专利名称：一种评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的方法。
背景技术：
斑是一种随着老化产生的色素沉着，往往形成于暴露在太阳下的皮肤区域。通常 认为斑是由长期反复暴露在阳光下造成的。据报道，在病灶皮肤位置的表皮角质形成细胞 中，一些在表皮黑色素细胞中激活黑色素合成的细胞因子的分泌物增加(非专利文献1 3)。至今，已报道了对于由紫外线引起的暂时性色素沉着的机理所进行的各种研究结 果(非专利文献4)。而另一方面，被认为是由紫外线照射导致的慢性大量色素沉着(例如 老年斑)的机理还未阐明。近年来，研究人员致力于慢性大量色素沉着的机理研究，对于老年斑进行了全面 基因表达分析研究(非专利文献5)，或使用人体色素皮肤组织对相关因素的鉴定进行研究 (专利文献1) 。已证明紫外线诱导的色素沉着和慢性大量色素沉着之间在某些功能性分子表达 方面存在区别。例如，已报道由于单剂量紫外线照射人体，IL-Ia基因表达增加(非专利 文献6)，而在老年斑病灶皮肤中IL-I α基因表达降低(非专利文献2)。此外，已发现单剂量紫外线照射和连续紫外线照射之间在功能性表达方式上存在 差别(非专利文献6)。因此，其明显表明，慢性大量色素沉着所涉及的机理不同于暂时性色 素沉着的机理。另外，老年斑等慢性大量色素沉着是随着老化而发展的，慢性大量色素沉着可能 产生于没有过度暴露在太阳下的皮肤区域中。因此，除了紫外线照射，其它因素也可能促使 老年斑产生(非专利文献7)。从而，需要指出老年斑等慢性大量色素的机理不同于由紫外线照射产生的暂时性 色素沉着的机理。ρ53基因是公知的肿瘤抑制基因。ρ53基因的活化涉及多种癌症的恶变、预后或转 移，这表明Ρ53在抑制恶性转变中起重要作用。近年来，已经确认阿片-促黑素细胞皮质素原(pro-opiomelanocortin，P0MC)基 因是P53转录目标。已报道p53通过激活POMC基因的转录，在紫外线照射引起的暂时性色 素沉着方面具有非常突出的作用，然而P53并不涉及基础色素沉着(非专利文献8)。在非 紫外线引起的大量色素沉着的几个实例中，观察到紫外线模拟P53活化也会导致大量色素 沉着，例如，用具有DNA损伤作用的足叶乙甙或5-氟尿嘧啶等药物进行的处理，这表明p53 也关系到非紫外线引起的色素沉着(非专利文献8)。另外，用于表皮的p53活化剂应该能有效治疗或预防增殖、癌前或紫外线诱导的 皮肤疾病(专利文献2)。然而，没有任何观察能够说明斑与p53活性、p53基因和p53基因的转录目标(以下，称为“p53目标基因”)、或它们的表达产物之间的关系。专利文献1 JP3943490专利文献2 JP1999-506755非专禾丨J 文献 1 Saishin Hifukagaku Taikei Vol. 8, Dyschromia, Nakayama ShotenCo. , Ltd非专利文献 2 =Kadono S.，et al. (2001) J. Invest. Dermatol. 116 :571_577非专利文献 3 =Hattori H.，et al. (2004) J. Inves. Dermatol. 122 1256—1265
非专禾Ij 文献 4 :Enk CD. , et al. (2004) Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 20 129-137非专利文献5 =Aoki H.，et al. (2007) Br. J. Dermatol. 156 1214-1223非专利文献6 =Seite S.，et al. (2004) Photochem. Photobiol. 79 :265_271非专利文献7 =Unver N.，et al. (2006) Br. J. Dermatol. 155 119-128非专利文献8 :Cui R.，et al. (2007) Cell 128,853-86
发明内容
