用于癌症患者中诊断用途的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于癌症患者中诊断用途的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预测临床结果和用于监测用抗-血管生成疗法治疗的癌症患者的方法和组合物。
背景技术：
癌症是对人类健康最致命的威胁之一。仅在美国，癌症每年影响接近一百三十万新患者，并且是位于心血管病之后的第二致死原因，4名死亡者中占约1名。实体瘤是造成那些死亡中的大部分的原因。尽管已经有某些癌症医学治疗的显著进步，但是全部癌症的总的5年存活率在过去的20年内仅提高了约10%。癌症，或恶性肿瘤，转移并以不受控的方式快速生长，从而使及时的检测和治疗极端困难。根据癌症类型，患者典型地具有若干种他们可以使用的治疗选择，包括化学疗法、 放射和基于抗体的药物。用于预测来自不同治疗方案的临床结果的诊断法将非常有益于这些患者的临床管理。若干研究已经探索了基因表达与鉴定特定癌症类型的相关性，例如通过突变特异性测定、微阵列分析、qPCR等。此类方法可用于鉴定和分类患者表现出的癌症。 然而，关于具有临床结果的基因表达的预测值或预后值知之甚少。因此，存在对用于预测治疗结果诸如癌症患者的无进展存活或用于监测此类治疗的进展并由此选择对各患者最佳治疗方案的客观、可重复方法的需要。发明概述本发明的方法可以用于多种设置，包括，例如，用于帮助治疗癌症患者的方法或用于药物开发过程中的患者选择，在用具体治疗方案治疗个体患者时预测成功的可能性，评估疾病进展，监测治疗效果，确定个体患者的预后和评估个体受益于具体抗癌疗法的倾向。本发明部分地基于下述发现，患有癌症的患者中某些生物标志的表达水平与对单独的抗-血管生成疗法降低的临床益处相关。因此，本发明一方面提供优化癌症治疗的治疗功效的方法，包括检测从患者获得的样品中胎盘生长因子(placental growth factor, (PlGF))的表达水平的步骤，其中与参照样品相比较所述样品中PlGF增加的表达表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的(other than or in addition to anti-angiogenic therapy)抗癌疗法。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述患者施用抗癌疗法，其中所述抗癌疗法不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或是除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。本发明另一方面提供鉴定可受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法的癌症患者的方法，包括检测从所述患者获得的样品中胎盘生长因子(PlGF)表达水平的步骤，其中，与参照样品相比较所述样品中PlGF增加的表达表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。在一个实施方案中，来自于所述患者的样品在抗-血管生成疗法开始之前或开始之时获得。在一个实施方案中，来自于所述患者的样品在抗-血管生成疗法开始之后获得。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述患者施用抗癌疗法，其中所述抗癌疗法不同于抗-血管生成疗法或是除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。本发明另一方面提供预测癌症患者对抗-血管生成疗法的反应性的方法，包括确定从所述患者获得的样品中PlGF的表达水平，其中与参照样品相比较PlGF增加的表达水平表明所述患者对单独的抗-血管生成疗法有反应的可能性更低。在一个实施方案中， 来自于所述患者的样品在抗-血管生成疗法开始之前或开始之时获得。在一个实施方案中，来自于所述患者的样品在抗-血管生成疗法开始之后获得。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述患者施用抗癌疗法，其中所述抗癌疗法不同于抗-血管生成疗法或是除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。本发明还提供治疗患有癌症的患者的方法，包括向所述患者施用不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法，其中从所述患者获得的样品显示与参照样品相比较增加的PlGF表达水平。在一个实施方案中，来自于所述患者的样品在抗-血管生成疗法开始之前或开始之时获得。在一个实施方案中，来自于所述患者的样品在抗-血管生成疗法开始之后获得。所述样品可在治疗开始之前从所述患者获得。在一个实施方案中，所述样品具有大于或等于^pg/ml的PlGF表达水平。在一些实施方案中， 所述样品可从现在正在用抗-血管生成疗法治疗的患者获得。在一个实施方案中，来自于所述患者的样品在抗-血管生成疗法开始之后获得。在一个实施方案中，所述样品具有大于或等于50pg/ml的PlGF表达水平。本发明另一方面提供治疗癌症患者的方法，包括向所述患者施用抗-血管生成疗法，其中从所述患者获得的样品显示低或降低的PlGF表达水平，与参照样品相比较。所述样品可在治疗开始之前从所述患者获得。在一个实施方案中，所述样品具有小于或等于观 8/!111的PlGF表达水平。在一些实施方案中，所述样品可从现在正在用抗-血管生成疗法治疗的患者获得。在一个实施方案中，来自于所述患者的样品在抗-血管生成疗法开始之后获得。在一个实施方案中，所述样品具有小于或等于50pg/ml的PlGF表达水平。在一些实施方案中，所述抗-血管生成疗法包括施用抗-VEGF抗体，例如，贝伐珠单抗 (bevacizumab)0还提供试剂盒，其包括能够特异性检测PlGF表达水平的化合物，其中所述试剂盒还包括使用所述试剂盒预测患有癌症的患者对单独的抗-血管生成疗法的反应性的说明书，其中与参照样品相比较PlGF增加的表达表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。在本文描述的任何方法中，所述样品可以是组织或细胞样品或从血液、血浆和/ 或血清获得。在某些实施方案中，所述样品在癌症治疗开始之前从所述患者获得。在某些实施方案中，所述样品在癌症治疗开始之后从所述患者获得。例如，所述样品在开始癌症治疗之后的M小时内获得，或在癌症治疗开始之后的2，3，5，10，14，20，25，28，42或56天内获得。在本文描述的任何方法中，一种或多种基因或基因产物的表达水平可在核酸水平、蛋白水平或蛋白的分泌或表面表达水平确定。在某些实施方案中，PlGF表达水平的增加是表达水平的1. 4-1. 8倍的增加。在一些实施方案中，PlGF表达水平的增加是表达水平的至少1. 5倍的增加。在本发明方法的一些实施方案中，所述癌症是癌瘤(carcinoma)，淋巴瘤 (lymphoma)，母细胞瘤(blastoma)，肉瘤(sarcoma)和白血病(leukemia)。所述癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(squamous cell cancer)，肺癌(lung cancer)(包括小细 Ifi月市 I (small-cell lung cancer)，__ 小细 Ife 月市· (non-small cell lung cancer), 月市腺癌(adenocarcinoma of the lung)禾口月市的麟状癌(squamous carcinoma of the lung))，月复月莫癌(cancer of the peritoneum)，月干细胞癌(hepatocellular cancer)，胃
(gastric or stomach cancer) (1 1 IS (gastrointestinal cancer)), I^j^fg (pancreatic cancer)，成胶质细胞瘤(glioblastoma)，宫颈癌(cervical cancer)，卵巢 (ovarian cancer),H1Flg (liver cancer),MD^fg (bladder cancer),M'-JM (hepatoma), 乳腺癌(breast cancer),结肠癌(colon cancer),结肠直肠癌(colorectal cancer), 子宫内膜癌或子宫癌(endometrial or uterine carcinoma),唾液腺癌(salivary gland carcinoma), l^fg (kidney or renal cancer), H1Flg (liver cancer), Iif^lJ I/^IS (prostate cancer)，夕卜阴(vulval cancer)，(thyroid cancer) ,H1Flg (hepatic carcinoma)和多种类型的头颈癌(head and neck cancer)，以及B细胞淋巴瘤(B_cell lymphoma)(包括低度 / 滤泡性非霍奇金淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin' s lymphoma) (NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL(small lymphocytic (SL)NHL)；中度 / 滤泡 NHL (intermediate grade/fol licular NHL)；中度弥漫个生 NHL (intermediate grade diffuse NHL)；高度成免疫细胞性 NHL(high grade immunoblastic NHL)；高度成淋巴细胞性 NHL(high grade lymphoblastic NHL)；高度小无核裂细胞性 NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)；巨块型 NHL (bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma) ；AIDS相关淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症 (Waldenstrom' s Macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia) (CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia) (ALL)；多毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)；慢性成髓细胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)；禾口移植后淋巴增生性障碍(post-transplant Iymphoproliferative disorder) (PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(edema)(诸如与脑瘤有关)或梅格斯氏综合征(Meigs' syndrome)有关的异常血管增殖。在一个实施方案中，所述癌症是乳腺癌，包括例如转移性乳腺癌。本发明的方法可与本文下文描述的任何抗癌剂一起实施。抗-血管生成剂可以是本文下文描述的单独或组合的任何抗-血管发生剂。在一些实施方案中，抗-血管生成疗法包括施用VEGF拮抗剂，包括例如抗-VEGF抗体。在一些实施方案中，所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗(bevazicumab)。本文描述的任何实施方案或其任何组合适用于本文描述的本发明的任何和所有方法。附图简述

图1是在第O天(治疗开始之前)比较患有乳腺癌的患者的总存活与血浆PlGF 水平的图。
6
图2是显示响应贝伐珠单抗治疗的血浆PlGF水平增加的图。图3是在贝伐珠单抗治疗第14天比较患有乳腺癌的患者的总存活与血浆PlGF水平的图。详细描述除非另有说明，本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其是本领域的技术之内的。此类技术在文献中有详细解释，所述文献诸如"分子克隆实验室指南(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)"，第二版(Sambrook 等，1989)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis) “ (Μ· J. Gait，编辑，1984)； 〃动物细胞培养(Animal Cell Culture) “ (R. I. Freshney，编辑，1987)；〃 酶学中的方法(Methods in Enzymology)" (Academic Press, Inc.)；“现代分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology) “ (F. M.Ausubel等，编辑，1987，和定期更新)；“PCR 聚合酶链反应(PCR :The Polymerase Chain Reaction) “，(Mullis 等，编辑，1994)。除非另有说明，本文所用的技术和科技术语具有与本发明所属领域技术人员通常所知相同的含义。Singleton等，微生物和分子生物学字典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第 2 版，J. ffiley&Sons(纽约，N. Y. 1994)和 March，高级有机化学反应、机制禾口结构(Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Mructure)，第 4 版，John ffiley&Sons (New York, N. Y. 1992)，向技术人员提供了本申请所用的许多术语的一般指导。在本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，其全文通过引用并入本文。定义 术语“阵列”或“微阵列”，用于本文时，指可杂交的阵列元件(优选地为多核苷酸探针(例如，寡核苷酸))在基质上的有序排列。基质可以是固体基质如玻璃载玻片，或半固体基质如硝化纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其任何变换。“靶序列”、“靶核酸”或“靶蛋白”用于本文中时，是目的多核苷酸或蛋白，需要对其检测。一般而言，“模板”用于本文中时，是含有靶核苷酸序列的多核苷酸。在一些实例中， 术语“靶序列”、“模板DNA”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”及其变体可互换使用。“扩增”用于本文中时，一般指生成所需序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”意指至少2个拷贝。“拷贝”不必然意指与模板序列互补性或同一性的完美序列。