血小板测定用试剂、血小板测定用试剂盒及血小板测定方法

专利名称：血小板测定用试剂、血小板测定用试剂盒及血小板测定方法
技术领域：
本发明涉及血小板测定用试剂、血小板测定用试剂盒及采用它的血小板测定方 法。更具体地说，本发明涉及作为用于测定血小板的色素尼罗蓝，特别是含尼罗蓝硫酸氢盐 的血小板测定用试剂。
背景技术：
血液中的细胞，即白血球、网状红血球、红血球等血球，采用流式细胞仪(flow Cytometry)原理进行迅速测定的方法已经为人所知。作为这种测定方法，例如，美国专利第6114173号公报(专利文献1)公开一种全 血试样中网状红血球、红血球及血小板的计数及鉴定的方法，以及采用该法的试剂组合物。 具体地说，采用阳离子性色素，特别是采用含噁嗪750的试剂混合物染色网状红血球，采用 流式细胞仪测定散射光信号及光吸收信号。然后，通过血液试样中的红血球与网状红血球 的吸收信号的不同，根据含红血球及网状红血球之组与血小板的散射光信号的不同进行分 类，分别决定其总数。专利文献1 美国专利第6114173号

发明内容
发明所要解决的课题在测定血小板时，已知血液中出现的破碎红血球或脂质等，由于其大小与血小板 类似，在测定时作为杂质产生影响。特别是有必要输血的血小板少的检体在进行测定时，这 些杂质的影响更大。这个问题，即采用美国专利第6114173号公报中记载的方法也产生的 问题，关于抑制杂质的影响测定血小板，在美国专利第6114173号中未作任何记载。另外，作为能染色血小板的色素，在溶液中随着时间的推移而被分解。采用流式细 胞仪对血小板的测定，系对试样中用色素染色的细胞照射光，检测所得到的散射光及荧光 来进行。然而，由于采用含有的血小板染色用色素的量低的色素溶液，无法得到正确的散射 光及荧光，因此，无法得到正确的测定结果。本发明是鉴于上述课题提出的，本发明的目的是提供尽管是含有妨碍血小板检 出的杂质的检体，也可抑制这种杂质的影响以较高的精度测定血小板，并且保存稳定性高 的血小板测定用试剂及血小板测定用试剂盒，另一目的是提供以较高的精度测定血小板的 血小板测定方法。用于解决课题的手段因此，本发明提供血小板测定用试剂，该试剂含有作为染色血小板的色素的、其抗 衡离子为硫酸氢离子的尼罗蓝。另外，本发明提供血小板测定用试剂盒，该试剂盒包含第1试剂，该第1试剂含有 作为染色血小板的色素的、其抗衡离子为硫酸氢离子的尼罗蓝；以及含缓冲剂的第2试剂。
另外，本发明提供血小板测定方法，该方法具有向含有作为染色血小板的色素 的、其抗衡离子为硫酸氢离子的尼罗蓝的第1试剂与检体，添加或不添加含缓冲剂的第2试 剂，进行混合，配制测定用试样的步骤；以及对得到的测定用试样中的细胞照射光，检测从该细胞发出的散射光及荧光的步 骤·’以及根据检出的散射光及荧光，检出测定用试样中含有的血小板的步骤。另外，在另一实施方案中，本发明提供血小板测定用试剂，该试剂含有作为染色血 小板的色素的其抗衡离子为无机酸离子的尼罗蓝与酸。本发明进一步提供血小板测定用试剂盒，该试剂盒包含含有作为染色血小板的 色素的尼罗蓝与酸的第1试剂；以及含缓冲剂的第2试剂。本发明还进一步提供血小板测定方法，该方法具有向含有尼罗蓝与酸的血小板测定用试剂、与检体，添加或不添加含缓冲剂的第2 试剂，进行混合，配制测定用试样的步骤；对得到的测定用试样中的细胞照射光，检测从该细胞发出的散射光及荧光的步 骤·’以及根据检出的散射光及荧光，检出测定用试样中含有的血小板的步骤。在本说明书中，所谓“尼罗蓝”，例如，是指含有以下式(II)表示的、与用X_表示抗 衡离子形成盐的状态的化合物的色素 (式中，Γ表示阴离子)。在本说明书中，当对Γ表示的抗衡离子未作特别限定时， 用式(II)表示的色素仅称“尼罗蓝”，当抗衡离子表示特定的离子时，用式(II)表示的色素 称作“尼罗蓝(特定的离子名)盐”。例如，抗衡离子为硫酸根离子(1/2S0/-)的尼罗蓝称 作“尼罗蓝硫酸盐”，抗衡离子为硫酸氢根离子(HSO42-)的尼罗蓝称作“尼罗蓝硫酸氢盐”。


图1为盛放本发明的血小板测定用试剂盒的容器外观图。图2为试样分析装置的简要构成的正面图。图3为试样分析装置的简要构成的方块图。图4为检出部构成的简要平面图。图5为实验例9的采用血小板测定用试剂进行血小板测定得到的消散图("X
夕夕夕’，厶)。图6为实验例10的采用血小板测定用试剂进行血小板测定得到的消散图。
图7为实验例11的采用血小板测定用试剂进行血小板测定得到的消散图。图8为实验例12的采用血小板测定用试剂进行血小板测定得到的消散图。图9为实验例13的采用色素试剂的血小板测定得到的消散图。图10为实验例9的采用血小板测定用试剂进行含破碎红血球的血液测定得到的 消散图。图11为实验例9的采用血小板测定用试剂进行含脂质粒子血液测定得到的消散 图。图12为实验例10的采用血小板测定用试剂进行含破碎红血球的血液测定得到的 消散图。图13为实验例10的采用血小板测定用试剂进行含脂质粒子血液测定得到的消散 图。图14为实验例14 24的采用血小板测定用试剂进行检体测定得到的消散图。图15为实验例25的采用血小板测定用试剂进行检体测定得到的消散图。图16为实验例45的采用血小板测定用试剂进行血小板测定得到的消散图。图17为实验例46的采用血小板测定用试剂进行血小板测定得到的消散图。图18为实验例47的采用血小板测定用试剂进行血小板测定得到的消散图。图19为实验例48的采用血小板测定用试剂进行血小板测定得到的消散图。图20为实验例45的采用血小板测定用试剂进行含破碎红血球血液测定得到的消 散图。图21为实验例45的采用血小板测定用试剂进行含脂质粒子血液测定得到的消散 图。符号的说明A第1容器B第2容器1试样分析装置2测定单元3数据处理单元4控制部5检出部6试样配制部7 接口8控制部9数据分析部10显示部11操作部12 接口51流动池52激光光源53照射透镜系统