因此，本发明提供以下内容1) 一种评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的方法，其包括对抑制表皮细 胞中的P53活性的物质进行评价，或者对抑制表皮细胞中的p53基因、p53目标基因或它们 的表达产物的表达水平的物质进行评价。2) 一种评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的方法，包括以下步骤(1) (4)(1)接触步骤，使测试物质接触表皮细胞，其中，该表皮细胞中具有P53活性，或者 具有在所述表皮细胞中表达的P53基因、p53目标基因或它们的表达产物。(2)测定步骤，测定表皮细胞中的p53活性，或者测定表皮细胞中的p53基因、p53 目标基因或它们的表达产物的表达水平。(3)比较步骤，将步骤(2)中测量的活性或表达水平与没有接触测试物质的对照 表皮细胞中的P53活性、或者没有接触测试物质的对照表皮细胞中的p53基因、p53目标基 因或它们的表达产物的表达水平进行比较。(4)选择步骤，基于在步骤(3)中获得的结果，选择测试物质作为对斑具有预防或 缓解作用的制剂，该测试物质抑制P53活性，或者抑制p53基因、p53目标基因或它们的表 达物质的表达水平。3)—种评价或选择用于调节SCF或内皮素-1表达的调节剂的方法，其包括对抑制 表皮细胞中的P53活性的物质进行评价，或者对抑制表皮细胞中的p53基因、p53目标基因 或它们的表达产物的表达水平的物质进行评价。4) 一种分析皮肤斑的状况的方法，其包括基于人体表皮细胞中的p53活性、或者 人体表皮细胞中的P53基因、p53目标基因或它们的表达产物的表达水平，来确定皮肤斑形 成的发展程度或缓解程度。
图1表示p53在人体皮肤组织中的表达。图2表示⑶KNlA (p21)基因、GADD45A基因和MDM2基因在人体表皮组织中的表达。图3表示用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的SCF(KITLG)基因和内皮素_1基因在培养 的表皮角质形成细胞中的表达水平变化。图4表示用pifithrin-α (PFT)处理的SCF(KITLG)基因和内皮素_1基因在培养 的表皮角质形成细胞中的表达水平变化。图5是表示与没用pifithrin-α (PFT)处理相比较，用pifithrin-α (PFT)处理 后的三维培养皮肤替代物中，黑色素含量变化的图表。图6表示与没用pifithrin- α (PFT)处理相比较，用pifithrin- α (PFT)处理后 的器官培养的光线性花瓣状色素斑的皮肤组织中，酪氨酸酶基因、SCF(KITLG)基因和内皮 素-1基因的表达水平变化。
具体实施例方式本发明提供一种评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的方法。该方法可以 实现可靠有效地筛选制剂的候补物质。本发明还提供一种分析斑状况的方法。本发明人对斑形成的详细机理进行了分子水平的研究，并发现在斑形成的皮肤 组织表皮细胞(角质形成细胞)中，ρ53基因、ρ53目标基因或它们的产物的表达水平大幅 增加；进而发现Ρ53活性、或者ρ53基因、ρ53目标基因或它们的产物的表达水平可用作评 价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的指标，或用作分析斑状况的指标。本发明可以实现可靠有效地评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂。本发明 还实现客观评价斑形成的发展程度或缓解程度。在此，所谓的术语“斑”通常不仅指老年斑，而且包括由于长期沉积在皮肤上出现 的褐色或深褐色的色素沉着点、或其它色素如黑色素。例如，可以列举出光线性花瓣状色素 斑(pigmentatio petaloidesactinica)、雀斑、漂斑禾口黄褐斑。众所周知“p53基因”作为肿瘤抑制基因，是癌症中最频繁突变的基因。P53基因的 表达产物发挥激活基因转录的转录因子的作用，其参与例如细胞周期调控、诱导凋亡、DNA 修复和细胞衰老。已知P53基因的异常导致p53目标基因量(失活)的降低，从而使细胞 恶性转变。p53目标基因有许多，例如包括参与DNA修复和细胞周期调控的GADD45A基因， 参与DNA修复的p53R2基因和XPC基因，参与细胞周期调控的CDKNlA (p21基因)、14-3-3 δ 基因和cdc25C基因，参与p53功能性调控的MDM2基因和细胞周期蛋白质G基因，参与细胞 凋亡的BAX基因、PUMA基因和PIG3基因。