灵敏、快速准确地在现有组合化合物 库、中药及天然物中筛选出葡糖胺-ι-磷酸乙酰基转移酶抑制剂，制备抗结核药物。因葡 糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶是N-乙酰葡糖胺赖以存在的必要条件，亦是维持结核分枝杆 菌细胞壁完整性的关键，抑制葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶即抑制了衔接二糖的生物合成 途径，从而破坏结核分枝杆菌细胞壁的完整性，导致细菌的死亡，具有高药效性；另外，在人 体细胞中，UDP-乙酰葡糖胺的合成途径与结核分枝杆菌有所不同，不存在葡糖胺-1-磷酸 乙酰基转移酶，因此将编码GlmU双功能酶的glmU基因的5’端删除，只保留glmU基因的 3’端，以编码只有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性的GlmU-C蛋白。结核分枝杆菌葡糖 胺-ι-磷酸乙酰基转移酶所催化的反应在人体细胞中不存在，以葡糖胺-ι-磷酸乙酰基转 移酶为靶酶所研发的抗结核药物将对人体无害，克服了现有抗菌药物也杀害正常细胞的缺 点ο菌株MTGC08 保藏日期2009-11-06。保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号 菌株保藏代号CGMCC 3419。分类命名大肠埃希氏菌Escherichia coli
具体实施例方式a.用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA (购自AmericanType Culture Collection, ATCC# 为 25618D-5)中克隆 glmU 基因，从 glmU 基因的 5，端进行 DNA 序列删除，获得保留3’端的glmU基因片段glmU-C，该基因片段编码的C端GlmU蛋白是葡 糖胺-ι-磷酸乙酰基转移酶结构域；b.将基因片段glmU-C克隆到pET_29b⑴载体(购自Novagen公司，产品号为 69872)，构建出pET-glmU-C表达载体；c.将pET-glmU-C表达载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)(购自Novagen公司，产品 号为69450)中，构建出表达葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶的工程菌株MTGC08 (Escherichia coli MTGC08)，保藏编号CGMCC 3419 (利用HPLC方法确定纯化的GlmU-C蛋白具有葡糖 胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性)；d.将工程菌株MTGC08接种到卡那霉素的LB培养基中，在37°C培养4小时，用浓 度为0. 2mM的IPTG进行诱导表达GlmU-C蛋白；e.收获细菌，超声破碎细胞，离心后取上清，采用组氨酸-Ni2+亲和层析技术纯化 得到GlmU-C蛋白；f.将 2ug GlmU-C 蛋白与 pH 7. 5 的 50mM Tris_HCl、0. 4mM 乙酰 CoA 及 0. 4mM 葡糖 胺-1-磷酸构成50 μ 1的酶促反应体系，将被筛选物按0. 1 5ug/ml浓度加入酶促反应体 系中，在30°C孵育5分钟，加入50 μ 1 6Μ盐酸胍终止反应，再加入50 μ 1 DTNB显色剂(购 自Sigma公司，产品号为D8130)显色10分钟，用酶标仪检测405nm处的吸光度值；g.将所测吸光度值与反应条件同f步骤、酶促反应体系中无被筛选物时测得 的GlmU-C蛋白在405nm处的标准吸光度值(0.452)进行对比，筛选结核分枝杆菌葡糖 胺-ι-磷酸乙酰基转移酶抑制剂。葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性测定原理如下列反应式⑴、(2):
权利要求
一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺 1 磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法，其特征在于依次按如下步骤进行a.用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中克隆glmU基因，从glmU基因的5’端进行DNA序列删除，获得保留3’端的glmU基因片段glmU C；b.将基因片段glmU C克隆到pET载体，构建出pET glmU C表达载体；c.将pET glmU C表达载体转化到大肠杆菌中，构建出表达葡糖胺 1 磷酸乙酰转移酶的工程菌株MTGC08(Escherichia coli MTGC08)，保藏编号CGMCC3419；d.将工程菌株MTGC08接种到卡那霉素的LB培养基中，在37℃培养4小时，用浓度为0.2mM的IPTG进行诱导；e.收获细菌，破碎细胞，离心后取上清，采用组氨酸 Ni2+亲和层析技术纯化得到GlmU C蛋白；f.将2ug GlmU C蛋白与pH 7.5的50mM Tris HCl、0.4mM乙酰CoA及0.4mM葡糖胺 1 磷酸构成50μl的酶促反应体系，将被筛选物按0.1～5ug/ml浓度加入酶促反应体系中，在30℃孵育5分钟，加入50μl 6M盐酸胍终止反应，再加入50μl DTNB显色剂显色10分钟，用酶标仪检测405nm处的吸光度值；g.将所测吸光度值与反应条件同f步骤、酶促反应体系中无被筛选物时测得的GlmU C蛋白在405nm处的标准吸光度值进行对比，筛选结核分枝杆菌葡糖胺 1 磷酸乙酰基转移酶抑制剂。
全文摘要
本发明公开一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法，是利用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中克隆了全长glmU基因，并对全glmU基因进行改造，只保留编码葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的基因片段，同时建立了高表达葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的大肠杆菌工程菌株。利用亲和层析技术从工程菌株中纯化得到葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶，建立了快速、准确测定葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性的方法，该酶活性测定方法是筛选葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的分子模型，用于高通量筛选组合化合物库、中药及天然产物的结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂。
文档编号G01N21/31GK101942501SQ20091022016
公开日2011年1月12日 申请日期2009年11月26日 优先权日2009年11月26日
发明者周妍, 张文利, 辛毅, 马郁芳 申请人:大连医科大学