54、57光电二极管54a光束限制器54b放大器55侧集光透镜56分色镜57光电二极管57a、58b 放大器58光电倍增管58a光学过滤器
具体实施例方式<血小板测定用试剂>本发明人等发现，在采用流式细胞仪的血小板测定方法中，通过采用尼罗蓝作为 血小板染色用色素，血小板与其他血球成分或脂质粒子等血液中杂质可明确区分。另外，本发明人等对采用尼罗蓝的血小板测定条件进行悉心研究的结果发现，血 小板测定用试剂，当采用⑴含尼罗蓝硫酸氢盐，或⑵含尼罗蓝与酸时，保存稳定性优良， 完成本发明。上式(II)中，作为X_的阴离子(抗衡离子)，可以举出硫酸根离子(1/2S042_)、氯 离子(C Γ)、硫酸氢根离子(HSO42-)、高氯酸根离子(C 1 O4-)等无机离子。这种尼罗蓝，可从市场购得，例如，从*夕‘-^r F -J , f社、东京化成、f力，4 〒”社、和光纯药工业、矢V夕‘化学社等购得。特别是尼罗蓝硫酸氢盐，可从和光纯药工业、矢ν义化学社等购得。本发明的血小板测定用试剂中含有的尼罗蓝(例如尼罗蓝硫酸氢盐)，在血小 板测定用试剂与检体混合时，色素试剂中所含的浓度范围为0. 05 5. Oppm、优选0. 1 0. 6ppm、更优选0. 2 0. 5ppm的浓度。例如，在与检体混合时，如血小板测定用试剂稀释50 倍，则血小板测定用试剂中的尼罗蓝浓度为2. 5 250ppm，是优选的。如在该浓度范围内，血小板与其他血球成分及杂质的区别可达到更良好。在本发明的血小板测定用试剂含有尼罗蓝与酸的方案中，作为酸，可采用有机酸 及无机酸的任何一种，但优选无机酸。作为无机酸，可以举出硫酸、磷酸、高氯酸等含氧酸， 以及盐酸、氢氟酸、氢碘酸、氢溴酸、氢氰酸、氢异氰酸、硫化氢、迭氮化氢等含氢酸。在本发明的血小板测定用试剂的该方案中，血小板测定用试剂中酸的摩尔浓度， 达到血小板测定用试剂中所含的尼罗蓝的摩尔浓度以下是优选的。具体地说，血小板测定 用试剂中的尼罗蓝与酸的摩尔浓度比达到10 1 1 1是优选的。特别是作为酸采用无 机酸时，尼罗蓝与盐酸的摩尔浓度比达到3 1 1 1是优选的，当作为酸采用硫酸时， 尼罗蓝与硫酸的摩尔浓度比达到4 1 1 1是优选的。通过以这种浓度含有酸，伴随 着时间的推移，血小板测定用试剂中尼罗蓝的有效色素成分浓度降低可更有效地抑制，血 小板测定用试剂的保存稳定性提高。在本发明的血小板测定用试剂的该方案中，尼罗蓝与酸的组合，可采用任何一种 尼罗蓝与酸的组合。然而，更优选的组合是
(A)尼罗蓝硫酸盐与含氧酸或含氢酸；(B)尼罗蓝氯化物与硫酸；以及(C)尼罗蓝硫酸氢盐与含氧酸或含氢酸。在本发明的血小板测定用试剂另一方案中，当尼罗蓝为尼罗蓝硫酸氢盐时，上述 血小板测定用试剂中也可不含酸。作为尼罗蓝，当采用尼罗蓝硫酸氢盐时，即使不加酸，仍 可更有效地抑制血小板测定用试剂中尼罗蓝的有效色素成分浓度降低，使血小板测定用试 剂的保存稳定性提高。在上述2个方案的本发明的血小板测定用试剂中，作为保存稳定性提高的重要原 因，我们考虑有下列2个假说。(1)认为当尼罗蓝为硫酸氢盐形时，稳定性高。当尼罗蓝为硫酸盐时，通过添加酸，酸解离而产生质子(H+)，与尼罗蓝硫酸盐的 SO42-形成HSO4_，HSO4-与尼罗蓝的平衡达到1 1而稳定化。当尼罗蓝为上述以外的盐时，通过添加硫酸，从硫酸生成的HS04_，使尼罗蓝稳定 化。因此，本发明的血小板测定用试剂，由于硫酸氢根离子存在，故可以得到尼罗蓝与 根据需要含酸的血小板测定用试剂。(2)尼罗蓝的结构，在二乙氨基、氨基及吩噁嗪结构中的氮的3处有氮原子。可以 认为，这些氮原子中，与上述用χ-表示的抗衡阴离子形成盐的氮原子以外的氮原子形成酸 加成盐，提高氮原子的稳定性，更提高色素的溶解性，故血小板测定用试剂的稳定性提高。S卩，当为尼罗蓝硫酸氢盐时，作为抗衡阴离子的硫酸氢根离子(HSO4-)发生解离， 产生质子(H+)与硫酸根离子(SO/—)。可以认为，该质子与尼罗蓝的任何一个氮原子结合， 生成质子性氮原子。该质子性氮原子通过硫酸根离子形用分子间盐，提高色素的溶解性，提 高稳定性。另外，可以认为，当向硫酸氢盐以外的尼罗蓝添加酸时，酸发生解离，产生质子及 阴离子，有助于尼罗蓝的分子间盐形成，提高色素的溶解性及稳定性。因此，本发明的血小板测定用试剂，由于尼罗蓝形成分子间盐，故可以得到含尼罗 蓝与根据需要含酸的血小板测定用试剂。本发明的血小板测定用试剂，进一步含有水溶性有机溶剂是优选的。作为水溶性 有机溶剂，只要能溶解上述尼罗蓝的溶剂即可而未作特别限定，可以举出乙二醇、二甘醇、 聚乙二醇等质子性溶剂。本发明的血小板测定用试剂，是把尼罗蓝及视场合的酸溶于上述水溶性有机溶剂 使达到上述所希望的浓度而制造。<血小板测定用试剂盒>上述血小板测定用试剂，与用于稀释含色素的血小板测定用试剂的含缓冲剂的试 剂进行组合，制成试剂盒。S卩，本发明的发明点之一，涉及包含含尼罗蓝硫酸氢盐、或尼罗蓝及酸的第1试 剂(下面称作“色素试剂”)与含缓冲剂的第2试剂(下面称作“稀释试剂”)的血小板测 定用试剂盒。上述第1试剂，与对上述血小板测定用试剂的叙述相同。
