标记糖链的方法

专利名称：标记糖链的方法
技术领域：
本发 明涉及有效分离并标记包含在生物样品中的糖链的方法。
背景技术：
生物聚合物，例如糖链、糖蛋白、糖肽、肽、寡肽、蛋白质、核酸和脂质等在包括医药 科学、细胞工程和组织工程等的生物技术领域发挥重要的作用，因此可以理解，阐明这些物 质控制生物反应的机理将有助于生物技术领域的发展。其中，糖链是高度通用的一类物质，并与自然生物所具有的多种功能相关。已知糖 链是生物体的重要组分之一，其在体内通常以复合糖(glycoconjugate)的形式存在，并与 蛋白质和脂质结合。现已逐渐阐明，糖链与细胞间通讯的体内调控，以及蛋白质的功能和相 互作用密切相关。注意，本文所述的糖链是指单糖，例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、N-乙酰 葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸，或这些单糖的衍生物通过糖苷键相互结合而形成的链 状分子的统称。具有糖链的生物聚合物的实例有构成植物细胞，有助于稳定细胞的蛋白多糖； 影响细胞分化、增殖、粘附和迁移等的糖脂；以及与细胞间相互作用和细胞识别相关的糖蛋 白。基于对生物聚合物的功能取代、辅助、扩增、调控或抑制，对包含在这些生物聚合物中的 糖链所进行的复杂而精确控制的机制已逐渐清晰明确。如果进一步揭示糖链与分化、增殖、 细胞粘附、免疫性以及致瘤性转化的关系，预期能够通过将此糖链工程与医药科学、细胞工 程或组织工程结合来进行新的研发。在糖蛋白药物中，糖链通常在生物活性的表达中发挥重要作用。因此，作为糖蛋白 药物质量控制的参数，对糖链的评估特别重要。特别是在抗体药物领域中，由于曾报道糖链 的结构决定抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性)，因而进一步提高了糖链结构分析的重要性。因此，目前需要以快速、简单且精确的方式分析糖链结构的技术，并且通过各种方 法进行糖链分析，包括高效液相色谱(HPLC)、核磁共振、毛细管电泳(CE法)、质谱分析和凝 集素芯片检测方法(lectin array method)等。为了使用这些技术进行糖链分析，必须首先从包含在生物样品中的蛋白质、肽、月旨 质和核酸等分离纯化糖链。尽管HPLC和CE由于其高分辨率、良好的重复性和定量性以及 其高敏感度而被广泛使用，但为了实现高敏感度的目标，通常必须首先通过还原胺化反应 标记糖链的还原性末端。然而，对糖链进行纯化和标记需要时间和多个步骤，因此，难以一 次制备大量的样品。用于解决上述问题的技术的实例，如在专利文献1中描述的通过使用特异性糖链 捕获物质实现的样品制备方法。[专利文献 1]W0 2OO8An8I7O

发明内容
如上所述，糖链的分离、纯化和标记需要时间和多个步骤。尽管已经使用了利用离 子交换树脂、反相层析、活性碳和凝胶过滤色谱等技术来分离纯化糖链，但是这些用于分离 的技术并非设计用于特异性地识别糖。因此，杂质(肽或蛋白质等)的并入不可避免。此 夕卜，糖链的结构导致回收率经常存在差异。此外，为了标记糖链，还必须将纯化步骤后获得 的糖链彻底干燥，因此，完成从纯化到标记的一系列操作需要数天的时间。本发明的目的是提供一种以简便的方式从生物样品纯化糖链，并对其进行标记的 方法。