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物诸如脱氧肌苷，有意的序列改变(诸如通过引物引入的序列改变，其包括可与模板杂交但不互补的序列)，和/或在扩增过程中发生的序列错误。如果第一样品中基因、基因产物(例如蛋白质或生物标志)的表达水平/量大于第二样品中基因、基因产物(例如蛋白质或生物标志)的表达水平/量，则与第二样品中的表达/量相比较，第一样品中基因、蛋白或生物标志的表达/量高或增加。在一个实施方案中，第一样品中基因、基因产物(例如蛋白质或生物标志)的表达水平/量的增加是至少大约 1. 5X, 1. 75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 或 100X 的第二样品中各个基因、基因产物(例如蛋白质或生物标志)的表达水平/量。如果第一样品中基因、基因产物(例如蛋白质或生物标志)的表达水平/量小于第二样品中基因、基因产物(例如蛋白质或生物标志)的表达水平/量，则与第二样品中的表达/量相比较，第一样品中基因、蛋白或生物标志的表达/量是低的或降低。在一个实施方案中，第一样品中基因、基因产物(例如蛋白质或生物标志)的表达水平/量比第二样品中各个基因、基因产物(例如蛋白质或生物标志)的表达水平/量低至少大约1.5X，1.75X， 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 或 IOOX0表达水平/量可以基于本领域已知的任何适合的标准确定，包括但不限于mRNA， cDNA，蛋白质，蛋白质片段和/或基因拷贝数。表达水平/量可以定性和/或定量地确定。 在一个实施方案中，样品针对测定的RNA或蛋白量的不同和所用RNA或蛋白样品质量差异性进行标准化。此类标准化可以通过测量和引入某些标准化基因，包括公知的持家基因，诸如GAPDH的表达来完成。备选地，标准化可以基于全部测定的基因或其大子集的平均值或中值信号(全面标准化方法)。基于每种基因，患者肿瘤mRNA或蛋白的测量的标准化的量与参照组中存在的量比较。每个患者每个测试的肿瘤的各mRNA或蛋白的标准化的表达水平可以表示为参照组中测量的表达水平的百分比。待分析的具体患者样品中测量的表达水平应该是该范围内的一些百分点，其可以通过本领域中公知的方法来确定。“检测”包括任何检测方式，包括直接和间接检测。术语“样品”或“测试样品”用于本文中时，指从目标受试者获得或得到的组合物， 其包含意欲例如基于物理、生化、化学和/或生理特征表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。在一个实施方案中，该定义包括血液和生物来源的其它液体样品，和组织样品如活组织检查样本或组织培养物或来自其中的细胞。组织样品的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活组织检查样品或抽吸物的实体组织；血液或任何血液成分；体液；和来自受试者妊娠或发育的任何时候的细胞，或血浆。样品可在治疗(例如癌症治疗)开始之前或治疗(例如癌症治疗)开始之后从受试者获得。样品可在治疗(例如癌症治疗)开始之后M小时、7天、10天、14天、观天、42天或56天内获得。术语“样品”或“测试样品”包括在获得它们后已经以任何方式进行处理的生物学样品，所述方式如通过用试剂处理，溶解，或富集某些成分，如蛋白或多核苷酸，或包埋在半固体或固体基质中用于切片目的。为了本文中的目的，组织样品的“切片”意为组织样品的单一部分或块，例如自组织样品切下的组织或细胞的薄切片。样品包括，但不限于，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清液，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液(vitreous fluid)，淋巴液，滑液，滤泡液，精液，羊膜液，乳，全血， 血液来源的细胞，尿液，脑脊液，唾液(saliva)，痰(sputum)，泪液，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养基，组织提取物如勻化的组织，肿瘤组织，细胞提取物，及其组合。在一个实施方案中，所述样品是临床样品。在另一个实施方案中，所述样品用在诊断测定中。在一些实施方案中，所述样品获自原发或转移肿瘤。组织活组织检查通常用于获得肿瘤组织的代表块。备选地，肿瘤细胞可以以已知或被认为包含目的肿瘤细胞的组织或流体形式间接获得。例如，肺癌病灶的样品可以通过切除术、支气管镜检、细针抽吸活检 (fine needle aspiration)、支气管刷检(bronchial brushings)获得,或来自痰、胸膜液或血液。在一个实施方案中，样品在抗血管生成疗法之前从受试者或患者获得。在另一个实施方案中，样品在VEGF拮抗剂疗法之前从受试者或患者获得。在另一个实施方案中，样品在抗-VEGF抗体疗法之前从受试者或患者获得。在又一个实施方案中，样品从进行至少一种VEGF拮抗剂疗法治疗的受试者或患者获得。在一个实施方案中，样品从至少一种抗-血管生成疗法治疗之后的受试者或患者获得。在另一个实施方案中，样品从进行至少一种抗-VEGF抗体治疗的受试者或患者获得。 在一些实施方案中，样品在癌症转移之前从患者获得。在某些实施方案中，样品在癌症已经转移之后从患者获得。“参照样品”用于本文时，指用于比较目的的任何样品、标准或水平。在一个实施方案中，参照样品从相同受试者或患者的身体的健康和/或非患病部分(例如，组织或细胞) 获得。在另一个实施方案中，参照样品从相同受试者或患者的身体的未处理的组织和/或细胞获得。在另一个实施方案中，参照样品从不是受试者或患者的个体的身体的健康和/ 或未患病部分(例如组织或细胞)获得。在又一个实施方案中，参照样品从不是受试者或患者的个体的身体的未处理的组织和/或细胞部分获得。在某些实施方案中，参照样品是在与获得测试样品的时间不同的一个或多个时间点获得的来自相同受试者或患者的单一样品或组合的多个样品。例如，参照样品在比获得测试样品时更早的时间点从相同的受试者或患者获得。如果参照样品在癌症的最初诊断过程中获得，并且测试样品随后在癌症变得有转移性时获得，此类参照样品可以是有用的。在某些实施方案中，参照样品包括从非-受试者或患者的一个或多个个体获得的、在上述术语“样品”下定义的所有类型的生物学样品。在某些实施方案中，参照样品从非-受试者或患者的患有血管生成病症(例如，癌症)的一个或多个个体获得。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个健康个体的合并的多个样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个患有疾病或病症(例如，血管生成病症如例如癌症)的个体的合并的多个样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个个体的正常组织或合并的血浆或血清样品的合并的RNA样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个患有疾病或病症(例如，血管生成病症，如例如癌症)的个体的肿瘤组织或合并的血浆或血清样品的合并的RNA样品。“多核苷酸”或“核酸”，在本文交互使用，指任何长度的核苷酸的聚合物，并包括 DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶结合到聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在，可以在所述聚合物的装配之前或之后，对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，如通过与标记成分缀合。其它类型的修饰包括，例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸之间的修饰如例如具有不带电荷的连接的那些 (例如膦酸甲酯，磷酸三酯，亚磷酰胺(phosphoamidates)，氨基甲酸酯等)，和具有带电连接的那些(例如，硫代磷酸酯，二硫代硫酸酯等)，包含侧结构部分(pendant moieties)的那些，如例如蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如， 吖啶、补骨脂素等)的那些，包含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些，包含烷化剂的那些，具有修饰的连接(例如，α异头核酸等)的那些，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，任何通常存在于糖中的羟基基团可以被例如膦酸酯基团(phosphonategroups)、磷酸酯基团(phosphate group)取代，被标准的保护基保护，或被激活以制备与另外的核苷酸的另外的连接物，或可以缀合于固体支持物。5’和3’末端OH可以被磷酸化，或被胺类或1-20个碳原子的有机加帽基团结构部分取代。还可以将其他的羟基衍生为标准的保护基。多核苷酸还可以包含核糖或脱氧核糖的类似形式，其通常是本领域中已知的，包括例如2’ -0-甲基-2’ -0-烯丙基_，2’ -氟-或2’ -叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α -异头糖，差向异构的糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物， 和无碱基核苷酸类似物如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯连接可以被备选的连接基团取代。这些备选的连接基团包括，但不限于其中磷酸酯被P (O)S ( “硫酯(thi0ate)”)，P(S) S ( “二硫酯(dithioate)，，)，(O)NR 2 ( “酰胺化物(amidate) ”)，P (0) R，P (0) OR，，CO 或 CH 2( "formacetal")取代的实施方案，其中每个R或R’独立地是H或是任选包含醚(一0-) 连接的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。在多核苷酸中不是所有的连接都需要是相同的。前面的描述可应用于本文提及的所有的多核苷酸，包括 RNA 禾口 DNA。“寡核苷酸”用于本文时，一般指短的、一般为单链的，一般为合成的多核苷酸，其一般，但不是必需地少于约200个核苷酸的长度。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不相互排斥。上面关于多核苷酸的描述等同地并且充分地可应用于寡核苷酸。“引物”通常为短的单链多核苷酸，一般具有游离的3' -OH基团，其通过与靶序列杂交与可能存在于目的样品中的靶标结合，并且随后促进与该靶标互补的多核苷酸的聚术语“生物标志”用于本文时一般指，这样的分子，其包括，基因、蛋白、碳水化合物结构或糖脂，所述分子在哺乳动物组织或细胞中或在其上的表达可以通过标准方法(或本文公开的方法)检测，并且是对哺乳动物细胞或组织对基于抑制血管发生的治疗方案的敏感性的预测、诊断和/或预后，所述基于抑制血管发生的治疗方案，例如抗-血管生成剂如 VEGF-特异性抑制剂。任选地，确定所述生物标志的表达高于针对对照/参照组织或细胞样品观察到的。此类生物标志的表达可以利用高通量多种免疫测定法诸如可商购自Rules Based Medicine, Inc.或Meso Scale Discovery的那些来确定。生物标志的表达还可以利用例如PCR或FACS测定，免疫组织化学测定或基于基因芯片的测定来确定。所述“组织或细胞样品”意指从受试者或患者的组织获得的细胞集合。组织或细胞样品的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活组织检查样品或抽吸物的实体组织；血液或任何血液成分；体液诸如脑脊液、羊水、腹水或间质液；来自于受试者怀孕或发育的任何时间的细胞或血浆。组织样品还可以是原代或培养的细胞或细胞系。 任选地，组织或细胞样品从癌性组织/器官获得。组织样品可含有本质上与组织不天然混合的化合物如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等等。为本文的目的，组织样品的“切片”意指组织样品的单个部分或片，例如从组织样品切下的组织或细胞的薄片。所述“相关(correlate) ”或“相关的(correlating) ”意味着以任何方式比较第一分析或流程的性能和/或结果与第二分析或流程的性能和/或结果。例如，可以使用第一分析或流程的结果进行第二流程和/或可以使用第一分析或流程的结果来确定是否应该进行第二分析或流程。关于基因表达分析或流程的实施方案，可以使用基因表达分析或流程的结果来确定是否应该进行具体的治疗方案。
词语“标记”当用于本文时，指直接或间接与试剂如核酸探针或抗体缀合或融合并且有利于检测与其缀合或融合的试剂的化合物或组合物。所述标记本身可以是可检测的 (例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶促标记的情形中，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。“天然序列”多肽包含与来自自然的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。所述天然序列多肽可以从自然分离或可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列”多肽具体地包括多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，细胞外结构域序列)，天然存在的变体形式(例如， 可变剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因变体。多肽“变体”指与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N末端或C末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体将会与天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性，更优选至少约 90%氨基酸序列同一性，和甚至更优选至少约95%氨基酸序列同一性。术语“VEGF”或“VEGF-A”用于指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等，科学(kience)， 246 :1306(1989)；和 Houck 等，分子内分泌学(Mol. Endocrin.)，5 1806 (1991)所记载的， 及其天然存在等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、 VEGF-F和PlGF的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲合力受体酪氨酸激酶，即 VEGFR-I (Flt-I)和VEGFR-2 (Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。另外，已经鉴定出神经毡蛋白-Kneuropilin-l)作为肝素-结合VEGF-A同种型受体，并可能在血管发育中发挥作用。术语“VEGF”或“VEGF-A”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF用如下术语表示，诸如hVEGF表示人VEGF或mVEGF表示鼠VEGF。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式或片段。任何所述VEGF 形式的参考符号在本申请中，例如，通过“VEGF(8-109)，，，"VEGF(1-109) ”或"VEGF165”来识别。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的编号。例如，截短的天然 VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-I受体的结合亲合力。术语“VEGF”或“VEGF-A”用于本文中时，指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等(1989) 科学(Science)，246 :1306 ；和 Houck 等(1991)分子内分泌学(Mol. Endocrin. ),5 :1806 所记载的，及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、 大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF用如下术语表示，诸如hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式。任何所述VEGF形式的参考符号在本申请中，例如，通过“VEGF(8-109)，，，"VEGF(1-109) ”或"VEGF165”来识别。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF 具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-I受体的结合亲合力。