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第2试剂中含有的缓冲剂，只要能把第2试剂的pH保持在所希望的范围即可而 未作特别限定，但可根据所希望的PH采用羧酸盐类、磷酸盐、优良的缓冲剂、牛磺酸、三乙 醇胺等。优选在稀释试剂中含有缓冲剂使稀释试剂的PH达到6. 0 11. 0的范围、更优选 7. 0 10. 0、尤其优选8. 0 9. 5。通过使稀释试剂的pH达到6. 0以上，在稀释试剂与检体 混合时，红血球难以溶血，可降低作为杂质的破碎红血球，另外，通过使PH达到11.0以下， 可降低破碎红血球的非特异染色。因此，上述第2试剂优选pH 6. 0 11. 0的缓冲液。上述稀释试剂，除上述缓冲剂外，还可进一步含有浸透压补偿剂、促进尼罗蓝对血 小板染色的染色促进剂等成分。浸透压补偿剂，最好是把稀释试剂的渗透压保持在适当范围的化合物，例如，可以 举出丙酸等有机酸的碱金属盐，葡萄糖、甘露糖等糖类。另外，也可以采用NaC 1等碱金属 卤化物或碱土类金属卤化物。上述浸透压补偿剂可采用1种或2种以上。浸透压补偿剂在稀释试剂中的含量优选使稀释试剂的渗透压调整达到150 600m0sm/kg,更优选200 300m0sm/kg。通过使达到该范围的渗透压，试剂盒的各试剂与检 体混合时的渗透压可接近生理渗透压，防止红血球的低渗溶血等，故可抑制破碎红血球的 增加，更精确地测定血小板。还有，采用当上述缓冲剂的稀释试剂的浸透压调整至上述范围 时，也可不用浸透压补偿剂。上述染色促进剂，最好是可以促进尼罗蓝向血小板的渗透性的化合物，优选表面 活性剂，特别是阳高子表面活性剂。优选的阳高子表面活性剂为用下式(I)表示的化合物 (式中，R11为碳原子数8 12的烷基；R12、R13及R14可以相同或相异，为碳原子数 1 6的烷基；Y_为阴离子)。在上式⑴中，作为R11的碳原子数8 12的烷基，可以是直链状或支链状的任何 一种，例如，可以举出辛基、癸基、月桂基、十六烷基、十四烷基等。作为R12、R13及R14的碳原子数1 6的烷基，可以是直链状或支链状的任何一种， 例如，可以举出甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基以及已基。其中，优选 甲基、乙基。作为Y—的阴离子，优选溴离子或氯离子。上式(I)的优选阳离子表面活性剂，可以举出癸基三甲基氯化铵(DTAB)、辛基三 甲基溴化铵(OTAB)、月桂基三甲基氯化铵(LTAC)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、十四烷 基三甲基溴化铵(MTAB)等。这些阳离子表面活性剂，可使用1种或2种以上。上述阳离子表面活性剂，在稀释试剂中含50 20000ppm的浓度是优选的，特别优选的浓度因阳离子表面活性剂的种类而异，例如，采用DTAB时的浓度为500 3000ppm左 右，采用LTAC时的浓度优选为100 500ppm左右。通过阳离子表面活性剂以这种浓度含 于稀释试剂中，在血小板测定用试剂盒的各种试剂与检体混合时，不引起红血球的溶血，可 以促进良好的血小板的染色。另外，上述稀释试剂除上述成分以外，还可以含有例如，2-吡啶硫基-1-氧化钠、 β-新戊醇等防腐剂。上述稀释试剂中含有的缓冲剂及该稀释试剂中所含的任意成分，也可预先混合至 色素试剂中，但色素试剂中含有的尼罗蓝，由于在水或碱成分作用下而老化，故色素试剂与 稀释试剂分别作为试剂含在上述试剂盒中，从保存稳定性考虑是优选的。按照本实施方案的血小板测定用试剂盒，如图1所示，由盛放色素试剂的第1容器 A与盛放稀释试剂的第2容器B而制成。因此，通过把色素试剂与稀释试剂盛放在各个容器 中，色素试剂中含有的尼罗蓝，不因稀释试剂中含有的水或碱性成分而老化，可以提供保存 稳定性优良的血小板测定用试剂盒。〈血小板测定方法〉上述血小板测定用试剂或血小板测定用试剂盒，通过与含血小板的检体混合，可 染色该血小板。因此，本发明还提供采用上述血小板测定用试剂或血小板测定用试剂盒的血小板 测定方法。本发明的测定方法包括把含有尼罗蓝硫酸氢盐、或尼罗蓝与酸的第1试剂，与检体混合，配制测定用试样 的步骤；对得到的测定用试样中的细胞照射光，检测从该细胞发出的散射光及荧光的步 骤·’以及根据检出的散射光及荧光，检出测定用试样中含有的血小板的步骤。在上述测定方法中，在第1试剂与检体的混合步骤中，也可再混合或不混合含缓 冲剂的第2试剂，但优选再混合该第2试剂。上述第1试剂及第2试剂，与上述血小板测定用试剂盒中的叙述相同。上述检体，包括从生物体，特别是从包括人等哺乳动物采取的血液(全血、多血小 板血浆(PRP)等)、以及骨髓液。检体也可以是这些血液或骨髓液也可用缓冲液等适当的溶 液稀释之物。上述第1试剂及检体在进行混合时，测定用试样中混合尼罗蓝的浓度为0. 05 5. Oppm、优选 0. 1 ~ 0. 6ppm、更优选 0. 2 ~ 0. 5ppm。上述第1试剂与检体混合得到的测定用试样中的尼罗蓝浓度，为了达到上述范 围，也可用第2试剂稀释。因此，采用第2试剂时，上述第1试剂及第2试剂与检体，以第1试剂+第2试剂 检体=100 1 1000 1的容量比进行混合是优选的。另夕卜，采用第2试剂时，第1试剂与第2试剂的容量比优选1 10 1 100、更 优选1 20 1 75。在上述混合步骤中，添加第2试剂时，对第1试剂、第2试剂及检体的混合顺序未作特别限定。上述混合步骤在25°C 50°C左右，更优选在35°C 45°C左右的温度进行。另外， 混合以10秒 5分钟左右、更优选10秒 2分钟左右、尤其优选10秒 60秒左右的时间 来进行。其次，在本发明的测定方法中，对上述操作得到的测定用试样中的细胞照射光，检 出从该细胞发出的散射光及荧光。作为照射光的装置，优选流式细胞仪。采用流式细胞仪时，把测定用试样导入流式 细胞仪的流动池内，对流动池内流动的测定用试样中的细胞照射光。对使用的流式细胞仪的光源未作特别限定，可采用适于尼罗蓝激发的波长(例 如，600 680nm附近)的光源。作为光源，例如，可以举出红外半导体激光、He-Ne激光等。 特别是半导体激光比气体激光非常便宜，是优选的。