本发明的各个方法可以使用上述任意基因的表达产物，例如，p53蛋白质、Gadd45a 蛋白质、P53R2蛋白质、XPC蛋白质、p21蛋白质、Mdm2蛋白质和Bax蛋白质。在下述实施例中，从人体老年斑皮肤区域收集皮肤组织，进行p53蛋白质表达分 析时，在老年斑附近几乎没有观察到P53表达，而从老年斑的表皮中发现p53表达的大量 增加。另外，从健康男性的斑、斑附近(前臂外侧)或防晒区域(上臂内侧)的皮肤收 集表皮，进行P53目标基因的表达分析时，发现较之斑附近和防晒区域，p53目标基因如⑶ΚΝ1Α(ρ21)基因、GADD45A基因和MDM2基因在斑中的表达水平显著增加。用已知的p53活化剂5-氟尿嘧啶处理培养得到的人体表皮角质形成细胞，进行基 因表达分析时，发现SCF(KITLG)基因和内皮素-1基因的表达水平显著增加。然而，用p53 抑制剂pifithrin-α (PFT)处理细胞时，发现SCF(KITLG)基因和内皮素_1基因的表达水 平显著降低。将PFT加入由正常人体表皮细胞(角质形成细胞)和色素细胞(黑色素)组成的 三维培养皮肤替代物中时，皮肤替代物中黑色素的含量随着PFT处理呈浓度依赖性降低。 而将PFT加入人体光线性花瓣状色素斑器官培养组织中时，酪氨酸酶基因和SCF(KITLG)基 因的表达水平显著降低，酪氨酸酶基因和SCF(KITLG)基因在黑色素生成中起到 重要作用。 同样，内皮素-1基因表达也具有显著降低的趋势。已知SCF(干细胞因子)是C-kit受体 的配体，在造血干细胞等细胞的表面表达；而且SCF是膜结合生长因子，促进造血细胞的生 长和分化。近年来，已阐明了 c-kit不仅在造血细胞表面，而且在肥大细胞、黑色素细胞或 生殖细胞表面表达(J. Exp. Med.，183，2681-2686，1996)。最近还有报道，在转基因小鼠中， SCF表达仅仅在皮肤上，通过肥大细胞诱导和黑色素细胞的生长，黑色素生成增加(J.Exp. Med.，187，1565-1573，1998)。因此，SCF被认为与皮肤中黑色素过量生成有很大关系。2006年，报道了关于人体基因组中p53转录目标基因的综合研究结果(Cell，124， 207-219,2006)。该报道指出，确认了 SCF(KITLG)基因为新的p53目标基因，通过将5-氟尿 嘧啶加入HCT116细胞(例如，人体结肠癌细胞株)中来诱导SCF基因的表达水平。然而， P53和SCF在皮肤或表皮组织中的关系还未阐明。已知内皮素-1作为生成于表皮角质形成细胞的细胞因子，紫外线照射后内 皮素-1增加，其表明内皮素-1与表皮中黑色素的过量生成(Pigment Cell Res.，10， 218-228,1997)有很大关系。已证实上述细胞因子在慢性色素沉着病变中过表达，并且这些细胞因子显著促进 色素沉着(Am. J. Pathol.，165，2099-2109，2004)。上述发现表明，表皮细胞中的p53活性、或者表皮细胞中的p53基因、p53目标基 因或它们的表达产物的表达水平与慢性色素沉着的上游机制有很大关系，慢性色素沉着导 致斑形成。因此，这些数据表明，抑制P53活性或表达的物质可以用作对斑具有预防或缓解 作用的制剂，或用作调节SCF或内皮素-1表达的调节剂，并且基于p53活性、或者基于p53 基因、P53目标基因或它们的表达产物的表达水平，可以评价或选择对斑具有预防或缓解作 用的制剂、或调节SCF或内皮素-1表达的制剂。基于p53活性、或者基于p53基因、p53目 标基因或它们的表达产物的表达水平，可以分析皮肤中斑的状况(例如，斑形成发展程度 或缓解程度)。1)评价或选择对斑具有预防或缓解作用制剂的方法该方法选择一种物质作为候补，该物质抑制表皮细胞中的p53活性、或者抑制表 皮细胞中的P53基因、p53目标基因或它们的表达产物的表达水平。对于使用的表皮细胞没有特别限制，只要它源于动物的表皮细胞，并且该表皮细 胞中具有p53活性、或者p53基因、p53目标基因或它们的表达产物在该表皮细胞中表达。 优选较之正常表皮细胞，表皮细胞中的基因或蛋白质表达水平增加。所用的表皮细胞可以 包含于皮肤组织，或从皮肤组织分离得到，或源于正常的表皮细胞或建立的表皮细胞系的细胞(例如，HaCaT细胞)。表皮细胞的来源动物可以是非人类的动物(例如，啮齿动物如大鼠、小鼠或豚 鼠)，但优选人类。