“ VEGF生物学活性”包括与任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性如调节正常和异常血管生成和血管发生(Ferrara和Davis-Smyth (1997)内分泌综述(Endocrine Rev.) 18 4-25 ；Ferrara(1999)分子医学杂志(J. Mol. Med.) 77 :527-543)；促进胚胎血管发生和血管生成(Carmeliet 等，(1996)自然(Nature) 380 :435-439 ;Ferrara 等，(1996) 自然(Nature) 380 :439-442)；和调节雌性生殖道的周期性血管增殖，以及骨生长和软骨形成(Ferrara 等，(1998)自然医学(Nature Med.) 4 :336-340 ;Gerber 等，(1999)自然医学 (Nature Med.) 5 =623-628) 0除了作为血管生成和血管发生中的血管生成因子之外，VEGF 还作为多效生长因子在其它生理过程中显示了多种生物学效应，如内皮细胞存活，血管通透性和血管舒张，单核细胞趋化作用和钙流入Perrara和Davis-Smyth (1997)，见上文，和 Cebe-Suarez 等，细胞分子生命科学(Cell. Mol. Life. Sci). 63 :601-615(2006)。而且，最近的研究已经报道了 VEGF对于数种非内皮细胞类型，如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和许旺细胞的促有丝分裂作用。Guerrin等，(1995)细胞生理学杂志(J. Cell Physiol.) 164 385-394 ；Oberg-Welsh 等(1997).分子细胞内分泌学(Mol. Cell. Endocrinol). 126 125-132 ；Sondell 等，神经科学杂志(J. Neurosci.) 19 :5731-5740 (1999)。"VEGF拮抗剂”或“VEGF特异性拮抗剂”指这样的分子，其能够结合VEGF，降低VEGF 表达水平，或中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物学活性，包括但不仅限于VEGF与一种或多种VEGF受体的结合，和VEGF介导的血管发生和内皮细胞存活或增殖。本发明的方法中包括的有用的VEGF-特异性拮抗剂是特异性结合VEGF的多肽，抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、 融合蛋白(例如，VEGF-iTrap(Regeneron))和 VEGFm-gelonin (Peregrine)。VEGF-特异性拮抗剂也包括VEGF多肽的拮抗剂变体，至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的反义核碱基(nucleobase)寡聚物；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的小RNA ； 靶向VEGF的核酶；针对VEGF的肽体(ρ印tibody)；及VEGF适配体。VEGF-特异性拮抗剂也包括结合VEGF并能够阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物学活性的非肽小分子。因此，术语“VEGF活性”特别包括VEGF介导的VEGF生物学活性。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70^^80^^90%或更多。在一些实施方案中，通过VEGF-特异性拮抗剂抑制的VEGF是 VEGF (8-109)，VEGF (1-109)，或 VEGF165。“抗VEGF抗体”是以足够亲合力和特异性结合VEGF的抗体。在某些实施方案中，所选择的抗体通常具有针对VEGF的足够的结合亲合力，例如所述抗体可以以介于IOOnM-IpM 之间的Kd值结合hVEGF。抗体亲合力可以通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号W02005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法 (ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。在某些实施方案中，抗VEGF抗体可以用作靶向和干扰其中涉及VEGF活性的疾病或病症的治疗剂。而且，所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。实例包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如W089/06692所记载的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5，500, 362)； 及激动性活性或造血测定法(参见W095/2706》。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不结合其它生长因子，诸如P1GF、PDGF或bFGF。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4. 6. 1结合相同表位的单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗VEGF抗体是根据I^esta等(1997)癌症研究(Cancer Res.) 57 :4593-4599产生的重组人源化抗-VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为“贝伐珠单抗(BV ；AVASTIN )，，的抗体。抗-VEGF抗体“贝伐珠单抗(BV) ”，也称为“rhuMAb VEGF"或“AVASTIN ”，是根据 I^esta等(1997)癌症研究(Cancer Res. )57 :4593-4599产生的重组人源化抗-VEGF单克隆抗体。其包含突变的人IgGl构架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A. 4. 6. 1 (其阻断人VEGF结合其受体)的抗原结合互补性决定区。贝伐珠单抗大约93%的氨基酸序列(包括大部分构架区)来自人IgGl，而大约7%的序列来自鼠抗体A4. 6.1。贝伐珠单抗具有约 149，000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐珠单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月沈日授权的美国专利号6，884，879，将其全部内容通过引用明确并入本文。另外优选的抗体包括G6或B20系列抗体(例如G6-31、B20-4. 1)，如PCT申请公开号W02005/012359所描述的。另外优选的抗体参见美国专利号7，060，269，6，582，959， 6，703，020 ；6，054，297 ；W098/45332 ；W096/30046 ；W094/10202 ；EP0666868B1 ；美国专利申请公开号 2006009360,20050186208,20030206899,20030190317,20030203409 和 20050112126 ；及 Popkov 等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods) 288 149-164 (2004)。其它优选的抗体包括结合人VEGF上的功能表位的那些，该表位包含残基 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191，K101, E103 禾口 C104，或备选地包含残基 F17，Y21, Q22, Y25, D63, 183 和 Q89。术语“抗体”以最广义使用，具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。“阻断性”抗体或抗体“拮抗剂”指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。例如，VEGF特异性拮抗性抗体结合VEGF并抑制VEGF诱导血管内皮细胞增殖的能力。 优选的阻断性抗体或拮抗性抗体完全地抑制抗原的生物学活性。除非另有说明，本说明书全文中使用的表述“多价抗体”表示包含三个或更多抗原结合位点的抗体。多价抗体优选地被改造成具有三个或更多抗原结合位点，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区由处于紧密结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成，所述结合可以本质上是共价的，例如在scFv 中。在该构型中，各可变结构域的三个CDR相互作用以定义二聚体表面上的抗原结合位点。总体上，6个CDR或其亚组将抗原结合特异性赋予抗体。然而，甚至单可变结构域 (或仅包括3个特异于抗原的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管通常处于低于完整结合位点的亲合力。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，所述同质的抗体即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与典型地包含针对不同决定簇 (表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler等，自然(Nature) 256 :495(197 首先描述的杂交瘤法制造，或可通过重组DNA法(参见例如美国专利号4，816，567)制造。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等，自然(Nature) 352 624-628(1991)和 Marks 等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 222 :581-597 (1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。单克隆抗体在本文中特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源， 而链的剩余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No. 4，816，567 和 Morrison 等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含来自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基用具有期望特异性、亲合力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区的残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv 构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的。更多细节参见 Jones 等，自然(Nature) 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等， 自然(Nature) 332 :323-329(1988)；及 Presta，现代结构生物学观点(Curr. Op. Struct. Biol.) 2 :593-596(1992)。“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来产生。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等，自然生物技术(Nature Biotechnology) 14 :309-314(1996) ；Sheets 等，国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. )95 :6157-6162(1998) ；Hoogenboom 和 Winter，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 227 381 (1991) ；Marks 等，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 222 :581 (1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来产生，所述转基因动物例如是其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的小鼠。在受到激发时，观察到人抗体产生，它在所有方面与在人中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分。这种方法记载于例如美国专利号5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016，及以下科学出版物中:Marks 等，生物 / 技术(Bio/Technology) 10 :779-783(1992) ；Lonberg 等，自然(Nature)368 :856-859(1994) ；Morrison,自然(Nature)368 :812-13(1994)； Fishwild 等，自然生物技术(Nature Biotechnology) 14 :845-51 (1996) ；Neuberger,自然生物技术(Nature Biotechnology) 14 826 (1996) ；Lonberg 和 Huszar，国际免疫学综述 (Intern. Rev. Immunol.) 13 :65-93 (1995)。备选地，人抗体可通过产生针对靶抗原的抗体的