在上述流式细胞仪中，通过照射光，从细胞发出的散射光，可以是前散射光(受光 角度0 20°附近)或侧散射光(受光角度90°附近)的任何一种。另外，作为前散射光， 也可以是前低角散射光(受光角度1 5°附近)或前高角散射光(受光角度6 20°附 近)的任何一种。在上述流式细胞仪中，通过照射光，从细胞发出荧光，选择适于尼罗蓝的受光波长 (630 680nm 左右)。基于上述操作得到的散射光及荧光，通过制成的消散图，可把血小板与其他血球 成分及脂肪粒子等杂质加以区别，检出血小板。也可以计数这样操作检出的血小板。在血 小板的检出及/或计数时，优选采用适当的解析用软件。下面，参照附图，对采用具有流式细胞仪的试样分析装置的血小板测定进行说明。图2为试样分析装置的简要构成的正面图。该试样分析装置1，例如是血液检查使 用的装置，如图2所示，其主要由测定单元2与数据处理单元3构成，通过测定单元2，对血 液检体中含有的成分进行规定的测定，其测定数据由数据处理单元3接受进行分析处理。图3是试样分析装置1的简要构成方块图。如图3所示，测定单元2具有用于控 制各部动作的控制部4 ；用于检出试样中被检粒子的具有流式细胞仪的检出部5 ；配制测定 用试样，把配制成的测定用试样供给检出部5的试样配制部6 ；数据处理单元3以及进行数 据信号接收的接口 7。数据处理单元3具有用于控制各部动作的控制部8 ；分析从测定单 元2接收的检出数据的数据分析部9 ；把数据分析部9的分析结果作为消散图表示的显示 部10 ；接受来自计算操作的操作部11 ；测定单元2及收发数据信号的接口 12。其次，对具有流式细胞仪的检出部5的构成，参照图4进行说明。图4为表示检出 部构成的简要平面图。检出部5中配置半导体激光光源52，使向流动池51射出激光。在半 导体激光光源52与流动池51之间，配置由多个透镜构成的照射透镜系统53。从半导体激 光光源52至直线延伸的光轴上，夹持流动池51对着照射透镜系统53地设置光阑54a，来自 半导体激光光源52的直接光被光阑54a遮光。另外，在光阑54a的另外的光轴下流侧配置 光电二极管54。当测定用试样流至流动池51时，在激光作用下产生散射光及荧光的光信号。其 中，前方的信号光向上述光电二极管54照射。来自半导体激光光源52的沿直线延伸的光 轴行进的光中，半导体激光光源52的直接光被光阑54a遮断，仅沿大致上述光轴方向进行
12的散射光(下面称前散射光)入射至光电二极管54。由流动池51发出的前散射光通过光 电二极管54进行光电变换。由此生成的电信号(下面称前散射光信号)通过放大器54b 放大。然后，前散射光信号向控制部4输出后，通过接口 7输至数据处理单元3，在数据处理 单元3的数据分析部9中进行信号处理。该前散射光信号反映被检粒子大小，数据分析部9把该前散射光信号进行信号处 理，得到被检粒子大小等数据。另外，从半导体激光光源52至对着光电二极管54的直线延伸的光轴的垂直方向， 设置侧集光透镜55，向通过流动池51内的被检粒子照射半导体激光时产生的侧光(向与上 述光轴的交叉方向射出的光)，由该侧集光透镜55汇集。在侧集光透镜55的侧光行进方向 的下流侧设置分色镜56，从侧集光透镜55送出的信号光，由分色镜56分成散射光成分与 荧光成分。在分色镜56的侧面(在与侧集光透镜55与分色镜56相连的光轴方向的交叉 方向)，设置接收侧散射光用的光电二极管57，在分色镜56的上述光轴下游侧设置光学过 滤器58a及光电倍增管58。然后，通过分色镜56分出的侧散射光成分，通过光电二极管57 进行光电变换，由此产生的电信号(下面称作侧散射光信号)，通过放大器57a放大。侧散 射光信号输出至控制部4后，通过接口 7输出至数据处理单元3，在数据处理单元3的数据 分析部9进行信号处理。该侧散射光信号反映被检粒子的内部信息(例如，白血球核的大小等)，数据分析 部9通过对该侧散射光信号进行信号处理，可以得到白血球核的大小等。另外，从分色镜56发出的侧荧光成分，通过光学过滤器58a选择波长后，通过光电 二极管58进行光电变换，由此产生的电信号(侧荧光信号)通过放大器58b放大。侧荧光 信号输出至控制部4后，通过接口输出至数据处理单元3，在数据处理单元3的数据分析部 9进行信号处理。该侧荧光信号，反映被检粒子的染色度有关的信息，数据分析部9，对该侧荧光信 号进行信号处理，可以得到被检粒子的染色性等。数据处理单元3的数据分析部9，把上述操作得到的前散射光信号、侧散射光信号 及荧光信号进行分析，检出被检粒子，再进行被检粒子的计数。另外，数据分析部9基于前 散射光信号、侧散射光信号及荧光信号的分析结果，制成消散图。制成的消散图于显示部10 上显不。采用该试样分析装置，能够测定血小板。首先，在试样配制部6中，把检体与血小板测定用试剂，或检体与血小板测定用试 剂盒中含有的各种试剂进行混合，配制测定用试样。作为这里使用的血小板测定用试剂或 血小板测定用试剂盒，可以使用上述血小板测定用试剂或血小板测定用试剂盒。上述血小 板测定用试剂或血小板测定用试剂盒的色素试剂中含有尼罗蓝，该尼罗蓝把检体中含有的 血小板染色。试样配制部6，把检体与上述血小板测定用试剂或血小板测定用试剂盒中含有的 各种试剂进行混合，配制测定用试样，优选的是使测定用试样中的尼罗蓝浓度达到0. 05 5. Oppm(0. 00014 0. 014mmol/L)、优选 0. 1 0. 6ppm、更优选 0. 2 0. 5ppm。配制测定用 试样时的反应温度及反应时间，优选血小板测定用试剂的说明中记载的反应温度及反应时 间。
