专利名称：使用三齿配体的成像技术的制作方法
使用三齿配体的成像技术本发明主要涉及显微术领域，具体而言，涉及用于活细胞的非侵入式成像和编图 (map)的时间分辨发射成像显微术(TREM)。认识支撑生物体系的化学过程依赖能够对生物过程进行实时非侵入式监测的技术和理念的发展。荧光显微术是生物科学中使用最为广泛的工具之一，其优点在于敏锐的灵敏度，优异的空间分辨率，以及出众的时间分辨率。该技术使得研究宽度可以从单分子的交互作用到整个有机体研究，并依赖从内源性荧光团或外部荧光探针发出的光来监测局部环境和其中的变化。在强度、波长和寿命这三个基本发射参数中，迄今为止绝大多数的荧光成像研究均基于发射强度的空间变化或基于波长变化。相反，基于寿命的方法仍然未得到充分地开发。然而基于寿命的传感和成像是对常用方法的有力补充。主要的优点是发射寿命通常不依赖于浓度并能够得到绝对校准，而不像强度测量会具有因光输送和探测的效率波动而造成的误差。近来在荧光寿命探测技术中的进展已经使得荧光寿命成像显微术(FLIM)成为现实。迄今为止，FLIM主要基于如芳族氨基酸色氨酸等内源性分子，以及基于包括GFP标记蛋白和荧光素衍生物在内的荧光染料，所有这些物质的寿命均为几纳秒。较短的寿命使亚纳秒光源和快速探测器成为必要，因为(i)需要在亚纳秒时间尺度内分辨出相对较小的变化；和(ii)还必须以纳秒时间尺度从天然生物生色团发出的自体荧光中区分出试剂的荧光。使用较长时间尺度(即几百纳秒至微秒)的时间分辨发射成像显微术(TREM) 的发展是一个重要的进展。较长的时间尺度通过较大的寿命变化并通过使时间门控 (time-gated)实验能够区分出寿命较短的自体荧光来提供较高的辨识度。TREM不需要快速的激发或探测方法；相反，能够以纳秒激光器和慢速门控探测器执行该技术。迄今为止，阻碍实用性TREM发展的限制性因素已经是化学而非光学技术。主要的限制是缺乏这样的发光探针其具细胞渗透性，无毒性，且于室温以上在加气水性介质中的寿命超过约 IOOns0大部分磷光有机分子由于其通常寿命较长的三重态的高效淬灭而在此种条件下不能使用。某些过渡金属络合物可以以超过IOOns的寿命从三重激发态进行有效发射，因为从形式上，自旋禁—T1跃迁通过与重金属原子有关的自旋轨道耦合而得到促进。近来使用钌(II)和铼⑴络合物已经获得了稳态的细胞图像。然而还需要探查时间维度。虽然已经报道了采用电中性钼卟啉的成功的时间门控细胞成像，但是约 οομ S的较长激发态寿命导致严重的氧淬灭并因而导致细胞毒性。本发明旨在解决至少部分与现有技术有关的问题。因此，本发明提供了一种具有三齿配体的过渡金属络合物在成像技术中的应用。现将进一步描述本发明。下文中将更详细地限定本发明的不同方面/实施方式。 除非清楚地做出相反的说明，否则如此限定的各方面/实施方式可以与任何其它(多个) 方面/实施方式组合。特别是，描述为优选或有利的任何特征可以与描述为优选或有利的任何其它(多个)特征组合。
所述过渡金属络合物可用作示踪剂，例如作为细胞内的示踪剂。所述过渡金属络合物可以在体内或体外导入细胞中。所述过渡金属络合物可以与导入细胞内的化学物种进行预结合。该化学物种可以是生物分子。该化学物种可以包括，例如蛋白质、抗体、DNA、RNA、抗原或病毒。所述过渡金属络合物可以与细胞内的活性部位结合以标记出至少部分细胞结构。 所述活性部位包括，例如细胞内的核酸活性部位，优选为RNA和/或DNA活性部位。该活性部位可位于细胞的细胞核内或核仁内，或位于其它亚细胞结构或膜内。该络合物不一定只用于细胞。其可用来与细胞外活性部位结合，如从细胞中提取的或合成的核酸、RNA和/或 DNA。所述过渡金属络合物的发光量子产率优选为0. 6以上，更优选为0. 65以上，最优选为0.7以上。过渡金属优选是正方平面配位。三齿配体优选是指配体在三个配位点与过渡金属进行配位。所述过渡金属优选是钼。钼络合物优选是Pt(n)络合物。所述钼络合物优选是电中性的。有利的是，所述钼络合物具有式Pt[L]X，其中L是三齿配体而X为单齿配体。三齿配体(L)优选是环金属化配体。该三齿配体(L)优选经由N~C~N配位点而与过渡金属配位。在特别优选的实施方式中，三齿配体(L)是1，3_ 二吡啶基)苯或其衍生物。 三齿配体(L)优选是在4'位上进行取代的1，3_ 二(2-吡啶基)苯衍生物。可以使用已知技术，例如Williams JAG, Beeby A, Davies ES, Weinstein JA, WiIsonC(2003)An alternative route to highly luminescent platinum(II)complexes eyelometalation with N"C"N-coordinating dipyridylbenzene ligands. Inorg Chem42 8609-8611中描述的技术来合成该络合物。论及三齿配体(L)，其优选取代有(最优选在4'位)生物靶向官能团 (functionality)或适于反应性地连接该衍生物与生物靶向官能团的连接基团。例如，该连接基团可以是酰胺基或酯基。该络合物中的X优选是单齿π供体配体。在特别优选的实施方式中，所述过渡金属络合物具有下式
权利要求
1.具有三齿配体的过渡金属络合物在成像技术中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述过渡金属络合物用作示踪剂。
3.如权利要求2所述的应用，其中，所述过渡金属络合物用作细胞中的示踪剂。
4.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物在体外或体内导入细胞中。