14人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体外免疫)。参见例如 Cole 等，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss，p. 77(1985) ；Boerner 等，免疫学杂志(J. Immunol.) 147(1) :86-95(1991)；及美国专利号5，750，373。“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且与其天然环境的成分分离和/或从其回收的多肽或抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该多肽或抗体诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选实施方案中，将多肽或抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，多肽或抗体以重量计超过95%，和最优选地以重量计超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或C3)根据使用考马斯蓝或优选地银染色的还原性或非还原性条件下的 SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽或抗体包括重组细胞内的原位多肽或抗体。然而，分离的多肽或抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。用于本文时，“治疗(treatment)”指在尝试改变待治疗的个体或细胞的天然进程中的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，在试图延缓疾病或病症的发展中本发明的方法和组合物是有用的。“有效量”指在需要的剂量和时间阶段，有效获得需要的治疗或预防效果的量。治疗剂的“治疗有效量”可以根据因素诸如疾病阶段，个体年龄、性别、和体重，和抗体在个体内引起所需反应的能力而变化。治疗有效量也是这样的量，其中治疗剂的任何毒性或有害作用小于其治疗有益效果。“预防有效量”是指在需要的剂量和时间阶段，有效获得需要的预防效果的量。典型地，但不是必需地，由于预防剂量在疾病发生之前或疾病的早期阶段用于受试者，因此预防有效量将小于治疗有效量。在癌前、良性肿瘤、早期或晚期肿瘤的情形中，血管生成抑制剂的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减少原发肿瘤大小；抑制(即， 在一定程度上减缓并且优选地阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选地阻止)肿瘤转移；在一定程度上，抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与病症相关的一种或多种症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、反应率(RR)、反应持续时间、和/或生活质量来测量。“短暂无进展存活”是指第一次肿瘤评估的时间的进展。取决于癌症或肿瘤的类型，第一次肿瘤评估的时间发生在治疗起始之后的大约4，3，2或1个月。第一次肿瘤评估的时机取决于具体疾病进展有多快。在一个实施方案中，肾癌(renal cancer)的第一次肿瘤评估的时间是抗癌疗法开始之后的56天。术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征典型地为细胞生长不受调节的生理病况。包括在这种定义中的是良性和恶性癌症。癌症的实例包括但不限于癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、禾口白血病(leukemia)。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、肺癌(lung cancer)(包括小细胞肺癌(small-cell lung cancer)、非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer)、月市的腺癌(adenocarcinoma of the lung)禾口月市的售舞癌(squamous carcinoma of the lung)) > 月复月莫癌(cancer of the peritoneum) > M M M ^ (hepatocellular cancer)> 胃 (gastric or stomach cancer)(^ll f舌胃肠癌(gastrointestinal cancer))、胰腺癌(pancreatic cancer)、成胶质细胞瘤 (glioblastoma)、宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、月干癌(liver cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、肝瘤(h 印 atoma)、乳腺癌(breast cancer)、结肠癌 (colon cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、子宫内膜癌或子宫癌(endometrial or uterine carcinoma)、唾液腺癌(salivary gland carcinoma)、肾癌(kidney or renal cancer)、月干· (liver cancer)、|1]"歹(prostate cancer)、夕卜阴· (vulval cancer) > 甲状腺癌(thyroid cancer)、月干癌(hepatic carcinoma)禾口多种类型的头颈癌(head and neck cancer)，以及B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin‘ s lymphoma) (NHL)；小淋巴细胞性(SL) NHL (small Iymphocytic(SL)NHL)；中度 / 滤泡 f生 NHL (intermediate grade/fol licular NHL)；中度弥漫性 NHL (intermediate grade diffuse NHL)、高度成免疫细胞性 NHL (high grade immunoblastic NHL)；高度成淋巴细胞个生 NHL (high grade lymphoblastic NHL)； 高度小无核裂细胞性 NHL(high grade small non-cleaved cell NHL);巨块型(bulky disease)NHL ；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma) ；AIDS 相关淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom' s Macroglobulinemia))； 慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia) (CLL)；急性成淋巴细胞个生白 IfiI _ (acute lymphoblastic leukemia) (ALL) ； € _ Ifi 个生白 in _ (Hairy cell leukemia)；慢性成髓细胞性白血病(chronic myeloblastic leukemia)；和移植后淋巴 ±曾殖个生病症(post-transplant lymphoproliferative disorder) (PTLD)；以及与疲疲病 (phakomatoses)、水肿(edema)(诸如与脑瘤有关)和梅格斯氏综合征(Meigs' syndrome) 相关的异常血管增殖。“受试者”或“患者”的意思是哺乳动物，包括，但不限于人或非人哺乳动物，如牛、 马、犬、羊或猫。优选地，所述受试者或患者是人。术语“抗癌疗法”指用于治疗癌症的疗法。抗癌治疗剂的实例包括，但不仅限于，例如，化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性试剂、放射疗法中使用的试剂、抗血管生成剂、细胞凋亡试剂、抗微管蛋白试剂、和其他用于治疗癌症的试剂，诸如抗-HER-2抗体、抗-CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼(erlotinib) (Tarceva )、血小板衍生的生长因子抑制剂(例如，GleeveC (甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)))、C0X_2抑制剂(例如，塞来考昔(celecoxib))、干扰素、 细胞因子、与下列靶标 VEGF、ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR- β、BlyS、APRIL、BCMA 或 VEGF 受体中的一种或多种结合的拮抗剂(例如，中和抗体)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。“血管生成因子或试剂”指参与刺激血管发育，例如促进血管发生、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管发生等的生长因子或其受体。例如，血管生成因子包括但不限于例如 VEGF 和 VEGF 家族的成员和其受体(VEGF-B，VEGF-C, VEGF-D, VEGFRl, VEGFR2和VEGFR3)、P1GF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素 (angiopoietins)、ANGPT 1、ANGPT2)、！ Ε1、ΤΙΕ2、肝配蛋白、Βν8、δ 样配体 4(DLL4)、Del_l、 成纤维细胞生长因子酸性(aFGF)和碱性(bFGF)、FGF4、FGF9、BMP9、BMP10、Follistatin、 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、GM-CSF、肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、CXCL12、来普汀(L 印 tin)、中期因子(Midkine)、神经毡蛋白(neuropilins)、 NRPU NRP2、胎盘生长因子、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生的生长因子、特别是 PDGF-BB、PDGFR- α、或 PDGFR-β、多营养因子(PTN)、Progranulin、增殖蛋白Troliferin)、转化生长因子-a (TGF-α )、转化生长因子-β (TGF-β )、肿瘤坏死因子- a (TNF- α ), Alkl, CXCR4, NotchU Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4 等。其还包括促进血管发生的因子，诸如ESMl和基底膜蛋白聚糖(Perlecan)。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、EGF-样结构域 7(EGF-like domain, multiple 7 (EGFL7)) (EGFL7)、CTGF 及其家族成员、及 TGF-α 和 TGF- β。参见例如 Klagsbrun 和 D，Amore (1991)，生理学年评(Annu. Rev. Physiol.) 53 217-39 ;Streit 禾口 Detmar (2003)，致癌基因(Oncogene) 22 :3172-3179 ;Ferrara 禾口 Alitalo (1999)，自然医学(Nature Medicine) 5 (12 :1359-1364 ；Tonini 等(200 ，致癌基因(Oncogene) 22 :6549-6556 (例如列举已知血管生成因子的表1)；和&ito Q003)，国际临床肿瘤学杂志(Int. J. Clin. Oncol. )8 :200_206。 “抗血管生成剂”、“血管生成抑制剂”、“抗-血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指直接或是间接抑制血管发生、血管生成、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸 (包括，例如，抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其缀合物或融合蛋白。应该理解抗血管生成剂包括结合和阻断血管生成因子或其受体的血管生成活性的那些试剂。例如，抗血管生成剂是上文定义的血管生成剂的抗体或其它拮抗剂， 例如VEGF-A的抗体或VEGF-A受体(例如，KDR受体或Flt-I受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂(例如，Gleevec 甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate))、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如 PTK787/3(2284、SU6668、SUTENT /SUl 1248 (苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、AMG706、或例如国际专利申请WO 2004/113304中所述的那些)。抗-血管生成剂还包括但不限于下述试剂VEGF抑制剂如VEGF-特异性拮抗剂，EGF抑制剂，EGFR Φ ^Ll Erbitux (西妥昔单抗(cetuximab), ImClone Systems, Inc.，Branchburg, N. J.), Vectibix (中白尼单抗(panitumumab)，Amgen, Thousand Oaks, CA)， TIE2 抑制剂，IGFlR抑制剂，COX-II (环加氧酶II)抑制剂，MMP-2 (基质-金属蛋白酶2)抑制剂， 和MMP-9 (基质-金属蛋白酶9)抑制剂，CP-547, 632 (Pfizer Inc.