表皮细胞的来源组织可以列举出从活体组织手术切除的皮肤组织；从活体组织手 术切除、再移植入其它动物的皮肤组织，例如免疫缺陷小鼠；由表皮细胞和其它构成皮肤的 细胞组成的培养皮肤替代物；或者从免疫缺陷小鼠或其它动物再组成的皮肤。在此，“p53活性”表明蛋白质活性水平，可以列举出p53蛋白质激活目标基因转录 的能力，蛋白质改性例如磷酸化或乙酰化的能力。在此，“抑制P53活性的物质”是指一种进 行调控的物质，例如，如上所述，具有激活转录或蛋白质改性的能力的物质。在此，“抑制p53基因或p53目标基因表达水平的物质”是指一种对与构成p53基 因或p53目标基因的多核苷酸互补的mRNA的表达进行抑制、或促进mRNA降解的物质。“抑 制它们的表达产物的表达水平的物质”是指一种对P53基因或p53目标基因(例如，p53蛋 白质)表达产物的水平进行抑制、或促进表达产物降解从而抑制表达水平的物质。
具体而言，在本发明的评价或选择方法中，通过下列步骤，基于p53基因或p53目 标基因来选择候补物质。(Ia)接触步骤，使测试物质接触表皮细胞，其中，p53基因或p53目标基因在该表 皮细胞中表达。(2a)测定步骤，测定接触了测试物质表皮细胞中的p53基因或p53目标基因的表 达水平。(3a)比较步骤，将步骤(2a)中测量的表达水平与没有接触测试物质的对照表皮 细胞中的相应基因的表达水平进行比较。(4a)选择步骤，基于步骤(3a)中获得的结果，选择测试物质作为对斑具有预防或 缓解作用的试剂，该测试物质抑制P53基因或p53目标基因的表达水平。在步骤(Ia)中，表皮细胞接触测试物质可以采用如下步骤通过将测试物质溶解 在溶剂(例如，乙醇、DMSO或水)中，制备测试物质溶液(0. 0001 10w/v% )，接着将该溶 液(在使用前，适当稀释)用于表皮细胞或培养表皮细胞的培养基。可以采用公知方法检测或定量测定基因表达，如使用从上述组织中制备的RNA、或 从RNA转录的互补多核苷酸，进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。具体而言，在本发明的评价或选择方法中，通过下列步骤，基于p53基因或p53目 标基因表达产物的表达水平来选择候补物质。(Ib)接触步骤，使测试物质接触表皮细胞，其中，p53基因或p53目标基因的表达 产物在该表皮细胞中表达。(2b)测定步骤，测定表皮细胞中表达产物的表达水平。(3b)比较步骤，将步骤(2b)中测量的表达水平与没有接触测试物质的对照表皮 细胞中的相应基因的表达产物的表达水平进行比较。(4b)选择步骤，基于步骤(3b)中获得的结果，选择测试物质作为对斑具有预防或 缓解作用的试剂，该测试物质抑制表达产物的表达水平。在步骤(Ib)中，采用与上述步骤(Ia)类似的方法，进行表皮细胞和测试物质的接触。在步骤(2b)中，可以采用公知技术定量测定表达产物的表达水平，例如，使用识别表达产物的抗体(例如，抗P53抗体、抗p21抗体、抗Gadd45a抗体或抗Mdm2抗体)，进行 免疫印迹。如下所示进行免疫印迹使用识别表达产物的第一抗体和、与第一抗体结合并用 放射性同位素(例如，125I)、荧光物质或酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP))标记过的第二抗 体，再采用辐射仪、荧光检测器或类似仪器测量来自标记物质的信号。抗体可以是单克隆抗体或用表达产物作为免疫原制备的多克隆抗体。抗体可以是 保证识别表达产物的市售品，或通过动物(例如，大鼠或小鼠)免疫接种制备。具体而言，在本发明的评价或选择方法中，通过下列步骤，基于p53活性来选择候 补物质。(Ic)接触步骤，使测试物质接触具有P53活性的表皮细胞。(2c)测定步骤，测定表皮细胞中的p53活性。(3c)比较步骤，将步骤(2c)中测定的p53活性与没有接触测试物质的对照表皮细 胞中的P5 3活性进行比较。(4c)选择步骤，基于在步骤(3c)中获得的结果，选择测试物质作为对斑具有预防 或缓解作用的试剂的步骤，该测试物质抑制P53活性。在步骤(Ic)中，采用与上述步骤(Ia)类似的方法，进行表皮细胞和测试物质的接 触。在步骤(2c)中，可以通过公知技术定量测定p53活性。例如，使用对反映p53活 化的P53蛋白质改性进行识别的抗体(例如，抗磷酸化p53抗体或抗乙酰化p53抗体)，进 行免疫印迹。可以测定P53蛋白质中的一个或多个改性(磷酸化或乙酰化)位置，也可以 检测作为P53改性位置识别的各种改性位置。