在来源于CHO细胞的糖蛋白产物中的含有半乳糖-α-1,3-半乳糖的N-聚糖的制作方法

专利名称：在来源于CHO细胞的糖蛋白产物中的含有半乳糖-α-1,3-半乳糖的N-聚糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测从哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白质中的特殊聚糖结构的方法和材料。
背景技术：
在哺乳动物细胞培养物例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产了许多重组治疗性生物药物产品。哺乳动物细胞培养物与其他表达系统(例如酵母和原核系统)相比是优选用于生产重组糖蛋白的，主要是因为哺乳动物细胞培养物产生具有糖基化模式的糖蛋白， 通常这些糖基化模式是被人类识别和耐受的。末端α -连接的半乳糖(gal- α -1,3-gal)连接的潜在不利影响是已知的(Chung et al. ,N Engl J Med, 358 11 (2008)) 0以前已经报道这类末端α-gal连接在由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞所产生的重组糖蛋白中是不存在的。例如，尽管在NSO(—种从鼠类开发的骨髓瘤细胞系)中产生的抗CDw52抗体(坎帕斯，Campath)包括潜在免疫原性的糖型，这些糖型具有非还原性末端α “连接的半乳糖残基，由CHO细胞产生的坎帕斯主要包含3种糖型，这些糖型与正常的人类IgG是一致的(Sheeley et al.，Analytical Biochemistry 247 :102-110(1997))。发明概述本发明部分地是基于以下发现，即由重组CHO细胞产生的糖蛋白包含具有末端半乳糖-α-1，3-半乳糖连接的聚糖结构，这可能对于将这类糖蛋白用于治疗性目的具有有害影响。例如，将具有末端α-gal连接的糖蛋白施用于人类用于治疗性目的可以导致在患者体内形成针对该重组糖蛋白的单克隆抗体，这样使得随后的给药变得效果更低或甚至在该患者体内引起不利的超敏反应。与上述传授的内容相反，诸位申请人令人惊奇地发现在CHO细胞培养物中产生的大部分的重组糖蛋白可以展示出末端gal-a-l，3-gal连接的存在，表明对于施用于患者的蛋白和肽基产物发生不良反应的可能性。本发明提供了对于生产和分析来自CHO细胞的重组糖蛋白有用的多种化合物和方法以及包含这类糖蛋白的组合物，其中这些糖蛋白包括调节(例如，减少或在一些情况下增加)水平的末端gal-α -l，3-gal连接。因此，在一个第一方面，本发明包括用于对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞群进行评估的方法。在某些实施方案中，该检测方法包括(a)提供来自该群的一个或多个CHO细胞；并且 (b)对包含由所述细胞生成的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖进行测量， 其中这些CHO细胞还没有被基因工程化以表达α -半乳糖苷转移酶编码序列。该测量步骤可以包括以下各步骤的任何步骤(a)分离由这些细胞所产生的糖蛋白并且测量在这些糖蛋白上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(b)分离由这些细胞所产生的特异性糖蛋白成分并且测量在该分离的糖蛋白成分上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(c)从由这些细胞所产生的糖蛋白中分离聚糖，并且测量在这些分离的聚糖中的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(d)从在糖蛋白或该一个或多个CHO细胞上存在的聚糖切割单糖，并且检测来自这些切割的单糖的末端释放半乳糖残基，(e)从来自于由这些细胞产生的糖蛋白提供至少一种肽，并且测量该至少一种肽上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(f)通过测量在该一个或多个 CHO细胞的细胞表面上的聚糖对该糖蛋白上的包含末端半乳糖_ α -1-3-半乳糖残基的聚糖的相对水平进行测量。