(辉瑞公司)，NY, USA)， 阿昔替尼(Axitinib) (Pfizer Inc.(辉瑞公司)；AG-013736)，ZD-6474(AstraZeneca), AEE788 (Novartis)， AZD-2171)， VEGF Trap (Regeneron/Aventis)，^ftkiiM (Vatalanib) (也称为 PTK-787, ZK-222584 :Novartis&Schering A G)，Macugen (培加他尼八钠 (pegaptanib octasodium),NX-1838,EYE-OOl,Pfzer Inc.(辉瑞公司)/Gilead/Eyetech)， IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Wash.,美国)；禾口 angiozyme,来自 Ribozyme (Boulder, Colo.)的合成的核酶和Chiron (Emeryville，Calif.)及其组合。其他血管生成抑制剂包括血小板反应蛋白1，血小板反应蛋白2，胶原蛋白IV和胶原蛋白XVIII。VEGF抑制剂公开在美国专利号6，534，524和6，235，764中，为所有目的将二者全文并入本文。抗-血管生成剂还包括天然血管发生抑制剂，例如制管张素(angiostatin)、内皮生长抑素(endostatin) 等。参见例如 Klagsbrun 和 D，Amore (1991)生理学年评(Annu. Rev. Physiol.) 53 :217-39 ； Streit和Detmar (2003)致癌基因(Oncogene) 22 :3172-3179 (例如列举恶性黑素瘤中抗血管生成疗法的表 3) ；Ferrara 和 Alitalo (1999)自然药物(Nature Medicine) 5 (12) 1359-1364 Jonini等(2003)致癌基因(Oncogene) 22 :6549-6556 (例如列举已知抗血管生成因子的表2)；及Sato (2003)，国际临床肿瘤学杂志(Int. J. Clin. Oncol. )8 :200-206(例如列举临床试验中所使用的抗血管生成剂的表1)。术语“抗-血管生成疗法”指有效用于抑制血管生成的疗法，所述疗法包括施用抗血管生成剂。本文所用的术语“细胞毒性试剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如，Im>I125>Y90和Re186)、化疗剂和毒素，如细菌、 真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段。“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷基化试剂，如塞替哌(thiot印a)和CYTOXAN 环磷酰胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)， 英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代憐酸胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；聚乙酸类(acetogenins)(特别是布拉他辛 (bullatacin)禾口布拉他辛丽(bullatacinone))；喜积 喊(camptothecin)(包括合成的类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin) ；callystatin ；CC_1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycinsM特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀 (dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物、KW-2189 和 CB1-TM1)； jt 1f S (eleutherobin) ；pancratistatin ； ftl fe it 王古月 Il (sarcodictyin) ； · til i (spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酉先胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酉先胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仓(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素Y II和加利车霉素 0 11(参见例如々81^^，Chem. Intl. Ed. Engl. 33 :183-186(1994))；烯二炔蒽环类抗生素 (dynemicin)，包括烯二炔蒽环类抗生素A; 二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate) ;±矣其j 波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素 (bleomycins) > 放线菌素 C (cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素 D(dactinomycin)、 柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星(morpho 1 ino-doxorubicin)、氛基吗琳代多柔比星(cyanomorpho 1 ino-doxorubicin)、 2-吡咯啉-多柔比星 Q-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、 表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(ρ印lomycin)、 紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素 (tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物如甲氨喋呤(methotrexate)和5_氟尿嘧啶(5_f luorouracil) (5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)； 嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6_巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤 (thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、 阿扎胞苷(azacitidine)、6_ 氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(f loxuridine)；雄激素类(androgens)，诸如卡鲁睾酮 (calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄酉享(epitiostanol)、 美雄烧(mepitiostane)、辜内酉旨(testolactone)；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿剂如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside) ；5_ 氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate) ；defofamine ；秋水仙胺(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone)； elfornithine ；依利醋铵(elliptinium acetate) ；epothilone ；依托格鲁(etoglucid)； 硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼达明 (Ionidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)如美登素(maytansine)和安丝 MM (ansamitocins)；米托月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫口jS达酉享 (mopidanmol)；尼曲吖唆(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽酉昆(Iosoxantrone)；鬼酸(podophyllinic acid) ；2-乙基酰胼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ；PSK 多糖复合物(JHS Natural ProductsCJHS 天然产品)，Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃 (sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone) ；2，2，，2” -三氯三乙胺(2，2，，2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin Α、杆孢菌素A(roridinA)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪 (dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine) ；二溴甘露酉享(mitobronitol) ；二溴卫矛酉享 (mitolactol)；喊泊漠烧(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞昔(arabinoside) (“Ara-C")； 环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类化合物(taxoids)，例如 TAXOL ^^Il (paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.),^ 克列莫佛(Cremophor)的ABRAXANE 、紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、禾口 TAXOTERE ⑧多西他塞(doxetaxel) (Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil) ；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine) ；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；钼类似物如顺钼(cisplatin)和卡钼(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；钼；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine) ；NAVELBINE ；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)； 替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤 (aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (Camptosar, CPT-11)(包括伊立替康(irinotecan)与 5_FU 和亚叶酸(Ieucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine) (DMFO)；类视黄酸类(retinoids)如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)； 考布他汀(combretastatin)；亚叶酸(Ieucovorin) (LV)；奥沙利钼(oxaliplatin)，包括奥沙利钼(oxaliplatin)治疗方案(FOLFOX) ；PKC- α的抑制剂，Raf的抑制剂，H-Ras的抑制剂，EGFR的抑制剂(例如，厄洛替尼(erlotinib) (Tarceva ))和VEGF-A的抑制剂，它们降低细胞增殖，和上述任一种的药用盐、酸或衍生物。 抗-激素剂也包含在本定义中，它们起作用从而调控或抑制对肿瘤的激素作用， 诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括例如，他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen),曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和 FAREST0N ·托瑞米芬(toremifene)；和芳香酶抑制剂(aromatase inhibitors)，其抑制芳香酶，该酶调节肾上腺中的雌激素产生，诸如，例如，4(5)-咪唑类 G (5) -imidazoles)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate)、AROMASIN 益西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR 伏氯唑(vorozole)、FEMARA φ 来曲唑(Ietrozole)和 ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)；和抗-雄激素类(anti-androgens)诸如氟他胺 (flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(Ieuprolide) 和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine) (1，3_ 二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制在涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些，所述基因诸如例如，PKC-α、Raf和H-Ras ；核酶(ribozymes)诸如VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYME 核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗诸如基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和 VAXID 疫苗；PROLEUKIN rIL_2 ；LURTOTECAN 拓扑异构酶 1 抑制剂；ABARELIX rmRH ；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(参见美国专利号4，675，187)，和上述任意物质的药用盐、酸或衍生物。