如下所示进行免疫印迹使用对反映p53活化的p53蛋白质改性进行识别的第一 抗体和、与第一抗体结合并用放射性同位素(例如，125I)、荧光物质或酶(例如，辣根过氧化 物酶(HRP))标记过的第二抗体，采用辐射仪、荧光检测器或类似仪器测量来自标记物质的信号。抗体可以是单克隆抗体或用上述改性蛋白质作为免疫原制备的多克隆抗体。抗体 可以是保证识别上述改性位置的市售品，或通过动物(例如，大鼠或小鼠)免疫接种制备。在步骤(2c)中，可以通过其它公知技术，进行p53活性的定量测定，例如，采用从 具有P53活性表皮细胞中提取的细胞提取物和含有特异结合p53的序列并用放射性同位素 (例如，32P)或荧光物质标记过的DNA片段，进行凝胶转移测定。进行凝胶转移测定的过程如下所示将从具有P53活性的表皮细胞中提取的细胞 提取物与含有特异结合P53序列并用放射性同位素(例如，32p)或荧光物质标记过的DNA片 段混合；培养混合物，再将该混合物用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；采用辐射仪、荧光检测 器或类似仪器测量来自标记物质的信号。从文献或现有数据库可以获得特异结合p53的序列。可以通过传统的公知技术制 备DNA片段。在步骤(2c)中，可以通过其它公知技术，进行p53活性的定量测定，例如，在具有 P53活性的表皮细胞中引入报告基因(质粒)，该报告基因具有含有结合p53序列的表达启 动子，进行报告基因试验。
进行报告基因试验的过程如下所示在具有p53活性的表皮细胞中引入报告基因 (质粒)，该报告基因具有基因表达酶，例如萤火虫荧光素酶，和含有结合P53序列的表达启 动子；通过检测器测定荧光密度或由于酶促反应产生的颜色变化。报告基因(质粒)可以通过传统的公知技术制备。如上所述，基于定量测定的p53活性、或定量测定的p53基因、p53目标基因的表 达水平或它们的表达产物的表达水平，可以选择测试物质作为抑制P53活性、或者抑制p53 基因、P53目标基因或p53蛋白质的表达水平的物质。具体而言，当较之对照表皮细胞中相 应的活性或表达水平，已测定的P53活性或表达水平被显著抑制时，选择测试物质作为抑 制P 53活性或p53表达的物质。2)分析斑状况的方法根据本发明的分析斑状况的方法，可以如下所示来分析斑的状况，例如，如果观察 到斑中的活性或表达水平比正常表皮细胞中相应的活性或表达水平高的话，测定该斑位置 处的表皮细胞中是否有P53活性、或者p53基因、p53目标基因或它们的表达产物的表达水 平。将正常皮肤位置用作对照，该正常皮肤位置可以是斑附近位置，也可以是防晒的位置， 以及可以是具有相对较少斑的位置。具体而言，当斑点位置处的表皮细胞中的p53活性、或者斑点位置处的表皮细胞 中的P53基因、p53目标基因或它们的表达产物的表达水平高于正常位置(对照)表皮细 胞中相应的活性或表达水平时，可以测定皮肤上斑形成的发展程度或缓解程度，从而可以 分析皮肤斑的状况。用于分析的测试样品可以是通过皮肤切片(例如，钻取活组织检查)得到的皮肤 组织，或通过例如吸疱法得到的表皮组织。测试样品可以是通过例如酶处理或热处理，从收 集的皮肤组织中分离得到的表皮组织，或可以来源于收集得到的皮肤或表皮组织的器官培 养物。即，测试样品可以是从皮肤或表皮组织分离得到的表皮细胞，或适当培养得到的表皮 细胞。实施例实施例1在本实施例中，通过免疫组织化学法分析在人体皮肤组织中的p53表达。从有老年斑的人体皮肤收集皮肤组织，制备组织的石蜡切片。除去石蜡后，在 REAL 目标修复溶液(Target Retrieval Solution，DAKO产品)中95°C下热处理每个组 织切片45分钟，从而激活抗原。室温下冷却30分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗组织切 片，然后后用0.3% H2O2溶液处理30分钟。用PBS冲洗后，用10%正常山羊血清(Nichirei Bioscience产品)室温下封闭组织切片1小时，然后在组织切片中加入已用封闭液稀释 100倍的小鼠抗人体P53抗体(D0-7，DAKO产品)(第一抗体)，接着，将切片在4°C下静置 一晚。用PBS冲洗后，将过氧化物酶标记过的抗小鼠IgG多克隆抗体(Fab’ ) (Nichirei Bioscience产品)(第二抗体)加入组织切片，接着在室温下静置切片30分钟。用PBS冲 洗后，通过用HistoMark TrueB lue Peroxidase System(KPL产品)使组织切片进行酶 促反应。观察颜色变化后，加水终止反应，接着用NUCLEAR FAST RED (Vector Laboratories 的产品)使组织切片复染。用自来水冲洗10分钟后，用甘油和盖玻片密封染色后的组织切 片，通过显微镜和成像装置(Carl Zeiss的产品)得到染色后组织图像。