用来测量末端gal-α -l，3_gal连接的技术可以包括以下方法中的一种或多种，以及这些方法的任何一种的组合色谱方法、质谱(MS)法、电泳法(例如，毛细管电泳)、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收法、酶法、以及检测分子(如一种抗体或凝集素)的使用。用于步骤2的测量的聚糖的来源可以是选自下组，该组由下列各项组成CH0细胞群；在这些CHO细胞的表面上表达的糖蛋白或聚糖；通过切割在CHO细胞群中的细胞的表面上存在的蛋白质而 得到的肽；在CHO细胞群的表面上存在的聚糖；由CHO细胞群所分泌或表达的糖蛋白、由一个CHO细胞或一个CHO细胞群所表达的分离的糖蛋白表达产物；来源于由一个CHO细胞或一个CHO细胞群所表达的分离的蛋白表达产物的肽；或来源于由一个 CHO细胞或直接地由一个CHO细胞群所表达的分离的蛋白表达产物的聚糖。在一些实施方案中，该方法包括用一种或多种外切糖苷酶(包括α-半乳糖苷酶)来处理聚糖或糖蛋白的一种来源，随后对该聚糖群进行分析。在一些实施方案中，所使用的方法提供了对包含末端半乳糖_ α -1-3-半乳糖残基的聚糖进行定量测量。在一些实施方案中，所使用的方法提供了一种定性测量。在一些实施方案中，该方法还包括从CHO细胞的培养物制备一种糖蛋白制剂，从该糖蛋白制剂(例如用一种或多种糖苷酶，例如α -1，3_半乳糖苷酶、α -1，4_半乳糖苷酶、 或α-1，6_半乳糖苷酶)切割一种或多种聚糖，以及对包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖进行测量。在某些实施方案中，该方法是在用于治疗性糖蛋白的生产进行期间通过从该生产线的CHO细胞培养物获得一种样品来进行的，例如在生产期间监测聚糖的结构。在某些实施方案中，随着时间的过去该测量步骤被重复至少一次，例如在培养这些CHO细胞的时间期间，该测量步骤被重复至少一次、两次、三次或更多次。在其他实施方案中，在由CHO细胞产生的糖蛋白产物上进行该方法，例如作为该糖蛋白产物的质量或释放测试的一部分。在一些实施方案中，该测量步骤包括将从一个第一 CHO细胞群产生的一种第一糖蛋白制剂中的包含末端半乳糖_ α -1-3-半乳糖残基的聚糖的水平与从一个第二 CHO细胞群产生的一种第二糖蛋白制剂中的包含末端半乳糖- α -1-3-半乳糖残基的聚糖的水平进行比较。在一些这类实施方案中，对来自在不同培养条件下培养的CHO细胞群的糖蛋白制剂的聚糖进行了测定和比较。在一些实施方案中，该方法可以进一步包括将包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的聚糖的水平与一个参比水平(例如，与一个对照水平、或与产品说明书中的一个范围或值)进行比较的一个步骤。在该方法的某些实施方案中，该测量步骤包括使用一种检测分子，该分子能够检测末端α-半乳糖基残基的存在或缺乏。在某些实施方案中，该检测分子包括一种抗体，该抗体能够结合到末端α-半乳糖基表位上。在本发明的其他实施方案中，该检测分子包括一种凝集素。在一些实施方案中，该检测分子可以包括一种荧光部分、或一种放射性同位素部分。该CHO细胞群可以包括一种克隆细胞群。例如，该CHO细胞群可以是在培养物中， 或者是来自用于制造治疗性糖蛋白的生物反应器中的细胞培养物的一种样品。在某些实施方案中，已经用至少一种编码治疗性糖蛋白的载体转化了该CHO细胞群。该治疗性糖蛋白可以是人、非人或合成起源的。该治疗性糖蛋白可以用于治疗人类或兽医的适应症。在一些实施方案中，该方法进一步包括对由该细胞产生的糖蛋白的生物活性进行评估的一个步骤，例如对该糖蛋白的免疫原性可能性的存在或水平进行评估(例如，体外或体内，例如在动物模型中)。