所述“放射性疗法”意指定向Y射线或β射线对细胞诱导足以限制其起正常功能的能力的破坏或使细胞完全破坏的用途。应该理解本领域中已知许多用于确定治疗的剂量和持续时间的方式。典型的治疗作为一次施用和典型剂量范围10-200单位(Grays)/日来提供。“降低或抑制”是与参照比较减少或降低活性、功能和/或量。所述“降低或抑制” 意为导致总的减少优选20 %或更多，更优选50 %或更多，和最优选75 %，85 %，90 %，95 % 或更多的能力。降低或抑制可涉及被治疗的病症的症状，转移瘤的存在或大小，原发肿瘤的大小，或在血管生成病症中的血管的大小或数目。术语“诊断”在本文中用于意指确定分子的或病理学的状态、疾病或病症，诸如确定癌症或用于确定可受益于具体治疗方案的癌症患者。术语"预后"用于本文时指预测从抗癌疗法得到临床益处的可能性。术语"预测"用于本文时，指患者对特定抗癌疗法反应良好或不良的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些反应的程度。在一个实施方案中，预测涉及患者在治疗(例如用特定治疗剂治疗)后是否在一定阶段不伴随疾病复发的存活或改善和/或这样存活或改善的可能性。本发明的预测方法可以在临床上通过选择对于任何特定患者的最适合的治疗方式来做出治疗决定。如果患者可能对治疗方案(如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合，外科手术干预，类固醇治疗等)的反应良好，或在治疗方案后患者的长期存活是可能的，那么本发明的预测方法是预测的有价值的工具。“患者反应”可以使用任何指示患者益处的终点来评估，所述终点包括，但不限于 (1)在一定程度上抑制疾病进展，包括延缓和彻底停滞；( 减少病灶大小；C3)抑制(即， 减少、减缓或彻底阻止)疾病细胞浸润到邻近的周围器官和/或组织中；(4)抑制(即，减少、延缓或完全阻止)疾病传播；( 在一定程度上，减轻与病症相关的一种或多种症状； (6)增加治疗后没有表现疾病的长度；和/或(8)治疗后在给定时间点减少的死亡率。术语“长期存活”用于本文意指在治疗性处理后存活至少1年、5年、8年或10年。术语“益处”广义使用，并且指任何理想的效果，具体地包括如本文定义的临床益处。临床益处可以通过评估各种终点来测量，例如在一定程度上抑制疾病进展，包括延缓和完全阻滞；减少疾病事件和/或症状的数量；减少病灶大小；抑制(即，减少、减缓或彻底阻止)疾病细胞浸润到邻近的周围器官和/或组织中；抑制(即，减少、延缓或完全阻止)疾病传播；减少自体免疫应答，其可以，但不必需导致疾病病灶的退化或消除；在一定程度上减轻与病症相关的一种或多种症状；增加治疗后没有疾病表现的长度，例如无进展存活期；增加的总存活时间；更高的反应速率；和/或在治疗后的给定时间点减少的死亡率。II.本发明的方法本发明部分基于鉴定与治疗癌症的抗-血管生成疗法降低的临床益处相关的特异性生物标志。因此，公开的方法和测定提供方便、有效且可能有成本效益的获得用于评估治疗癌症患者的适当或有效疗法的数据和信息的方式。例如，癌症患者可进行活组织检查以获得组织或细胞样品，或可从患者获得血浆样品，所述样品可通过多种体外测定进行检查以确定PlGF的表达与对照或参照样品相比较是否增加。如果检测到表达的增加，则所述
21患者将可能受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。因此，本发明提供鉴定可受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法的癌症患者的方法，包括检测从所述患者获得的样品中胎盘生长因子(PlGF)表达水平的步骤，其中，与参照样品相比较所述样品中PlGF增加的表达表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。在一些实施方案中，所述样品在癌症治疗开始之前从所述患者获得，其中所述样品具有大于^pg/ml的PlGF表达水平。在一些实施方案中，所述样品从现在正在进行抗-血管生成疗法的患者获得，其中所述样品具有大于50pg/ml的PlGF表达水平。在一些实施方案中， 所述样品是血浆样品。本发明还提供预测癌症患者对抗-血管生成疗法的反应性的方法，包括确定从所述患者获得的样品中PlGF的表达水平，其中与参照样品相比较PlGF增加的表达水平表明所述患者对单独的抗-血管生成疗法有反应的可能性更低。在一些实施方案中，所述样品在癌症治疗开始之前从所述患者获得，其中所述样品具有大于^pg/ml的PlGF表达水平。 在一些实施方案中，所述样品从现在正在进行抗-血管生成疗法的患者获得，其中所述样品具有大于50pg/ml的PlGF表达水平。在一些实施方案中，所述样品是血浆样品。还提供治疗患有癌症的患者的方法，包括向所述患者施用不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法，其中从所述患者获得的样品显示与参照样品相比较增加的PlGF表达水平。本发明另一方面提供优化癌症治疗的治疗功效的方法，包括确定从患者获得的样品中PlGF的表达水平，其中，与参照样品相比较PlGF增加的表达水平表明所述患者对单独的抗-血管生成疗法有反应的可能性更低。所述样品可在治疗开始之前从所述患者获得。 所述样品可在治疗开始之后从所述患者获得。在一个实施方案中，所述样品具有小于或等于观 8/!111的PlGF表达水平。在一些实施方案中，所述样品可以从现在正在进行抗-血管生成疗法治疗的患者获得。在一个实施方案中，所述样品具有小于或等于50pg/ml的 PlGF表达水平。在一些实施方案中，所述抗-血管生成疗法包括施用VEGF拮抗剂，如例如抗-VEGF抗体，例如贝伐珠单抗。本发明另一方面提供治疗癌症患者的方法，包括向所述患者施用抗-血管生成疗法，其中从所述患者获得的样品显示与参照样品相比较的低的PlGF表达水平。所述样品可在治疗开始之前从所述患者获得。在一个实施方案中，所述样品具有小于或等于^Pg/ml 的PlGF表达水平。在一些实施方案中，所述样品可以从现在正在进行抗-血管生成疗法治疗的患者获得。在一个实施方案中，所述样品具有小于或等于50pg/ml的PlGF表达水平。 在一些实施方案中，所述抗-血管生成疗法包括施用VEGF拮抗剂，如例如抗-VEGF抗体，例如贝伐珠单抗。本发明的方法涉及患有癌症的患者。所述癌症可以是，例如癌瘤(carcinoma)，淋巴瘤(lymphoma)，母细胞瘤(blastoma)，肉瘤(sarcoma)禾口 /或白血病(leukemia)。所述癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(squamous cell cancer)，肺癌(lung cancer)(包括小细Ifi月市· (small-cell lung cancer)，#/J、细Ifi月市· (non-small cell lung cancer), 月市腺癌(adenocarcinoma of the lung)禾口月市的麟状癌(squamous carcinoma of the lung))，月复月莫癌(cancer of the peritoneum)，月干细胞癌(hepatocellular cancer)，胃(gastric or stomach cancer) (1 1 IS (gastrointestinal cancer)), I^j^fg (pancreatic cancer)，成胶质细胞瘤(glioblastoma)，宫颈癌(cervical cancer)，卵巢 (ovarian cancer),H1Flg (liver cancer),MD^fg (bladder cancer),M'-JM (hepatoma), 乳腺癌(breast cancer),结肠癌(colon cancer),结肠直肠癌(colorectal cancer),子宫内膜癌或子宫癌(endometrial or uterine carcinoma),唾液腺癌(salivary gland carcinoma)，肾癌或肾癌(kidney or renal cancer)，月干癌(liver cancer)，前列腺癌 (prostate cancer)，夕卜阴癌(vulval cancer)，甲#1/ 癌(thyroid cancer)，月干癌(hepatic carcinoma)和多种类型的头颈癌(head and neck cancer)，以及B细胞淋巴瘤(B_cell lymphoma)(包括低度 / 滤泡性非霍奇金淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin' s lymphoma) (NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL(small lymphocytic(SL)NHL)；中度 / 滤泡性 NHL (intermediate grade/fol licular NHL)；中度弥漫NHL (intermediate grade diffuse NHL)；高度成免疫细胞性 NHL(high grade immunoblastic NHL)；高度成淋巴细胞性 NHL(high grade lymphoblastic NHL)；高度小无核裂细胞性 NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)；巨块型 NHL (bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma) ；AIDS相关淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症 (Waldenstrom' s Macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia) (CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia) (ALL)；多毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)；慢性成髓细胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)；禾口移植后淋巴增生性障碍(post-transplant Iymphoproliferative disorder) (PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(edema)(诸如与脑瘤有关)或梅格斯氏综合征(Meigs' syndrome)有关的异常血管增殖。在一个实施方案中，癌症是肾细胞癌(renal cell carcinoma)。包含靶生物标志的样品可以通过本领域公知的并且适合于目的癌症的特定类型和定位的方法获得。组织的活组织检查常常用于获得癌性组织的代表性块。备选地，细胞可以已知或认为含有目的癌细胞的组织/液体的形式间接地获得。例如，癌性病灶的样品可以通过切除术、支气管镜检查法、细针抽吸、支气管刷检获得，或来自痰、胸膜液或血液。可以从癌症或肿瘤组织或从其它身体样品如尿液、痰液、血清或血浆中检测基因或基因产物。 可以将上述关于检测癌性样品中的靶基因或基因产物所讨论的相同技术用于其它身体样品。癌细胞可以从癌症病灶脱落，并且出现在所述身体样品中。通过筛选此类身体样品，对于这些癌症可以实现简单的早期诊断。此外，疗法的进程也可以通过测试所述身体样品的靶基因或基因产物更容易地监测。富集癌细胞的组织制备物的方式是本领域已知的。例如，组织可以从石蜡或恒温箱切片分离。癌细胞也可以通过流式细胞术或激光捕获显微切割与正常细胞分离。这些技术，以及用于分离癌细胞和正常细胞的其它技术是本领域公知的。如果癌组织被正常细胞高度污染，那么检测标志性的基因或蛋白表达图谱可能会较困难，尽管已知使污染和/或假阳性/假阴性结果降到最低程度的技术(其中一些在下面进行讨论)。例如，还可以对样品进行生物标志存在的评估，所述生物标志已知与目的癌细胞相关，但是与相应的正常细胞不相关，或反之亦然。在本发明的方法中，获得并检查哺乳动物组织或细胞样品的一种或多种生物标志(例如，P1GF)的表达。多种生物标志在样品中的表达可以通过许多方法分析，其中多数方法是本领域已知的并且为技术人员所了解，包括，但不限于免疫组化分析和/或蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光激活的细胞分选(FACQ等、定量的基于血液的测定法(例如血清ELISA)(用于例如检查蛋白表达的水平)、生化酶促活性测定法、原位杂交、RNA印迹分析和/或mRNA的PCR分析，以及可以通过基因和/或组织阵列分析进行的多种测定法中的任一种。评价基因和基因产物状态的典型方法见于例如Ausubel 等，编辑，1995，现代分子生物学方案(Current Protocols In Molecular Biology)，单元 2(RNA 印迹(Northern Blotting))，4 (DNA 印迹(Southern Blotting))，15 (免疫印迹 (Immunoblotting)和18(PCR分析)。也可以使用多种免疫测定法如可获自Rules Based Medicine 或 Meso Scale Discovery (MSD)的那些免疫测定法。在本发明的一些实施方案中，使用免疫组织化学和染色方法来检查样品中靶蛋白的表达。组织切片的免疫组织化学染色显示是评估或检测样品中蛋白存在的可靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术，通常通过生色法或荧光法，使用抗体原位探测和显现细胞抗原。对于样品制备，可以使用来自于哺乳动物(典型地人患者)的组织或细胞样品。样品的实例包括但不限于组织的活组织检查、血液、肺抽吸物、痰、淋巴液、血浆等。样品可通过本领域已知的多种程序获得，包括但不限于外科切除、抽吸或活组织检查。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，样品在石蜡等中固定和包埋。可以通过常规技术(见例如，“武装部队病理学研究所的组织学染色方法手册(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology)，”第 3 版(1960)Lee G. Luna, HT(ASCP)编辑，McGraw-Hill Book 公司 Blakston分公司，纽约；武装部队病理学研究所组织学和病理学的先进实验室方法(The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Method in Histology and Pathology), (1994)Ulreka V. Mikel，编辑，武装部队病理学研究所(Armed Forces Institute of Pathology)，美国病理学登 i己处(American Registry of Pathology), Washington, D. C.)