如图1所示，在老年斑附近位置几乎没有观察到p53表达，而在老年斑位置的表皮中观察到P53表达水平大幅增加(染蓝色位置)。实施例2在本实施例中，分析人体表皮组织中p53目标基因的表达。首先，按照吸疱法，从健康男性成人皮肤得到斑位置、斑位置附近(前臂外侧)、或 防晒区域(上臂内侧)的表皮。具体而言，消毒每个试验位置，用1.0 2. 5mm直径的注射 器(Terumo Corporation产品)接触皮肤表面，接着通过泵抽吸大约1 2小时，从真皮中 分离得到表皮。用消毒剪刀隔离分离后的表皮，制备源于试验体的样品。用PBS冲洗已制备的表皮组织样品，再转移进含有RNAlater (QIAGEN产品)的 试管中(ImL)，接着在4°C下静置一晚。之后，用PBS冲洗组织切片，采用RNeasy微试剂盒 (QIAGEN产品)按照惯用方法制备总RNA。使合成的RNA溶液的等分试样(Iyg)逆转录，从而合成cDNA。按照惯用方法， 米用用于 RT-PCR 的 SuperScript III First-Strand SynthesisSystem(Invitrogen Corporation产品)和Peltier热循环仪(MJ Research, Inc.产品)进行逆转录。按照定量PCR，使用TaqMan探针，将上述合成得到的cDNA用于基因表达分析。 TaqMan 基因表达分析产品(ρ/Ν 4331182) (AppliedBiosystems产品)用于检测ρ53 目标基因的特异性探针和引物。通过标准曲线法直接定量每个基因的表达水平，再用内部 对照标准基因RPLPO (检测编号Hs99999902_ml)的表达水平校正每个基因的表达水平。 在常规条件下通过序列检测器进行反应(ABI PRISM 7500RealTime PCR System, Applied Biosystems 产品)。具体而言，在本实施例中，测定CDKNlA (p21)基因(检测编号Hs00355782_ml)、 GADD45A基因(检测编号Hs00169255_ml)和MDM2基因(检测编号Hs01066938_ml)的表 达水平。这些基因是通常公知的p53目标基因。用于测量这些基因的表达水平的探针和引物可以是用于基因表达定量分析的市 售品。针对目标基因的探针和引物可以是设计制备的。具体而言，这样的基因特异性探针和 引物可以是基于从数据库获得的基因序列数据，用设计软件(例如，引物设计软件(Primer Express) (Applied Biosystems 产品))设计的。如图2所示，作为公知的p53目标基因的⑶KNlA(p21)基因、GADD45A基因或MDM2 基因在斑的位置处显著增加。实施例3从Kurabo Industries Ltd.购买源于新生儿包皮的人体表皮细胞，在37°C、5% (v/v) CO2气氛下，在无血清基础生长培养基(EpiLife，KuraboIndustries Ltd.产品)中预 培养。将预培养的表皮细胞接种进6孔培养板(Falcon产品)(1. OX IO5细胞/孔)。24小 时之后，在不包含BPE(牛垂体腺提取物)和hEGF(人体表皮生长因子)的生长培养基中培 养细胞。24小时之后，加入通常公知的p53活化剂5-氟尿嘧啶(5-FU，Calbiochem产品)，其 浓度为1 10μ g/mL。处理48小时后，用TRIzol 试剂(Invitrogen Corporation产品) 提取总RNA。具体而言，用PBS冲洗培养板每个孔，在孔中加入TRIzol 试剂(ImL)。将该混 合物倒入1. 5mL试管中，在其中加入氯仿(200 μ tL)，将混合物彻底搅拌，接着以15，OOOrpm 转速离心15分钟。将由此产生的上层液体转移进干净的1.5mL试管中，在其中加入异丙醇；接着，搅拌，以12，OOOrpm转速离心10分钟。