在一个第二方面，本发明包括用于筛选一个或多个中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在糖蛋白上产生包含末端半乳糖- α -1-3-半乳糖残基的聚糖的能力的方法，该方法包括(a)提供多个CHO细胞群，其中该多个群中没有一个已经被基因工程化以在这些聚糖上产生末端α-半乳糖基残基(例如，还没有被基因工程化以表达α-半乳糖基转移酶编码序列)；(b)在适合用于表达糖蛋白表达产物的条件下，对该多个CHO细胞的每一个进行
培养；(c)测量由该多个CHO细胞中每一个所产生的包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的聚糖，并且(d)基于目标水平的由选定的CHO细胞制剂所产生的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的存在来选择一种或多种CHO细胞制剂。可以从由CHO细胞制剂产生的糖蛋白、从CHO细胞制剂的分离的糖蛋白表达产物、从由CHO细胞制剂的糖蛋白表达产物中得到的肽、从CHO细胞制剂的细胞表面聚糖、或从由CHO细胞制剂得到的聚糖制剂或从它们的糖蛋白表达产物来得到和测量包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的聚糖。在某些实施方案中，该筛选方法进一步包括从细胞培养物中分离糖蛋白表达产物以及对在由步骤(c)中的细胞所产生的糖蛋白上的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基进行测量的步骤。在某些实施方案中，该细胞筛选方法进一步包括对该糖蛋白表达产物上存在的α-半乳糖基残基的量进行定量的步骤。在某些实施方案中，细胞筛选方法的步骤(b)发生在一个生物反应器中。该多个CHO细胞群的每一个可以包含一个不同的CHO株系群、一个不同的克隆细胞群、或在用于治疗性糖蛋白的制造进程中来自一种细胞培养物的不同的样品(例如，随着时间的过去而采取的样品)。在某些实施方案中，已经用至少一个编码治疗性糖蛋白(例如，人治疗性糖蛋白)的载体转化了该CHO细胞群。在细胞筛选方法的某些实施方案中，该糖蛋白表达产物是从CHO细胞表达的一种分泌的糖蛋白。该筛选方法的测量步骤可以包括在此所披露的用于鉴定/或定量糖蛋白上的末端α-半乳糖基残基的任何技术。在一个第三方面，本发明包括一种用于对CHO细胞宿主体内产生的糖蛋白成分进行评估的方法。该方法包括对存在于糖蛋白成分中的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖的量进行测量，其中该糖蛋白成分是在CHO宿主细胞中生产的，并且其中这些CHO宿主细胞没有被基因工程化以表达α-半乳糖苷转移酶编码序列。在某一实施方案中，该方法包括将存在于该糖蛋白成分中的末端半乳 糖-α -1-3-半乳糖的水平记录在打印物或计算机可读介质中。在一些实施方案中，该方法还包括将测量的存在于该糖蛋白成分中的末端半乳 糖-α-1-3-半乳糖的水平与參比水平(例如，一个对照或參比规格)进行比较。该參比水 平可以是ー种规格(例如，ー个FDA标签或医师的插入物)或包含该糖蛋白成分的药物制 剂的质量标准。在一些实施方案中，该參比水平或质量标准是不大于糖蛋白组分中存在的末端半 乳糖-α-1-3-半乳糖的 5%，例如不大于 4. 5%、4%、3. 5%、3%、2. 5%、2%、1. 5%、1%、 0. 5%,0. 25%,0. 2%,0. 或更少。可以将存在于糖蛋白成分中的半乳糖-α -1-3-半乳 糖的水平测量为相对于在一种样品(例如ー种糖蛋白制剂)中的聚糖的总量的包含半乳 糖-α -1-3-半乳糖的聚糖的水平。在一个实施方案中，用来測量末端gal-α -l，3_gal连接的技术包括色谱法。在一个实施方案中，用来測量末端gal-a-l，3-gal连接的技术包括质谱(MS)法。