对组织样品进行固定(即，保存)。技术人员将理解固定剂选择是根据样品进行组织学染色还是其它分析的目的来确定的。技术人员还将理解固定的长短取决于所用的组织样品的大小和固定剂。例如，可以将中性缓冲的福尔马林，布安溶液或低聚甲醛用于固定样品。一般而言，将样品首先固定，接着通过系列升高的醇进行脱水，浸润并用石蜡或其它可以使组织样品被切片的切片介质进行包埋。备选地，可以切割组织并且固定获得的切片。例如，可以将组织样品通过常规方法，在石蜡中包埋和处理(见例如，“武装部队病理学研究所的组织学染色方法手册(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology)，上文)。可以使用的石蜡的实例包括，但不限于 Paraplast, Broloid和Tissuemay。一旦组织样品被包埋，可以通过切片机等对样品进行切片(见，例如“武装部队病理学研究所的组织学染色方法手册(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology),上文)。作为这禾中方法的实例，切片的范围可以在约3微米到约5微米的厚度。一旦被切片，这些切片可以通过一些标准方法附于载玻片。载玻片胶黏剂的实例包括，但不限于硅烷、明胶、聚-L-赖氨酸等。例如，可以将石蜡包埋的切片附于带正电荷的载玻片和/或用聚-L-赖氨酸包被的载玻片。如果将石蜡用作包埋物质，那么通常对组织切片进行去石蜡(cbparaffinize)并与水进行再水合。通过一些常规标准方法对组织切片进行去石蜡。例如，可以使用二甲苯和逐渐减少系列的醇(见，例如“武装部队病理学研究所的组织学染色方法手册(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology),上文)。备选地，可以使用商购的去石蜡非有机试剂如Hemo_De7(CMS，Houston, Texas)。任选地，样品制备后，可以使用IHC来分析组织切片。可以与其它的技术如形态学染色和/或荧光原位杂交结合进行IHC。可获得两种IHC通用方法；直接和间接测定法。根据第一种测定法，直接确定抗体与靶抗原的结合。这种直接测定法使用标记的试剂，如荧光标记或酶标记的初级抗体，其可以在没有进一步抗体相互作用的情况下显色。在典型的间接测定法中，未缀合的初级抗体结合于抗原并且接着，标记的次级抗体结合于初级抗体。如果所述次级抗体缀合于酶促标记，加入生色或荧光底物以提供抗原的显色。出现了信号放大，因为一些次级抗体可以与初级抗体上的不同表位反应。用于免疫组织化学的初级抗体和/或次级抗体典型地用可检测的结构部分进行标记。可以获得许多标记，其通常被归为下面的类别中(a)放射性同位素，如％，14(，1251，3!1和1311。抗体可以使用例如在当前的免疫学方法(Current Protocols in Immunology)，第 1 卷和第 2 卷，Coligen 等，编辑。 Wiley-hterscience，纽约，New York, Pubs. (1991)中所述的技术利用放射性同位素进行标记，并且可以使用闪烁计数法测量放射性。(b)胶体金颗粒。(c)荧光标记，包括，但不限于稀土螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、罗丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白或商购的荧光团如SPECTRUM 0RANGE7和 SPECTRUM GREEN7和/或上述任意一种或多种的衍生物。可以例如使用在当前免疫学方法 (Current Protocols in Immunology)，见上文中公开的技术将荧光标记缀合于抗体。荧光可以使用荧光计来量化。(d)可获得各种酶-底物标记并且美国专利号4，275，149提供其中一些的综述。 酶通常催化可以使用各种技术测量的生色底物的化学变化。例如，酶可以催化底物的颜色变化，这可以通过分光光度计测量。备选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于量化荧光变化的技术如上所述。化学发光的底物通过化学反应被电激发，接着可以发射可测量 (例如使用化学发光计)的光，或给荧光受体提供能量。酶促标记的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶，美国专利号4，737，456)、萤光素、2，3- 二氢酞嗪二酮、 苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、 葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合于抗体的技术在0' Sullivan等，制备用于酶免疫测定法中的酶_抗体缀合物的方法(Mehods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay),酶学方法(Method in Enzym)中·(J. Langone&H. Van Vunakis 编辑)，学术出版社，纽约，73 :147-166(1981)记载。酶-底物组合的实例包括，例如
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)，以过氧化氢酶作为底物，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(orthophenylene diamine) (OPD)或3，3‘ ,5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(Tiffi))；(ii)碱性磷酸酶(AP)，以对-硝基苯基磷酸作为生色底物；和(iii) β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，对-硝基苯基-β _D_半乳糖苷酶)或荧光底物(例如，4-甲基umbelIiferyl-β-D-半乳糖苷酶)。许多其它的酶-底物组合是本领域技术人员可获得的。关于这些的一般综述见美国专利号4，275，149和4，318，980。有时，所述标记可以间接与抗体缀合。技术人员知道实现所述缀合的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合并且上述四种广泛种类的标记的任一种可以与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合抗生物素蛋白，并且因此，所述标记可以以这种间接的方式与抗体缀合。备选地，为了获得标记与抗体的间接缀合，所述抗体与小的半抗原缀合，并且上述不同类型的标记之一与抗-半抗原抗体缀合。由此，可以实现标记与抗体的间接缀合。除了上述讨论的样品制备方法外，在IHC之前、过程中或之后进行组织切片的进一步处理可能也是需要的。例如，可以进行表位挽回方法(印itope retrieval method), 如在柠檬酸盐缓冲液中加热组织样品(见，例如，Leong等，应用免疫组织化学(Appl. Immunohistochem.)4(3) :201 (1996))。在任选的封闭步骤后，在充足的时间阶段内和适合的条件下，将组织切片暴露于初级抗体，从而使初级抗体结合于组织样品中的靶蛋白抗原。用于实现所述结合的适合的条件可以通过常规实验确定。通过使用上述讨论的任一种可检测标记来确定抗体与样品结合的程度。优选地，标记是催化生色底物如3，3’ - 二氨基联苯胺色素原的化学变化的酶促标记(例如HRP0)。优选地，酶促标记缀合于特异性结合于初级抗体的抗体(例如，初级抗体是兔多克隆抗体并且次级抗体是山羊抗-兔抗体)。由此制备的样本可以被封固并且用载玻片盖上。接着，例如使用显微镜确定载玻片评估，并且可以使用常规用于本领域的染色强度标准。在备选方法中，样品可以在足以形成抗体-生物标志复合物的条件下与特异于所述生物标志的抗体接触，接着检测所述复合物。可以以多种方式，如通过测定多种组织和样品，包括血浆或血清的蛋白质印迹法和ELISA方法检测生物标志的存在。使用这样的测定形式的多种免疫测定技术是可获得的，见，例如，美国专利号4，016，043,4, 424，279和 4，018，653。这些包括非竞争类型的单点和两点或“夹心式”测定法，以及传统的竞争结合测定法。这些测定法还包括将标记的抗体直接结合于靶生物标志。夹心式测定法是最有效和常用的测定法之一。存在夹心式测定法技术的许多变化，并且所有的变化都意欲涵盖在本发明中。简言之，在典型的正向测定法中，将未标记的抗体固定在固体基底上，并且使待测试的样品与结合的分子接触。在适合的温育阶段(足以形成抗体-抗原复合物的时间段)后，接着加入特异于抗原、并且用能够产生可检测信号的报道分子标记的第二抗体并进行温育，温育时间足以形成另一种抗体-抗原标记的抗体的复合物。任何未反应的物质被洗去，并且通过观察由报道分子产生的信号来确定抗原的存在。该结果可以是定性的，通过简单观察可视的信号进行，或可以是定量的，通过与包含已知量的生物标志的对照样品比较进行。
正向测定法的变化包括同时测定法，其中将样品和标记的抗体同时加入至结合的抗体。这些技术是本领域技术人员公知的，包括任何显而易见的微小变化。在典型的正向夹心式测定法中，特异于生物标志的第一抗体共价地或被动地结合于固体表面。固体表面典型地是玻璃的或聚合物的，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚乙烯氯或聚丙烯。固体支持物可以以试管、珠、微型板的盘形式存在，或可以是适合于进行免疫测定法的任何其它表面。结合方法是本领域公知的并且通常由交联共价结合或物理吸附组成，聚合物-抗体复合物在测试样品的制备中进行洗涤。接着，将待测试的样品的等分试样加入固相复合物并以充足的时间阶段(例如2-40分钟或过夜，如果更方便的话)和在适合的条件(例如从室温至40°C，如25°C-32°C，包括端点)下温育从而允许抗体中存在的任何亚基的结合。在温育阶段后，洗涤抗体亚基固相并且干燥，与特异于生物标志的一部分的第二抗体一起温育。所述第二抗体连接于报道分子，所述报道分子用于指示第二抗体与分子标志的结合。备选方法包括将靶生物标志固定在样品中，并且接着将固定的靶标暴露于可以用报道分子标记的或可以不用报道分子标记的特异性抗体。根据靶标的量和报道分子信号的强度，结合的靶标可以通过用抗体直接标记进行检测。备选地，将特异于第一抗体的第二标记抗体暴露于靶标-第一抗体复合物以形成靶标-第一抗体-第二抗体的三级复合物。复合物通过由报道分子发射的信号检测。所述“报道分子”，在本发明中使用时，意为通过其化学性质提供在分析上可鉴定的信号的分子，所述信号允许检测抗原结合的抗体。在这种类型的测定法中的最常用的报道分子是酶、荧光团或包含放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化学发光分子。在酶免疫测定法的情形中，酶通常通过戊二醛或高碘酸的方式缀合于第二抗体。 然而，如容易意识到的，存在多种技术人员容易得到的不同的缀合技术。常用的酶特别包括辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、β -半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。通常对特定的酶所用的底物进行选择，从而在由相应的酶水解后，用于产生可检测的颜色变化。适合的酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可以使用荧光底物，其产生荧光产物而不是上述生色底物。在所有的情形中，将酶-标记的抗体加入第一抗体-分子标志复合物，进行结合，接着洗去过量的试剂。随后，将包含适合的底物的溶液加入抗体-抗原-抗体的复合物中。底物将与连接第二抗体的酶反应，提供定性的视觉信号，这还可以进一步量化(通常通过分光光度测定法)，从而提供关于样品中存在的生物标志的量的指示。或者，可以将荧光化合物，如荧光素和罗丹明化学偶联于抗体而不改变它们的结合能力。当通过用特定波长的光照明来激活时，荧光染料标记的抗体吸收光能量，诱导分子中的激发状态，随后发射特征色的光，所述特征色可以用光学显微镜视觉检测。当在EIA中时，允许荧光标记的抗体结合于第一抗体-分子标志复合物。在洗去未结合的试剂后，接着使剩余的三级复合物暴露于适当波长的光，观察到的荧光指示目的分子标志的存在。免疫荧光和EIA技术都是本领域中充分建立的。然而，也可以使用其它的报道分子，如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。预期上述技术也可以用于检测PlGF的表达。本发明的方法还包括检查组织、细胞或血浆样品中PlGF mRNA水平的存在和/或表达的方案。用于评价细胞中的mRNA的方法是公知的，并且包括，例如使用互补DNA探针的杂交测定法(如使用特异于PlGF的标记的核糖核酸探针的原位杂交，RNA印迹和相关技