抽出上层清液，在沉淀中加入75%乙醇(ImL)； 接着，以8，500rpm转速离心5分钟。通过抽吸除去上层清液，将沉淀溶解在dH20中(15 30口1^)，制备总1 ·。使如上所述提取得到的总RNA逆转录，从而合成cDNA，通过定量PCR，使用TaqMan 探针，将这样合成的cDNA用于基因表达分析。在本实施例中，具体而言，测定SCF(KITLG) 基因(检测编号Hs00241497_ml)和内皮素_1基因(检测编号Hs00174961_ml)的表达水 平。本实施例中所用的基因表达分析的详细步骤与实施例2中的步骤相似。如图3所示，在培养的表皮细胞中，通常公知的p53活化剂5-氟尿嘧啶(5_FU)显 著诱导SCF(KITLG)基因或内皮素-ι基因的表达。实施例4从Kurabo Industries Ltd.购买源于新生儿包皮的人体表皮细胞，在37°C、5% (v/v)CO2气氛下，在无血清基础生长培养基(EpiLife，KuraboIndustries Ltd.产品)中 预培养。将预培养的表皮细胞接种进6孔培养板(Falcon产品)(1. OX IO5细胞/孔)。24 小时之后，在不包含BPE(牛垂体腺提取物)和hEGF(人体表皮生长因子)的生长培养基 中培养细胞。24小时之后，加入通常公知的p53抑制剂pifithrin-α (PFT，Calbiochem产 品)，其浓度为1 10 μ Μ。培养24小时后，用TRIzol 试剂(Invitrogen Corporation 产品)提取总RN A。使如此提取得到的总RNA进行逆转录，从而合成cDNA，通过定量PCR， 使用TaqMan探针，将这样合成的cDNA用于基因表达分析。在本实施例中，具体而言，测定 SCF(KITLG)基因和内皮素-1基因的表达水平。本实施例中所用的基因表达分析的详细步 骤与实施例2或3中的步骤相似。如图4所示，在培养的表皮细胞中，通常公知的p53抑制剂pifithrin-α (PFT)使 SCF(KITLG)基因或内皮素-ι基因表达显著降低。实施例5从Kurabo Industries Ltd.购买三维培养皮肤模型(MEL-300A)。拿到产品后马上 将组织杯转移进6孔培养板(Falcon产品)，在37°C、5% (v/v) CO2气氛下，在长期维持培养 基(ΕΡΙ-100-ΝΜΜ-113,KuraboIndustries Ltd.产品)(ImL)中培养一夜。之后，加入通常的 P53抑制剂pifithrin-α (PFT)；接着,培养14天。在灭菌不锈钢垫圈(KuraboIndustries Ltd.产品)中静置组织杯，并使用长期维持培养基(5mL)进行培养。每三天换培养基。培 养后，用镊子从组织杯中取出皮肤组织，用PBS冲洗三次，用5% (v/v)三氯乙酸冲洗一次， 用乙醚和乙醇的混合物(体积比1 3)冲洗一次。将洗涤后的皮肤组织在50°C下培养2 小时，使组织干燥。将该组织溶解于2N氢氧化钠水溶液中(2N) (200 μ L)，以15，OOOrpm转 速离心15分钟。回收培养物上层清液，在405nm处测量吸光度，计算组织中的黑色素含量。 图5表示对照中的相对黑色素含量(100% )。如图5所示，pifithrin-α (PFT)(例如，通常公知的ρ53抑制剂)以PFT剂量依 赖性的方式降低三维培养皮肤模型中的黑色素含量。实施例6通过St印hens&Associates(Carrollton，TX)合约实验室，募集有斑的受试 者。一名负责实验室的皮肤科医生用活组织检查环钻(直径4mm)从两名56岁白人 女性受试者的肩膀(每个受试者两个位置)收集有光线性花瓣状色素斑的皮肤组织样品。将收集到的皮肤活检样品浸入DMEM培养基(Dulbecco，s Modifed Eagle，Medium)， 使其保持在4 10°C运送至美国生物科学实验室辛辛那提分部。收集到有光线性花瓣 状色素斑的皮肤组织样品后24小时内，用一次性手术刀将每个样品切成两半。一半样 品在含有10 μ Mpifithrin- α (PFT) (ρ53抑制剂)的DMEM中器官培养，另一半在不含 pifithrin-α (PFT)的 DMEM 中器官培养。切开胶原海绵(Avitene Ultrafoam，MedChem 产 品，Inc.Woburn，ΜΑ)，使其内部成为良好的器官培养皿(BD Bioscience (San Jose, CA)), 在海绵中心开孔(直径3mm)。将光线性花瓣状色素斑组织样品放入孔中，使样品表面与海 绵表面齐平后，实施器官培养。器官培养皿的外部孔充满PBS(5mL)，在37°C、5% CO2气氛 下在培养箱中进行器官培养。实施器官培养后24小时、48小时更换培养基。实施器官培 养后72小时，用70°C热水处理光线性花瓣状色素斑组织样品1分钟，从RNAlater (Qiagen， Valencia, CA)中只回收表皮。