在一个实施方案中，用来測量末端gal-a -l，3_gal连接的技术包括电泳法(例 如，毛細管电泳)。在一个实施方案中，用来測量末端gal-a-l，3-gal连接的技术包括核磁共振 (NMR)法。在一个实施方案中，用来測量末端gal-α -l，3_gal连接的技术包括单糖分析。在一个实施方案中，用来測量末端gal-α -l，3_gal连接的技术包括荧光法。在一个实施方案中，用来測量末端gal-α-l，3_gal连接的技术包括UV-VIS吸收。在一个实施方案中，用来測量末端gal-α -l，3_gal连接的技术包括酶法。在一个实施方案中，用来測量末端gal-a-l，3-gal连接的技术包括并且使用检 测分子(例如ー种抗体或凝集素)。附图简要说明

图1是N-聚糖结构共有的核心五糖的ー个图示。图2是具有ー个末端gal-α -l，3_gal连接的非还原性末端N-聚糖结构的ー个3是从阿巴西普得到的聚糖的一部分的荧光色谱图，显具有成分 HexNAc4Hex6Fuc1的聚糖种类的检测，该成分可能相应于ー种包含半乳糖-α _1_3连接的半 乳糖的结构。图4展示了从阿巴西普得到的具有成分HexNAc4Hex6Fuci的聚糖种类的MS2图谱。 这些图谱与包含一个非还原性末端半乳糖-α -1-3-半乳糖的聚糖结构相关。图5是在用α -半乳糖苷酶进行处理之前和之后，从阿巴西普得到的聚糖的一部 分以及ー种对照蛋白(也包含具有成分HexNAc4Hex6Fuci的聚糖)的荧光色谱图。图6是具有成分HexNAc4Hex5Fuci的种类的ー个MS2图谱，该成分是通过用α -半 乳糖苷酶处理从阿巴西普得到的聚糖部分而产生的。图7展示了聚糖的一部分的MALDI-MS图谱，这些聚糖是用不同的外切糖苷酶处理 阿巴西普而得到的。
定义除非在下文中另外定义，在此所使用的所有术语都是以如本领域普通技术人员所应当理解的它们通常的含义来使用的。大致、约、大约如在此所使用，术语“大致”、“约”或“大约”当应用于一个或多个所感兴趣的值时，是指与一个所陈述的参考值相类似的值。在某些实施方案中，术语“大致”、 “约”或“大约”是指落在所陈述的参考值的以下比例之内的数值的范围25<%、20%、19%、
1%、或更小。检测(Detection)，检测了(Detecting)如在此所使用的，术语“检测了”、“检测” 以及“检测手段”是可以互换地使用的用来指确定在一种化合物、成分、细胞或细胞群之中或之上一种特殊的化学部分(例如，一个末端α-1，3-半乳糖基残基)是存在还是缺乏。 检测手段可以包括选择性标记、或可识别的特征(例如荧光或放射性部分)，并且可以涉及对试剂、化合物、细胞或细胞群进行标记。检测还可以指使用这类技术(如质谱法或相关方法、电泳法、核磁共振、色谱法、或上述的组合)对化合物、成分、细胞或细胞群进行分析以确定在化合物、成分、细胞或细胞群之中或之上的一种化学部分的存在或缺乏。检测还可以涉及对被检测的化学部分的绝对水平或相对水平进行定量。聚糖如本领域内已知并且在此所使用，“聚糖”是多种糖。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，但典型地包含至少三个糖，并且可以是直链的或分支的。聚糖可以包括天然的糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、 阿拉伯糖、核糖、木糖、等等)和/或经修饰的糖(例如，2’-氟代核糖、2’-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺基N-乙酰葡糖胺、等等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和异聚物。术语 “聚糖”还涵盖了糖蛋白糖的一个聚糖组分(例如，一种糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等等的一个聚糖组分)。