其次，在试样配制部6中配制的测定用试样，从试样配制部6供给检出部5。在检 出部5中测定用试样导入流式细胞仪的流动池51，通过半导体激光光源52对测定用试样中 的被检粒子照射激光。照射激光后得到的被检粒子的前散射光信号、侧散射光信号及荧光 信号，在数据处理单元3的数据分析部9进行信号处理。数据分析部9，把测定用试样中的血小板与检体中含有的破碎红血球或脂肪粒子 等其他成分，基于前散射光信号及荧光信号明确区分而检出。数据分析部9也可计数这样 检出的血小板。因此，为了基于前散射光信号及荧光信号检出及计数血小板，使用适于数据 分析部9的信号处理的解析软件是优选的。还有，这里示出基于前散射光信号及荧光信号检出血小板的构成，但又不限于如 此构成，例如，也可采用基于侧散射光信号及荧光信号检出血小板的构成。实施例本发明按照以下实施例进行更详细说明，但这些实施例并不限定本发明的范围。实验例1 8含尼罗蓝硫酸氢盐的血小板测定用试剂的保存稳定性在这里，为了检验色素试剂的保存稳定性，把表1中记载的尼罗蓝配制达到含表1 中记载的浓度的血小板测定用试剂(色素试剂)，测定反映色素试剂中尼罗蓝有效色素成 分浓度参数的吸光度，评价色素试剂中尼罗蓝的保存稳定性。血小板测定用试剂色素以下记载的浓度乙二醇5mL[表1] 把得到的色素试剂用乙醇稀释10倍，用分光光度计在色素的吸光光谱达到最大 的630nm测定吸光度。还有，吸光度的测定以乙醇作为对照进行。另外，该稀释过的试剂于 45°C保存，于稀释后第2个月、第4个月及第7个月测定吸光度，求其变化率。吸光度的测 定结果示于表2-1、吸光度变化率示于表2-2。还有，所谓“吸光度变化率”，从该实验例得到的多个吸光度测定值中以最高测定 值作基准值，与吸光度的变化之比，用比例表示。[表 2-1] [表2-2] 如表2-2所示，采用尼罗蓝硫酸氢盐作为色素的实验例1的色素试剂的吸光度降 低，在第2个月为2. 5 %，第4个月为5. 0 %，第7个月为6. 9 %。采用尼罗蓝硫酸氢盐作为 同样色素的实验例2的色素试剂的吸光度降低，在第2个月为3. 5 %，第4个月为6. 9 %，第 7个月为16.9%。另一方面，采用抗衡离子不是硫酸氢离子的尼罗蓝的实验例3 8的色素试剂的 吸光度降低，在第2个月为10%以上，第4个月为20%以上，第7个月为30%以上。通过与这些实验例3 8的对比也明确已知，采用抗衡离子是硫酸氢根离子的尼 罗蓝的实验例1及2的色素试剂，与采用抗衡离子不是硫酸氢根离子的尼罗蓝的色素试剂 相比，伴随着时间的推移，吸光度降低少，保存稳定性优良。实验例9 13含尼罗蓝硫酸氢盐的血小板测定用试剂的血小板染色性在这里，为了检验含尼罗蓝硫酸氢盐的血小板测定用试剂的血小板染色性进行以 下实验。首先，制造含下列组成的色素试剂以及含稀释试剂的试剂盒。(1)色素试剂用于染色血小板的色素色素以下记载的浓度乙二醇IL(2)稀释试剂麦黄酮(缓冲剂)1.8g月桂基三甲基氯化铵(LTAC) 0. 15g精制水IL(调整至 ρΗ9· 0、渗透压 200m0sm/kg · H2O)作为用于测定上述血小板的色素，把表3所示的色素分别采用表3所示的浓度。还 有，在括号内表示试剂与检体混合时的最终浓度。这些色素的化学式示于表3。把上述稀释试剂lmL，注入试管中在40°C水槽中进行加热，再往该稀释试剂中添 加所得到的色素试剂20 μ L及作为检体的健康人全血5 μ L，于40°C使反应25秒，配制测定 用试样。把该测定用试样导入具有发出633nm波长光源的流式细胞仪的检出部，对测定用 试样中的细胞照射激发光，检出从该细胞发出的散射光信号及荧光信号，解析所得到的信 号，测定测定用试样中的血小板。这些测定用试样的配制以及流式细胞仪的血小板测定，采用血液分析装置XE_2100( ) W、” 7社制造)。还有，上述血液分析装置，采用光源的输 出从通常的3W变更为9W的改造机。[表 3] 把实验例9 13中得到的消散图分别示于图5 图9。还有，各图中的(a)是纵 轴为前散射光强度，横轴为荧光强度的消散图，各图中的(b)是各图中的(a)表示的消散图 的纵轴变换至log后的曲线。在各图的(b)中，出现血小板的区城用实线表示。各实验例 的测定结果示于表3。如图5 图9所示，作为用于染色血小板的色素采用尼罗蓝硫酸氢盐的实验例9 及10，与不使用尼罗蓝的其他色素的实验例11 13相比，由于血小板更易染色，在荧光强 度强的范围内可检出血小板。因此，作为用于染色血小板的色素用尼罗蓝硫酸氢盐时，可更好地与其他血球成 分区别，测定血小板。其次，既使当血液中存在脂质粒子等杂质时，通过采用尼罗蓝硫酸氢盐的实验例9 及10的色素试剂，是否可以特异地染色血小板加以检出呢？采用实验例9及10的色素试剂，进行含破碎红血球血液及含脂质粒子血液的血小 板测定。还有，实验方法，除用含破碎红血球血液及含脂质粒子血液代替健康的人全血外，与上述同样进行，故省略详细说明。采用实验例9的色素测定含破碎红血球血液、含脂质粒子血液得到的消散图分别 示于图10、图11。采用实验例10的色素测定含破碎红血球血液、含脂质粒子血液得到的消 散图分别示于图12、图13。各图中的(a)是纵轴为前散射光强度，横轴为荧光强度的消散 图，各图中的(b)是各图中的(a)表示的消散图的纵轴变换至log后的曲线。各图中的(c) 是在各图的(b)中，血小板出现的区域的周边放大的曲线。各图中的(c)中出现血小板的 区城用实线表示。从图10 13的结果可知，实验例9及10的色素试剂，血液中的破碎红血球或脂 质粒子等杂质可明确区分，血小板被特异地染色。因此，作为用于血小板染色的色素，通过 采用尼罗蓝硫酸氢盐血小板，既使当血液中存在破碎红血球或脂质粒子等杂质时，与其他 血球成分仍可良好区别测定血小板。从实验例1及2可知，采用尼罗蓝硫酸氢盐的色素试剂，伴随着时间的推移，吸光 度降低少，保存稳定性优良。