本发明如下所述(1) 一种用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法，其包括(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中，所述糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的 糖链的物质；(c)从所述糖链捕获物质释放糖链；和(d)标记该释放的糖链，其中，步骤(a)、(C)和(d)在同一反应容器中连续进行。(2) 一种用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法，其包括(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中，所述糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的 糖链的物质；(b)清洗该捕获了糖链的糖链捕获物质；(c)从所述糖链捕获物质释放糖链；和(d)标记该释放的糖链，其中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)在同一反应容器中连续进行。(3)如(1)或(2)所述的糖链标记方法，其中在步骤(a)中，所述糖链捕获物质是 具有能够特异性地与所述糖链的醛基基团进行反应的官能团的载体。(4)如(3)所述的糖链标记方法，其中所述官能团是酰胼基团或氨氧基基团 (aminoxy group)0(5)如(4)所述的糖链标记方法，其中所述糖链捕获物质具有下式1所示的交联聚 合物结构
权利要求
1.一种用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法，其包括(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中，所述糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的糖链 的物质；(c)从所述糖链捕获物质释放糖链；和(d)标记该释放的糖链，其中，步骤(a)、(c)和⑷在同一反应容器中连续进行。
2.一种用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法，其包括(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中，所述糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的糖链 的物质；(b)清洗该捕获了糖链的糖链捕获物质；(c)从所述糖链捕获物质释放糖链；和(d)标记该释放的糖链，其中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)在同一反应容器中连续进行。
3.如权利要求1或2所述的糖链标记方法，其中在步骤(a)中，所述糖链捕获物质是具有特异性地与所述糖链的醛基基团进行反 应的官能团的载体。
4.如权利要求3所述的糖链标记方法，其中所述官能团是酰胼基团或氨氧基基团。
5.如权利要求4所述的糖链标记方法，其中所述糖链捕获物质具有下式1所示的交联 聚合物结构
6.如权利要求5所述的糖链标记方法，其中所述糖链捕获物质具有下式2所示的交联 聚合物结构
7.如权利要求1-6中任一项所述的糖链标记方法，其中所述步骤(c)具有对所述糖链 捕获物质进行酸处理的工序。
8.如权利要求1-7中任一项所述的糖链标记方法，其中所述步骤(a)和(c)包括蒸发 反应溶剂的工序。
9.如权利要求1-8中任一项所述的糖链标记方法，其中在所述步骤(d)中，使用具有氨 基基团的化合物标记所述糖链。
10.如权利要求9所述的糖链标记方法，其中该使用具有氨基基团的化合物标记所述 糖链的工序是通过还原胺化反应进行的。
11.如权利要求9或10所述的糖链标记方法，其中所述具有氨基基团的化合物具有 UV-可见光吸收特征或荧光特征。
12.如权利要求9-11中任一项所述的糖链标记方法，其中所述具有氨基基团的化合物 选自8-氨基芘-1，3，6-三磺酸盐、8-氨基萘-1，3，6-三磺酸盐、7-氨基-1，3-萘二磺酸、 2-氨基-9(10H)_吖啶酮、5-氨基荧光素、丹磺酰乙二胺、2-氨基吡啶、7-氨基-4-甲基香豆 素、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、7-氨基-1-萘酚、3-(乙酰氨基)-6-氨 基吖啶、2-氨基-6-氰基乙基吡啶、ρ-氨基苯甲酸乙酯、P-氨基苄腈和7-氨基萘-1，3- 二 磺酸中的至少一个。
13.—种检测糖链的方法，其包括检测通过权利要求1-12中任一项所述的糖链标记方 法标记的糖链。
14.一种分离糖链的方法，其包括分离通过权利要求1-12中任一项所述的糖链标记方 法标记的糖链。
全文摘要
本发明涉及用于标记包含在生物样品中的糖链的糖链标记方法，其目的在于简化从生物样品分离糖链并对其进行标记的工序，所述方法包括(a)将糖链捕获到糖链捕获物质中，该糖链捕获物质是特异捕获生物样品中的糖链的物质；(b)清洗该捕获了糖链的糖链捕获物质；(c)从所述糖链捕获物质释放糖链；和(d)标记该释放的糖链，其中，步骤(a)、(b)、(c)和(d)在同一反应容器中连续进行。
文档编号G01N30/88GK102144164SQ200980115430
公开日2011年8月3日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年4月30日
发明者仓本洋光, 岛冈秀行, 阿部碧 申请人:住友电木株式会社