该术语还涵盖游离的聚糖，包括从一种糖蛋白中已经被切割的或以别的方式所释放的聚糖。聚糖制剂如在此所使用的术语“聚糖制剂”是指根据一个具体的产生方法而获得的一组聚糖。在一些实施方案中，聚糖制剂是指从一种糖蛋白制剂(见以下糖蛋白制剂的定义)中获得的一组聚糖。在一些实施方案中，一种聚糖制剂包括多种糖蛋白。在一些实施方案中，一种聚糖制剂包括多种释放的聚糖。糖蛋白如在此所使用，术语“糖蛋白”是指一种“蛋白质”(如在此定义的)，该蛋白质包含共价连接至一个或多个糖部分(即，聚糖)上的一个肽主链。如本领域的普通技术人员所理解，这种肽主链典型地包括具有多个氨基酸残基的一个直链。这个或这些糖部分可以是处于单糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。这个或这些糖部分可以包括糖残基的一个单一的无分枝的链或者可以包括一个或多个分枝的链。在某些实施方案中，这些糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基团。可替代地或另外地，这些糖部分可以包括乙酰基、羟乙酰基、丙基或其他烷基修饰。在某些实施方案中，这些糖蛋白包含0-连接的糖部分；在一些实施方案中，这些糖蛋白包含N-连接的糖部分。糖蛋白制剂如在此所使用，术语“糖蛋白制剂”是指一组单个的糖蛋白分子，该组中的每一个包括具有一个特定氨基酸序列(该氨基酸序列包括至少一个糖基化位点)的一种多肽以及共价附连到该至少一个糖基化位点上的至少一种聚糖。在糖蛋白制剂中的一种特定糖蛋白的单个的分子典型地具有相同的氨基酸序列，但是可能在该至少一个糖基化位点的占用方面和/或在被连接到该至少一个糖基化位点上的聚糖的一致性方面不同。艮口， 一种糖蛋白制剂可以仅包括一种特定的糖蛋白的一种单一糖型，但是更典型地包括多种糖型。相同的糖蛋白的不同制剂可以在所存在的糖型的一致性方面(例如，在一种制剂中存在的糖型可能是另一种制剂所缺乏的)和/或在不同糖型的相对量方面不同。糖苷酶如在此所使用的术语“糖苷酶”是指一种试剂，该试剂切割位于聚糖中的多个连续的糖之间或糖与主链部分之间(例如，在糖蛋白的糖与肽主链之间)的一种共价键。在一些实施方案中，糖苷酶是一种酶。在某些实施方案中，糖苷酶是含有一个或多个多肽链的一种蛋白质(例如，一种蛋白质酶(protein enzyme)).在某些实施方案中，糖苷酶是一种化学切割试剂，例如胼。N-聚糖如在此所使用，术语“N-聚糖”是指多种糖的一种聚合物，该聚合物已经从一种糖蛋白中释放，但是之前通过一个氮连接而连接到一种糖蛋白上(参见以下N-连接的聚糖的定义)。N-连接的聚糖N-连接的聚糖是通过一个氮连接而连接到一种糖蛋白上的聚糖。 存在着不同分类的N-连接的聚糖，但是它典型地是基于共同的核心五糖(Man)3(GlcNAc) (GlcNAc)。0-聚糖如在此所使用，术语“0-聚糖”是指多个糖的一个聚合物，该聚合物已经从一种糖缀合物中释放，但是之前通过一个氧连接而连接到该结合糖上(参见以下0-连接的聚糖的定义)。0-连接的聚糖0-连接的聚糖是通过一个氧连接而连接到一种糖缀合物上的聚糖。0-连接的聚糖典型地通过N-乙酰基-D-半乳糖胺(GaINAc)而被附连至糖蛋白上或者通过N-乙酰基-D-葡糖胺(GIcNAc)而被附连至L&#8212 ；L-丝氨酸(kr)或L-苏氨酸 (Tlir)的羟基基团上。一些0-连接的聚糖还具有多种修饰，如乙酰化和硫酸化。调节术语“调节”，如在此使用的，是指一种作用物在规定的限度内控制参数的值(如存在于糖蛋白成分中的α-半乳糖残基的水平)的能力。因此，在一些实施方案中， 可以对α-半乳糖残基的水平进行调节从而它保持在规定的限度内。在一些实施方案中， 可以对α-半乳糖残基的水平进行调节从而它不超过存在于糖蛋白成分中的总N-聚糖的 5.0%、1.0%、0.5%、0. 1%、0.05%或0.01%以上。在其他实施方案中，可以对α -半乳糖残基的水平进行调节从而它的改变不超过所规定的或所希望的水平的10.0%、5.0%、 1. 0%、05%或 0. 