另外，从实验例9及10可知，作为用于血小板染色的色素的尼 罗蓝硫酸氢盐，可特异地染色血液中的血小板，即使是破碎红血球或脂质粒子等杂质存在 的血液，仍然是可正确测定血小板的色素。实验例14 24含各种浓度尼罗蓝硫酸氢盐的血小板测定用试剂的血小板染色性尼罗蓝硫酸氢盐(々社制造)的色素试剂，以下表4所记载的浓度于乙二醇 中配制。把得到的色素试剂与实验例9 13中记载那样的稀释试剂组合使用，用健康人的 全血、含破碎红血球及脂质粒子的血液作为检体，与实验例9 13同样测定血小板。[表 4] 所得到的消散图示于图14。从图14的结果可知，在试验的全部浓度范围内，采用尼罗蓝硫酸氢盐可良好地进 行血小板的测定。其中，用含破碎红血球的血液作为检体时，采用实验例17 22的血小板测定用试 剂(尼罗蓝硫酸氢盐的最终浓度0. 24 0. 44mg/L)进行测定时，血小板与其他血球成分 及杂质可更明确地进行分离。实验例25含尼罗蓝硫酸氢盐的血小板测定用试剂的保存稳定性尼罗蓝硫酸氢盐(* >夕社制造)的色素试剂，于乙二醇中配制，使达到14.4ppm 浓度。该色素试剂于45°C的温度条件下保存16周，使用保存后的色素试剂测定检体。检体采用从健康人采取的血液、血小板值低的血液、含人工脂质血液、以及含破碎 红血球血液，按照实验例9 13记载的方法测定血小板。所得到的消散图示于图15。从图15的消散图可知，对任何检体的杂质也可明确区分，使血小板染色。从该结果可知，作为用于染色血小板的色素，通过采用尼罗蓝硫酸氢盐，即使在对 色素不利条件下长期保存时，仍可抑制杂质的影响以较好的精度测定血小板。为了探讨在上述条件下保存的色素浓度变化，进行以下的实验。色素试剂刚配制后、及保存后第16周的色素试剂，用乙醇稀释10倍，测定628nm 的吸光度，此外，与实验例1 8同样操作，测定吸光度。另外，基于测定的吸光度的降低率， 于保存后第16周求出色素试剂中的色素浓度。这些结果示于下表5。[表5] 如表5所示，保存后第16周的色素原液的色素浓度，换算为13. lppm。因此，即使 于上述条件下保存后，仍可以保持用于测定血小板的适宜的色素浓度。实验例26 29含尼罗蓝与酸的血小板测定用试剂的保存稳定性在这里，在溶解了尼罗蓝的溶液(尼罗蓝溶液)中，当含盐酸或氢氧化钠时，进行 尼罗蓝溶液的保存稳定性调查试验。尼罗蓝溶液的保存稳定性，通过测定反映溶液中尼罗 蓝的有效色素成分浓度参数的吸光度进行评价。
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还有，在以下的说明中所谓“吸光度变化率”，是指从该实验例得到的多个吸光度 测定值中以最高测定值作基准值，吸光度的变化值用百分比表示。所谓“初期吸光度”，是指 该实验例涉及的色素试剂刚配制后的吸光度测定值。在本实验例中，使用抗衡离子为硫酸根离子的尼罗蓝(尼罗蓝Α，ν ^ 7社制造)。 使该尼罗蓝溶于乙二醇中达到0. 02mmol/L的浓度，配制成尼罗蓝溶液(比较例1)。另外，在该尼罗蓝溶液5mL中使含下列记载的物质达到下列浓度，作为实验例 26 29。实验例26 盐酸2mmol/L27 盐酸0. 02mmol/L28 氢氧化钠 2mmol/L29 氢氧化钠 0. 02mmol/L各溶液用乙醇稀释5倍，用分光光度计测定色素的吸光光谱达到最大的630nm的 各溶液吸光度。另外，该稀释溶液于60°C的温度负荷条件下保存，测定稀释后第2周及第4 周的吸光度。求其吸光度变化率。还有，吸光度的测定以乙醇作为对照物。吸光度的测定 结果示于表6-1，吸光度的变化率示于表6-2。[表6-1] [表 6-2]
刚配制后第2周第4周比较例10. 0%-2. 4%-16. 5%实验例 26 (HCl 2mM)0. 0%-85. 2%-99. 0%实验例 27 (HCl 0. 02mM)0. 0%-0. 6%-10. 9%实验例 28 (NaOH 2mM)0. 0%-73. 8%-27. 7% 如表6-1所示，不添加盐酸或氢氧化钠的比较例1的初期吸光度为0.5158。另 外，比较例1的吸光度变化率，如表6-2所示，配制后第2周为-2.4%，配制后第4周 为-16. 5%。当观察含盐酸的实验例26及27的初期吸光度时，如表6_1所示，实验例26的初 期吸光度为0. 5388，实验例27的初期吸光度为0. 5319，与比较例1的初期吸光度无大的差别。当观察吸光度变化率时，如表6-2所示，含2mmol/L浓度的盐酸的实验例26的吸 光度变化率，第2周为-85. 2%，第4周为-99. 0%，与比较例1相比，伴随着时间的推移，吸 光度的降低变得显著。即，可知尼罗蓝溶液的保存稳定性降低。另一方面，含0.02mmol/L浓度盐酸的实验例27的吸光度变化率，第2周 为-0.6%，第4周为-10.9%，与比较例1相比，伴随着时间的推移，吸光度的降低变缓。即， 可知尼罗蓝溶液的保存稳定性提高。当观察添加氢氧化钠的实验例28及29时，如表6_1所示，实验例28的初期吸光 度为0. 0065，实验例29的初期吸光度为0. 4948，任何一种与比较例1相比，初期吸光度降 低。另外，当观察吸光度变化率时，如表6-2所示，实验例28及29的吸光度变化率，任 何一种配制后第4周为-20%以下，与比较例1相比，伴随着时间的推移，吸光度的降低变得 显著。即，可知尼罗蓝溶液的保存稳定性降低。从这些实验结果可知，通过向尼罗蓝溶液添加规定浓度盐酸时，尼罗蓝溶液的保 存稳定性提高。实验例30 36尼罗蓝与盐酸的摩尔浓度比对血小板测定用试剂的保存稳定性的 影响从上述实验例26 29可知，通过向尼罗蓝溶液添加规定浓度盐酸时，尼罗蓝溶液 的保存稳定性提高。在这里，尼罗蓝溶液的保存稳定性，即尼罗蓝有效色素成分浓度的降低，是由于溶 液中尼罗蓝有效色素成分的分解造成的，故必需对添加至溶液中的盐酸浓度与尼罗蓝分子 数的关系进行探讨。在本实验例中对尼罗蓝溶液中的盐酸与尼罗蓝之比(摩尔浓度比)进行各种变 更，调查尼罗蓝与盐酸之比(摩尔浓度比)与尼罗蓝溶液的保存稳定性的关系。还有，尼罗蓝溶液的保存稳定性，与实验例26 29同样，通过评价尼罗蓝溶液的 吸光度来进行。与上述实验例26 29同样，使尼罗蓝A( ν ^ 社制造)溶于乙二醇中以达到 0. 02mmol/L的浓度，配制成尼罗蓝溶液(比较例2)。另外，使该尼罗蓝溶液5mL中含盐酸，使达到下列浓度，作为实验例30 36。还 有，括号内表示溶液中的尼罗蓝与盐酸的摩尔浓度比实验例30 盐酸 0. 002mmol/L(10 1) 把这样得到的色素溶液用乙醇稀释20倍，用分光光度计测定色素的吸光光谱达