5.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物与导入细胞中的化学物种进行预结合。
6.如权利要求5所述的应用，其中，所述化学物种为蛋白质、抗体、DNA、RNA、抗原或病
7.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物与细胞内的活性部位结合以标记出至少部分细胞结构。
8.如权利要求7所述的应用，其中，所述活性部位为细胞内的核酸活性部位，优选为 RNA和/或DNA活性部位。
9.如权利要求7或8所述的应用，其中，所述活性部位位于细胞的细胞核或核仁内。
10.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物的荧光发射量子产率为0.6以上，更优选为0. 65以上，最优选为0.7以上。
11.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属是正方平面配位。
12.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属是钼。
13.如权利要求12所述的应用，其中，所述钼络合物是Ptai)络合物。
14.如权利要求12或13所述的应用，其中，所述钼络合物是电中性的。
15.如权利要求12 14中任一项所述的应用，其中，所述钼络合物具有式Pt[L]X，其中L是三齿配体，X为单齿配体。
16.如权利要求12 15中任一项所述的应用，其中，所述三齿配体(L)是环金属化配体。
17.如权利要求15或16所述的应用，其中，所述三齿配体(L)经由N~C~N配位点而与所述过渡金属配位。
18.如权利要求15 17中任一项所述的应用，其中，所述三齿配体(L)是1，3_二 (2-吡啶基)苯或其衍生物。
19.如权利要求18所述的应用，其中，所述三齿配体(L)是在4'位上进行取代的1， 3-二(2-吡啶基)苯衍生物。
20.如权利要求15 19中任一项所述的应用，其中，所述三齿配体(L)取代有生物靶向官能团或适于反应性地连接所述衍生物与生物靶向官能团的连接基团，所述取代优选在 4'位上。
21.如权利要求20所述的应用，其中，所述连接基团是酰胺基或酯基。
22.如权利要求15 21中任一项所述的应用，其中，X是单齿π供体配体。
23.如权利要求15 22中任一项所述的应用，其中，所述过渡金属络合物具有下式
24.如权利要求23所述的应用，其中，X是Cl、Br、F或0H。
25.如权利要求M所述的应用，其中，X是Cl。
26.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述成像技术包括显微术。
27.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述成像技术包括光子成像。
28.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述成像技术包括荧光显微术。
29.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述成像技术包括荧光寿命成像显微术(FLIM)、时间分辨发射成像显微术(TREM)、多光子激发(MPE)、双光子激发显微术(TPE)、 福斯特共振能量转移显微术(FRET)、落射荧光显微术或共焦稳态显微术、光激发激光显微术(PALM)、时间分辨各向异性成像显微术(TRAIM)或这些技术中两种以上的组合。
30.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述技术用来观测发射寿命。
31.如权利要求30所述的应用，其中，在至少100纳秒、更优选1微秒、最优选至多1000 微秒的时间段内观测所述发射寿命。
32.如前述权利要求中任一项所述的应用，其中，所述技术用来对活细胞进行成像和/ 或编图，和/或原位标记RNA。
33.如前述权利要求中任一项所述的应用，所述应用还包括1)将所述络合物添加至细胞；2)可选地对所述细胞进行温育；和3)进行成像步骤以确定所述络合物在所述细胞中的位置。
34.如权利要求33所述的应用，其中，在将所述络合物添加至细胞的步骤之前，使所述络合物与化学物种连接。
35.如权利要求33或34所述的应用，其中，将所述络合物添加至细胞的所述步骤包括使所述络合物扩散入细胞中的步骤。
36.如权利要求33 35中任一项所述的应用，其中，所述可选的温育步骤进行1分钟 30分钟，更优选为2分钟 20分钟，最优选为约5分钟。
37.一种具有三齿配体的过渡金属络合物，所述过渡金属络合物与生物分子结合。
38.如权利要求37所述的过渡金属络合物，其中，所述络合物经由所述配体与生物分子结合。
39.如权利要求37或38所述的过渡金属络合物，其中，所述生物分子是蛋白质、抗原、 病毒、DNA、RNA或抗体。
40.具有三齿配体的过渡金属络合物作为示踪剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种显微术，具体而言，涉及时间分辨发射成像显微术(TREM)。本发明涉及具有三齿配体的过渡金属络合物在成像技术中的应用。所述过渡金属优选是铂。
文档编号G01N33/84GK102203614SQ200980143636
公开日2011年9月28日 申请日期2009年10月5日 优先权日2008年10月3日
发明者J·A·加雷思·威廉姆斯, 斯坦利·W·博施维, 朱利亚·A·魏因施泰因, 约翰·海库克 申请人:科学技术设备委员会