27术)和各种核酸扩增测定法(如使用特异于PlGF的互补引物的RT-PCR和其它扩增类型的检测方法，如，例如分支DNA、SISBA、TMA等)。可以使用RNA印迹法、斑点杂交或PCR分析方便地测定哺乳动物的组织、细胞或血浆样品的mRNA。例如，RT-PCR测定法，如定量PCR测定法是本领域中公知的。在本发明的举例说明的实施方案中，用于检测生物样品中的靶mRNA的方法包括通过使用至少一种引物的反转录从样品中产生cDNA ；使用靶多核苷酸作为有义和反义引物扩增这样产生的cDNA 以扩增其中的靶cDNA ；和检测扩增的靶cDNA的存在。此外，所述方法可以包括使技术人员确定靶mRNA在生物样品中的水平的一个或多个步骤(例如，通过同时检查“持家”基因如肌动蛋白家族成员的比较对照mRNA序列的水平)。任选地，可以确定扩增的靶cDNA的序列。本发明的任选方法包括通过微阵列技术检查或检测组织、细胞或血浆样品中的 mRNA,如靶mRNA的方法。使用核酸微阵列，对来自测试和对照样品的测试和对照mRNA样品进行反转录和标记以产生cDNA探针。所述探针接着与固定在固体支持物上的核酸阵列杂交。对所述阵列进行构造从而使阵列的每个成员的序列和定位是已知的。例如，可以将其表达与抗血管生成治疗的增大或减小的临床效果相关的基因选择物排列在固体支持物上。标记的探针与特定的阵列成员的杂交指示探针来自其中的样品表达该基因。疾病组织的差别基因表达分析可以提供有价值的信息。微阵列技术使用核酸杂交技术和计算机技术来在单一实验中评价数千基因的mRNA表达图谱(见，例如，在2001年10月11日公开的 WO 01/75166)；(见例如，U. S. 5，700，637，美国专利 5，445，934 和美国专利 5，807，522， Lockart,自然生物技术(Nature Biotechnology)，14 1675-1680 (1996) ；Cheung, V. G.等， 自然遗传学(Nature Genetics) 21 (增刊)15-19 (1999)，关于阵列制作的讨论)。DNA微阵列是包含基因片段的微型阵列，所述基因片段直接合成在或点样到玻璃或其它基底上。 数千基因通常在单一阵列中展示。典型的微阵列实验包括下列步骤1)制备从样品分离的 RNA的荧光标记的靶标，幻将标记的靶标与微阵列杂交，幻洗涤、染色和扫描阵列，4)分析扫描的图像和5)产生基因表达图谱。目前使用两种主要类型的DNA微阵列寡核苷酸(通常是25-70mers)阵列和包含从cDNAs制备的PCR产物的基因表达阵列。在形成阵列时，寡核苷酸可以是预制的并且点样到表面上或直接合成到所述表面上(原位)。Affymetrix GeneChip 系统是商购的微阵列系统，其包括通过直接在玻璃表面上合成寡核苷酸而制备的阵列。探针/基因阵列通常为25mers的寡核苷酸通过基于半导体的照相平版印刷术和固相化学合成技术的组合直接合成到玻璃晶片(glass wafer) 上。每个阵列包含多到400，000个不同的低聚物，并且每种低聚物以百万个拷贝存在。 由于寡核苷酸探针在阵列上的已知位置合成，杂交模式和信号强度可以由Affymetrix Microarray Suite软件，根据基因特性和相对表达水平进行解释。每个基因通过一系列不同的寡核苷酸探针展示在阵列上。每个探针对由完全匹配的寡核苷酸和错配的寡核苷酸组成。完全匹配的探针具有完全互补于特定基因并由此测量该基因表达的序列。错配的探针与完全匹配的探针不同之处在于中心碱基位置的单一碱基置换，所述碱基置换干扰了靶基因转录物的结合。这有助于确定背景杂交和非特异性杂交，其有助于关于完全匹配的低聚物所测量的信号。Microarray Suite软件将错配探针的杂交强度从完全匹配的探针的杂交强度中扣除从而确定关于每个探针组的绝对或特定强度值。基于目前来自Genbank和其它核苷酸所有组成成分(repositories)的信息选择探针。认为所述序列识别基因的3’端的独特区域。将基因芯片杂交炉(“rotisserie”烘箱)用于同时进行多到64个阵列的杂交。流控站进行探针阵列的洗涤和染色。所述流控站是完全自动化的并且包含四个组件，其中每个组件控制一个探针阵列。每个组件通过使用预先编程流控流程的Microarray Suite软件独立控制。扫描器是共焦激光荧光扫描器，其测量由结合于探针阵列的标记的 cRNA发射的荧光强度。具有Microarray Suite软件的计算机工作站控制流控站和扫描器。 Microarray Suite软件可以控制多到8个流控站，所述流控站使用预先编程的关于探针阵列的杂交、洗涤和染色流程。软件还获得杂交强度数据，并使用适合的算法将所述杂交强度数据转化为每个基因的存在/不存在。最终，软件通过比较分析检测实验之间基因表达的变化并将输出格式化为.txt文件，这可以用于其它的软件程序进行进一步的数据分析。选定的生物标志在组织或细胞样品中的表达也可以通过功能性测定法或基于活性的测定法进行检查。例如，如果生物标志是酶，那么可以进行本领域已知的测定法来确定或检测给定的酶促活性在组织或细胞样品中的存在。本发明的试剂盒具有许多实施方案。典型的实施方案是这样的试剂盒，其含有容器、在所述容器上的标签和包含于所述容器内的组合物；其中所述组合物包括结合PlGF的初级抗体，所述容器上的标签显示所述组合物可以用于评估至少一种类型的哺乳动物细胞中PlGF的存在，和关于使用抗体来评估至少一种类型的哺乳动物细胞中PlGF的存在的说明。所述试剂盒还可以包括用于制备组织、细胞或血浆样品和将抗体和探针应用于组织、细胞或血浆样品的相同部分的一组说明书和材料。所述试剂盒可以包括初级抗体和次级抗体，其中所述次级抗体与标记物，例如酶标记物缀合。另一个实施方案是这样的试剂盒，其包括容器、所述容器上的标签、和容纳在所述容器中的组合物；其中所述组合物包括一种或多种在严格条件下与PlGF杂交的多核苷酸， 所述容器上的标签显示所述组合物可以用于评估至少一种类型的哺乳动物细胞或血浆中 PlGF的存在，和关于使用多核苷酸来评估至少一种类型的哺乳动物细胞或血浆中PlGF RNA 或DNA存在的说明。试剂盒中的其他任选成分包括一种或多种缓冲剂(例如，封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂诸如由酶标记物化学改变的底物(例如，发色团)，表位挽回溶液(印itope retrieval solution)、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照切片等。对于本发明的方法，根据已知方法将抗癌治疗剂、抗-血管发生剂和/或化疗剂施用于人患者，所述方法如作为推注(bolus)的静脉内施用或在一定时间阶段内通过持续输注施用，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑液内、鞘内、 口服、局部或吸入途径进行施用。抗体的静脉内或皮下施用是优选的。本发明的治疗可涉及组合施用抗-VEGF抗体和一种或多种化疗剂。本发明涵盖施用不同化疗剂的混合物。组合施用包括使用分开的制剂或单一药物制剂的共施用，和任一次序的顺次施用，其中优选地有一段时间两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学活性。 该化疗剂的准备和给药方案可依照制造商的说明使用或由熟练的技术人员凭经验确定。化学疗法的准备和给药方案也在化学疗法服务(Chemotherapy Service)，编辑，Μ. C. Perry, ffilliams&ffilkins, Baltimore, MD(1992)中描述。化疗剂可以在施用抗体之前或之后，或可以与其同时给予。对于疾病的预防或治疗，抗癌治疗剂或抗-血管发生剂的适宜剂量取决于上文定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、施用药剂是用于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对药剂的反应、及主治医师的判断。将药剂一次性或者在一系列治疗中适当的施用于患者。在组合治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或协同量施用。 在一些实施方案中，抗-血管发生剂是VEGF拮抗剂，例如抗-VEGF抗体，如贝伐珠单抗。根据疾病的类型和严重程度，大约1 μ g/kg到50mg/kg(例如0. l-20mg/kg)的抗体是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，或者是通过连续输注。典型每日剂量的范围可以为大约1 μ g/kg到大约100mg/kg或者更多，取决于上述因素。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据疾患，治疗维持到直至发生期望的疾病症状抑制。然而， 其它剂量方案可能也是有用的。在优选的方面，本发明的抗体每两至三周以剂量范围大约 5mg/kg至大约15mg/kg施用。更优选地，此类给药方案与化疗方案组合作为治疗转移性结肠直肠癌的一线疗法。在一些方面，化疗方案涉及传统高剂量间歇性施用(intermittent administration)。在一些其它方面，化疗剂使用更小和更频繁的剂量施用，没有预定的间歇(节律化学疗法(“metronomic chemotherapy”))。本发明的疗法的进展通过常规技术和测定容易地监测。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。在某些实施方案中，例如，当组合使用时，贝伐珠单抗以从大约0. 05mg/kg至大约15mg/kg的范围施用。在一个实施方案中，可向受试者施用大约0. 5mg/kg, 1. 0mg/kg,2. 0mg/kg, 3. Omg/ kg,4. Omg/kg,5. Omg/kg,6. Omg/kg,7. Omg/kg,7. 5mg/kg,8. Omg/kg,9. Omg/kg,lOmg/kg 或 15mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可间歇性施用，例如每天、每三天、 每周或每两至三周。在另一个实施方案中，例如，当组合使用时，贝伐珠单抗以每隔一周 10mg/kg或每三周15mg/kg静脉内施用给受试者。下述实施例仅为示例性目的提供，不应根据本文教导作限制性解释。 实施例实施例1癌症患者中更高基线PlGF水平与更短存活相关研究受试者和治疗样品收集自AVF-0776，其是至少一种用于转移性疾病的常规化疗方案后已经复发的患有转移性乳腺癌患者的贝伐珠单抗单一疗法(monotherapy)的研究。所有受试者每2 周接受3mg/kg、1 Omg/kg或20mg/kg的贝伐珠单抗，共六次输注。在第70天肿瘤评估时，无疾病进展证据的受试者可继续接受每2周的贝伐珠单抗直到第1M天(六次以上输注)，然后进行肿瘤评估。在第巧4天无疾病进展证据的受试者在第168天接受贝伐珠单抗的最终输注。经历疾病进展的受试者从该研究中停止。在完成研究或退出研究后，在第0天后对受试者进行1年存活状态的追踪。样品和方法来自于受试者的外周静脉血直接抽入带有淡紫色常规盖子的BD Vacutainer塑料EDTA管中。收集后，轻轻混合样品并允许其静置30分钟。通过在室温3，OOOxg离心20 分钟获得血浆。选择来自全部67个患者的样品，这些患者用贝伐珠单抗处理后患有复发的转移性乳腺癌，并且可从这些患者在第0天至第56天(第0天、第14天、第观天、第42天和第56天)至少两个时间点获得血浆样品。
根据制造商的说明书，在治疗开始之前的第0天时用MSD MS6000人生长因子试剂盒(K11029C-1 Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)测量患者血浆中的基线 PlGF 水平。为了使PlGF水平和临床结果关联，使用Kaplan-Meier方法学和时序(log-rank) (Mantel-Cox)检验用于分析从研究起始(首次给药)的存活期。结果该时序检验(log-rank test)确定在基线的^pg/ml血浆PlGF水平与患者的总存活相关显著变化(P < 0. 0026 ；见图1)。在开始治疗之前第O天具有大于^pg/ml的基线血浆PlGF水平的患者中，中值总存活时间是171天。相比之下，在开始治疗之前第O天具有小于或等于^pg/ml的基线PlGF水平的患者中，中值总存活时间是417天。这些结果表明患者基线血浆PlGF水平是进行抗-血管发生疗法的癌症患者的存活益处的预测指标 (predictor)0实施例2 用贝伐珠单抗治疗的患者中血浆PlGF水平增加如上面实施例1中所描述，治疗患者并收集血浆样品。在贝伐珠单抗治疗的过程中监测血浆PlGF水平。结果显示用贝伐珠单抗治疗之后血浆PlGF水平增加(见图幻。用贝伐珠单抗治疗之后的第14、28、42和56天在患者中观察到超过1. 5倍的中值增加。实施例3 用贝伐珠单抗治疗之后的患者中更高的血浆PlGF水平与更短的总存活相关如上面实施例1中所描述，治疗患者，测量血浆样品和血浆PlGF水平。为了使血浆PlGF水平和临床结果相关，使用Kaplan-Meier方法学和时序(Mantel-Cox)检验用于分析从研究起始(首次给药)的存活期。时序检验结果表明在贝伐珠单抗治疗第14天50pg/ml的血浆PlGF水平是与患者的总存活相关的重要变量(P < 0. 0003 ；见图3)。开始贝伐珠单抗治疗之后具有大于50pg/ ml的基线血浆PlGF水平的患者的中值存活时间为165天。相比之下，开始贝伐珠单抗治疗之后具有小于或等于50pg/ml的血浆PlGF水平的患者的中值存活时间为431天。这些结果表明已经开始用抗血管生成疗法(例如贝伐珠单抗)治疗的患者中血浆PlGF水平是进行抗-血管发生疗法的癌症患者中存活益处的预测指标(predictor)。
权利要求
1.鉴定可受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法的患有癌症的患者的方法，包括确定从所述患者获得的样品中胎盘生长因子(PlGF)的表达水平， 其中，与参照样品相比较，从所述患者获得的样品中PlGF增加的表达水平表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。
2.预测患有癌症的患者对抗-血管生成疗法的反应性的方法，包括确定从所述患者获得的样品中PlGF的表达水平，其中，与参照样品相比较，从所述患者获得的样品中PlGF增加的表达水平表明所述患者对单独的抗-血管生成疗法有反应的可能性更低。
3.监测抗-血管生成疗法的效力的方法，包括确定从患者获得的样品中PlGF的表达水平，其中，与参照样品相比较，从所述患者获得的样品中PlGF增加的表达水平表明所述患者对单独的抗-血管生成疗法有反应的可能性更低。
4.优化癌症治疗的治疗功效的方法，所述方法包括确定从患者获得的样品中PlGF的表达水平，其中，与参照样品相比较，从所述患者获得的样品中PlGF增加的表达水平表明所述患者对单独的抗-血管生成疗法有反应的可能性更低。
5.权利要求1-4中任意一项的方法，其中从所述患者获得的样品中PlGF的表达水平与参照样品相比较增加至少大约1. 5倍。
6.权利要求1-4中任意一项的方法，其中所述抗-血管生成疗法包括施用VEGF拮抗剂。
7.权利要求6的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。
8.权利要求7的方法，其中所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。
9.权利要求5的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
10.权利要求1-4中任意一项的方法，其中从所述患者获得的样品是血浆。
11.权利要求10的方法，其中PlGF的表达水平通过检测血浆中的PlGF蛋白来确定。
12.权利要求1-4中任意一项的方法，其中所述样品在抗-血管生成疗法之前从所述患者获得。
13.权利要求1-4中任意一项的方法，其中所述样品在抗-血管生成疗法开始之后从所述患者获得。
14.权利要求12的方法，其中所述样品在抗-血管生成疗法开始之后的M小时内从所述患者获得。
15.权利要求12的方法，其中所述样品在抗-血管生成疗法开始之后的14天内从所述患者获得。
16.权利要求1-4中任意一项的方法，还包括向所述患者施用抗癌疗法，其中所述抗癌疗法不同于抗-血管生成疗法或是除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。
17.权利要求16的方法，其中，从所述患者获得样品中PlGF的表达水平与参照样品相比较增加时，向所述患者施用所述抗癌疗法。
18.检测PlGF表达水平的试剂盒，所述试剂盒包括能够特异性检测PlGF表达水平的化合物；和使用所述试剂盒预测患有癌症的患者对单独抗-血管生成疗法的反应性的说明书，其中，与参照样品相比较，PlGF增加的表达表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成疗法的抗癌疗法或除抗-血管生成疗法以外的抗癌疗法。
全文摘要
本文公开了用于鉴定可能赋予患有癌症患者最佳临床益处疗法的方法和组合物。
文档编号G01N33/574GK102265157SQ200980152483
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月22日 优先权日2008年12月23日
发明者严义兵, 保罗·J·菲尔德, 吴群·珍妮 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司