到最大的630nm的各色素溶液吸光度。另外，该色素溶液于45°C的温度负荷条件下保存，测 定配制后第4周、第9周及第18周的吸光度。求其吸光度变化率。还有，吸光度的测定以 乙醇作为对照物。吸光度的测定结果示于表7-1，吸光度的变化率示于表7-2。表7-1 如表7-1所示，未添加盐酸的比较例2的初期吸光度为0. 1342。而比较例2的吸 光度变化率，如表7-2所示，配制后第4周为-10. 0%、配制后第9周为-12. 5%、配制后第 18 周为-26. 5%0当观察实验例30 36的初期吸光度时，如表7_1所示，实验例30 36的任何一 个与比较例2之间未发现大的差别。其次，当观察吸光度变化率时，尼罗蓝与盐酸的摩尔浓度比为10 1的实验例 30的吸光度变化率，配制后第4周为-9. 0%、配制后第9周为-10. 5%、配制后第18周 为-23. 2%。尼罗蓝与盐酸的摩尔浓度比为3 1的实验例31的吸光度变化率，配制后第4周 为-6. 9%、配制后第9周为-9. 3%、配制后第18周为-20. 9%。尼罗蓝与盐酸的摩尔浓度比为1 1的实验例32的吸光度变化率，配制后第4周 为-5. 6%、配制后第9周为-5. 2%、配制后第18周为-16. 8%。通过与比较例2的对比可知，盐酸的摩尔浓度在尼罗蓝的摩尔浓度以下的实验例 30 32的吸光度下降，即使在配制后第4周、第9周、第18周的任何时间点，与不含盐酸的 比较例2对比，均缓慢。即尼罗蓝的保存稳定性提高。特别是尼罗蓝与盐酸的摩尔浓度比为1 1的实验例32，与其他实验例相比，得到 良好的保存稳定性。实验例37 44含尼罗蓝与盐酸的血小板测定用试剂的保存稳定性其次，用硫酸代替盐酸，探讨含硫酸的尼罗蓝溶液的保存稳定性。与上述实验例26 36同样，使尼罗蓝Α( ν义社制造)溶于乙二醇中以达到 0. 02mmol/L的浓度，配制成尼罗蓝溶液(比较例3)。另外，使该尼罗蓝溶液5mL中含硫酸，使达到下列浓度，作为实验例37 40。还 有，括号内表示溶液中的尼罗蓝与硫酸的摩尔浓度比。实验例37 硫酸 0. 005mmol/L(4 1)38 硫酸 0.01mmol/L(2 1)39 硫酸 0.02mmol/L(l 1)40 硫酸 0. 05mmol/L(l 2.5)用抗衡离子为硫酸根离子的尼罗蓝A ( t ^ 7 r ^ ^社制造)代替实验例37 40中使用的尼罗蓝A ( ν 7 ι社制造)配制尼罗蓝溶液(比较例4)。
使该尼罗蓝溶液5mL中含硫酸达到下列浓度，作为实验例41 44。还有，括号内 表示溶液中的尼罗蓝与硫酸的摩尔浓度比。实验例41 硫酸 0. 005mmol/L(4 1)42 硫酸 0. 01mmol/L(2 1)43 硫酸 0. 02mmol/L(l 1)44 硫酸 0. 05mmol/L(l 2.5)测定实验例37 44的溶液刚配制后的吸光度。另外，各溶液于45°C的温度负荷 条件下保存，测定稀释后第1个月、第2个月、第3个月及第4个月的吸光度。求其吸光度
变化率。实验例37 40得到的吸光度测定结果示于表8_1，吸光度变化率示于表8_2。实验例41 44得到的吸光度测定结果示于表9_1，吸光度变化率示于表9_2。[表8-1] [表9-1] [表 9-2]
刚配制后第1个月第2个月第3个月第4个月比较例40. 0%-1. 4%-13. 2%-16. 7%-27. 4%实验例 41 (H2SO4O. 005mM)0. 0%0. 3%-7. 7%-11. 7%-21. 3%实验例 42 (H2SO4O. OlmM)0. 0%3. 6%0. 9%0. 4%-4. 2%实验例 43 (H2SO4O. 02mM)0. 0%2. 8%-1. 9%-7. 7%-16. 5%实验例 44 (H2SO4O. 05mM)0. 0%0. 6%-6. 6%-15. 3%-33. 4%如表8-2所示，采用尼罗蓝的摩尔浓度以下的浓度含硫酸的实验例37 39，与不 含硫酸的比较例3相比，在任何时点吸光度的降低缓慢。即，尼罗蓝的保存稳定性提高。如表9-2所示，采用尼罗蓝的摩尔浓度以下的浓度含硫酸的实验例41 43，与不 含硫酸的比较例4相比，在任何时点吸光度的降低缓慢。即，尼罗蓝的保存稳定性提高。特别是尼罗蓝与硫酸的摩尔浓度比为2 1 1 1的实验例39及实验例42中， 在经过4个月的时点的吸光度变化率分别为0. 0%与-4. 2%，得到极良好的保存稳定性。如上所述，在尼罗蓝的溶液中通过含摩尔浓度以下的浓度的酸，已证明尼罗蓝溶 液的保存稳定性得到提高。还有，在实验例37 40与实验例41 44中，尼罗蓝溶液含有的硫酸与最佳浓度 有差异，这是由于市场销售的试剂中含有的尼罗蓝的纯度不同所致，但仍认为处在误差范 围内。实验例45 48含尼罗蓝与酸的血小板测定用试剂的血小板染色性
在这里，为了检验含尼罗蓝与酸的血小板测定用试剂的血小板染色性，进行以下实验。