用RNeasy微试剂盒(Qiagen)提取总RNA，按照惯用方法，用ThermoScript RT-PCR Systems(Invitrogen, Carlsbad, CA)合成 cDNA。从TaqMan 基因表达试验(Applied Biosystems)得到酪氨酸酶mRNA、SCF (KITLG) mRNA和内皮素-ImRNA的特异性探针(检测 编号Hs00165976_ml，Hs00241497_ml 和 Hs00174961_ml)，通过 ABIPRISM 7300 序列检测系 统(Applied Biosystems)进行实时定量RT-PCR。用内部对照标准基因RPLPO(检测编号 Hs99999902_ml)校正每个基因的表达水平。相对于对照斑样品中基因的表达水平(作为 1)，计算PFT处理后的斑样品中每个基因的表达水平。如图6所示，通过抑制p53，显著降低酪氨酸酶基因或SCF(KITLG)基因的表达，内 皮素-1的表达趋向显著降低。
权利要求
一种评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的方法，其包括对抑制表皮细胞中的p53活性的物质进行评价，或者对抑制表皮细胞中的p53基因、p53目标基因或它们的表达产物的表达水平的物质进行评价。
2.一种评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的方法，其包括以下步骤(1) (4)(1)接触步骤，使测试物质接触表皮细胞，其中，所述表皮细胞中具有P53活性，或者具 有在所述表皮细胞中表达的P53基因、p53目标基因或它们的表达产物；(2)测定步骤，测定表皮细胞中的p53活性，或者测定表皮细胞中的p53基因、p53目标 基因或它们的表达产物的表达水平；(3)比较步骤，将步骤(2)中测量的活性或表达水平与没有接触测试物质的对照表皮 细胞中的P53活性、或者没有接触测试物质的对照表皮细胞中的p53基因、p53目标基因或 它们的表达产物的表达水平进行比较；(4)选择步骤，基于步骤(3)中获得的结果，选择抑制p53活性的测试物质、或者抑制 p53基因、p53目标基因或它们的表达物质的表达水平的测试物质作为对斑具有预防或缓 解作用的制剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，p53目标基因为选自GADD45A基因、 ⑶ΚΝ1Α(ρ21)基因和MDM2基因中的至少1种基因。
4.一种评价或选择用于调节SCF或内皮素-1表达的调节剂的方法，其包括对抑制表皮 细胞中的P53活性的物质进行评价，或者对抑制表皮细胞中的p53基因、p53目标基因或它 们的表达产物的表达水平的物质进行评价。
5.一种分析皮肤斑的状况的方法，其包括通过比较人体表皮细胞中的p53活性、或者 人体表皮细胞中的P53基因、p53目标基因或它们的表达产物的表达水平与对照表皮细胞 中的P53活性、或者对照表皮细胞中的p53基因、p53目标基因或它们的表达产物的表达水 平，确定皮肤斑形成的发展程度或缓解程度。
全文摘要
本发明提供一种评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的方法。该方法实现可靠有效地筛选制剂的候补物质，预测斑形成，分析皮肤斑的状况。本发明的评价或选择对斑具有预防或缓解作用的制剂的方法，包括对抑制表皮细胞中的p53活性的物质进行评价，或者对抑制表皮细胞中的p53基因、p53目标基因或它们的表达产物的表达水平的物质进行评价。
文档编号G01N33/50GK101971025SQ20098010791
公开日2011年2月9日 申请日期2009年1月29日 优先权日2008年3月6日
发明者八谷辉, 天野恭子, 村瀬大树 申请人:花王株式会社