首先，制备以下包含以下组成的血小板测定用试剂和稀释溶液。
(1)血小板测定用试剂
用于血小板染色的色素下列记载的浓度
乙二醇lL
(2)稀释溶液
麦黄酮(缓冲剂)1．8g
月桂基三甲基氯化铵(LuC) o．15g
精制水lL
(调整至pH9．o1渗透压200re()sin／kg．H，。)
作为用于测定血小板的色素，把表lo所示的色素分别采用表中所示的浓度。还有，括号内表示血小板测定用试剂与稀释溶液与检体混含时的最终浓度。这些色素的化学式如表lo所示。
血小板的测定已在实验例9一13中作了记载。
[表10]
实验例45得到的消散图示于图16，实验例46得到的消散图示于图17，实验例47得到的消散图示于图18，实验例48得到的消散图示于图19。还有，在各图中，图(a)纵轴为前散射光强度，横轴为荧光强度的消散图，图(b)为图(a)表示的消散图的纵轴变换成l。g的消散图。在各图中，图(b)中的血小板出现的区域用实线表示。
各实验例的测定结果如表10所示。如图16所示，用尼罗蓝作为色素的实验例45中，血小板集团出现在消散图上荧光 强度高的位置，血小板被尼罗蓝良好地染色。另一方面，采用尼罗蓝以外的其他色素的实验 例46 48，血小板集团集中在消散图上荧光强度低的位置，血小板的染色性不充分。由此可知，作为用于测定血小板的色素，采用尼罗蓝与采用其他色素相比，血小板 被良好染色。而且，采用尼罗蓝染色血小板时，通过前散射光强度与荧光强度可正确检出血 小板。其次，即使血液中存在脂质粒子等杂质时，采用含尼罗蓝及酸的实验例45的血小 板测定用试剂，可通过实验例9 13中记载的同样实验进行验证血小板与杂质能否区别检
出ο采用实验例45的血小板测定用试剂，测定含破碎红血球血液、含脂质粒子血液得 到的消散图，分别示于图20、图21。还有，在各图中，图(a)纵轴为前散射光强度，横轴为荧 光强度的消散图，图(b)为图(a)表示的消散图的纵轴变换成log的消散图，图(c)为图 (b)中的血小板出现的区域放大图。在图(c)中，血小板出现的区域用实线表示。如图20及图21所示，检体中含有的血小板集团，与破碎红血球或脂质粒子等检 体中的其他成分可明确区分，于消散图上出现。从该结果可知，本发明采用血小板测定用 试剂，即使血液中存在破碎红血球或脂质粒子等杂质，也可明确区分血小板，正确测定血小 板。本申请涉及2008年2月18日、3月26日及9月26日分别申请的日本国专利申请 特愿2008-36013、2008-79785及2008-247484号，这些申请的权利要求范围、说明书、附图 及摘要全部作为本说明书参考而列入。
2权利要求
血小板测定用试剂，其含有作为用于染色血小板的色素的用下列通式(III)表示的化合物FPA00001176808000011.tif
2.血小板测定用试剂盒，其包含含有作为用于染色血小板的色素的用下列通式(III)
3.按照权利要求2中所述的血小板测定用试剂盒，其中，上述第2试剂为pH6.0 11. 0 的缓冲液。
4.按照权利要求2中所述的血小板测定用试剂盒，其中，上述第2试剂具有150 600m0sm/kg的渗透压。
5.按照权利要求2中所述的血小板测定用试剂盒，其中，上述第2试剂还含有用于促进 上述色素染色血小板的染色促进剂。
6.按照权利要求5中所述的血小板测定用试剂盒，其中，上述染色促进剂为阳离子表 面活性剂。
7.血小板测定方法，该方法包括将含有作为用于染色血小板的色素的用下列通式 (III)表示的化合物的第1试剂与检体，在添加或不添加含缓冲剂的第2试剂下进行混合， 配制测定用试样的步骤；(III) 对得到的测定用试样中的细胞照射光，检测从该细胞发出的散射光及荧光的步骤；以及根据检出的散射光及荧光，检出测定用试样中含有的血小板的步骤。
8.按照权利要求7中所述的血小板测定方法，还含有计数检出的血小板的步骤。
9.血小板测定用试剂，其含有作为用于染色血小板的色素的用下列通式(II)表示的 化合物与酸， (II)(式中，X—表示选自HS04_、1/2S042_、C1_、及Cl 04_构成的组的阴离子)。
10.按照权利要求9中所述的血小板测定用试剂，其中，所述酸为无机酸。
11.按照权利要求9中所述的血小板测定用试剂，其中，上述色素与上述酸的摩尔浓度 比为10 1 1 1。
12.血小板测定用试剂盒，其包含含有作为用于染色血小板的色素的用下列通式(II)表示的化合物与酸的第1试剂 (Ii)(式中，乂_表示选自邯04_、1/25042_、(1_、及(1 04_构成的组的阴离子)；以及 含缓冲剂的第2试剂。
13.按照权利要求12中记载的血小板测定用试剂盒，其中上述第1试剂中的上述色素 与上述酸的摩尔浓度比为10 1 1 1。
14.血小板测定方法，该方法包括含有作为染色血小板的色素的用下列通式(II)表 示的化合物与酸的第1试剂与检体在添加或不添加含缓冲剂的第2试剂下进行混合，配制 测定用试样的步骤 (式中，X—表示选自把04_、1/25042_、(1_、及(104_构成的组的阴离子)； 对得到的测定用试样中的细胞照射光，检测从该细胞发出的散射光及荧光的步骤；以及根据检出的散射光及荧光，检出测定用试样中含有的血小板的步骤。
15.按照权利要求14中所述的血小板测定方法，还含有计数被检出的血小板的步骤。
全文摘要
本发明提供含尼罗蓝硫酸氢盐、或尼罗蓝与酸的血小板测定用试剂，含该血小板测定用试剂的试剂盒，以及采用它们的血小板测定方法。
文档编号G01N33/48GK101910839SQ20098010165
公开日2010年12月8日 申请日期2009年2月17日 优先权日2008年2月18日
发明者森山启子, 森悠丞, 竹下浩生, 铃木裕义 申请人:希森美康株式会社