1%ο蛋白酶如在此所使用的术语“蛋白酶”是指一种试剂，该试剂切割位于一个多肽链中的多个连续的氨基酸之间的一种肽键。在一些实施方案中，蛋白酶是一种酶(即，一种蛋白质分解酶)。在某些实施方案中，蛋白酶是一种蛋白质(例如，一种蛋白质酶)，该蛋白质包括一个或多个多肽链。在某些实施方案中，蛋白酶是一种化学切割试剂。提供术语“提供”，如在此使用的，是指从任何来源获得(包括但不限于通过作用物的自身制造或通过该作用物接受来自另一方的项目而获得)一个主体项目(例如CHO细胞、CHO细胞制剂、或糖蛋白制剂)的一种作用物。例如，提供了一种CHO细胞制剂(如果它是由任何机器(machine)、人、或实体制造或接受的话)。在一些实施方案中，CHO细胞制剂可以被机器所接受，然后它可以进行糖蛋白制剂的一次或多次测试、处理、或精制。在一些实施方案中，CHO细胞制剂可以被人接受。在一些实施方案中，CHO细胞制剂可以被一个外界实体所接受。在一些实施方案中，CHO细胞制剂可以被一个人或业务单位(为第二个人或业务单位进行表征服务)所接受。某㈣实施方案的详细说明尽管用于合成重组糖蛋白的宿主细胞具有用来产生复合糖基化作用的细胞内器， 这些细胞并不总是具有与其中自然表达糖蛋白的细胞相同的酶的互补物。细胞系的克隆选择以及在制造条件方面的变化还可以产生在培养的细胞中所表达的糖蛋白的异质性。在糖蛋白活性方面的糖基化作用的功能性作用使得对在这些细胞系中所产生的治疗性产物进行仔细表征成为必要。以前已经报道末端gal-α -l，3_gal连接不存在于由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞所产生的重组糖蛋白中(Chung et al.，N Engl J Med，358 11 (2008))。本披露至少部分是基于出人意料地发现可以在由CHO细胞所产生的糖蛋白上找到末端α -1,3-半乳糖残基， 并且因此当使用CHO细胞来产生治疗性产物时重要的是对聚糖结构的这个方面进行鉴定、 监测和控制。本披露提供了对在由CHO细胞所产生的糖蛋白上的聚糖的组成进行分析的方法。 根据本披露，可以对来自在CHO细胞中所产生的糖蛋白制剂的聚糖进行分析以确定它们是否包括末端α-1，3_半乳糖残基。本披露提供了检测这类修饰的方法，以及生产包括或缺乏这类修饰的糖蛋白的方法。聚糖制剂本披露提供了分析聚糖制剂中单独的聚糖的结构和/或组成的方法，例如评估由 CHO细胞产生的包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的聚糖，例如评估在由CHO细胞产生的糖蛋白上的末端-α-半乳糖基残基。聚糖制剂可以通过本领域内的任何一种可供使用的方法从一种细胞制剂或从一种糖蛋白而获得。总体而言，获得一种聚糖制剂包括以下步骤(1)获得一种细胞或糖蛋白制剂；并且( 任选地从该细胞或糖蛋白制剂释放聚糖。在一些实施方案中，获得一种聚糖制剂可任选地包括用一种可检测的标记物对该聚糖制剂进行标记。糖蛋白制剂已经描述了用于重组生产糖蛋白的方法。可以通过任何可供使用的手段来分离和纯化由培养的细胞分泌的糖蛋白，例如阴离子交换层析、反相层析、凝胶过滤、免疫亲和层析、以及它们的组合。N-连接的聚糖制剂在一些实施方案中，通过提供一种糖蛋白群并且从该群中的这些糖蛋白移出 N-连接的聚糖而获得N-聚糖制剂。在一些实施方案中，通过消化从糖蛋白(例如，糖蛋白)移出N-连接的聚糖。总体而言，根据本披露有待使用的聚糖酶在核心的GlcNAc-Asn、GlcNAc_GlcNAc或Man-GlcNAc 残基之间进行切割。可用来从糖蛋白中移出N-连接的聚糖的示例性的酶类包括但不限于， N-聚糖酶F和/或N-聚糖酶-A、0-聚糖酶和/或Endo H。在一些实施方案中，通过化学切割从糖蛋白中移出N-连接的聚糖。仅给出少数的实例，可以使用胼、硼氢化钠、和/或三氟甲磺酸(TFMS)从糖蛋白中移出聚糖。
0-连接的聚糖制剂在一些实施方案中，通过提供一种糖蛋白(例如，糖蛋白)群并且从该群中的这些糖蛋白中移出0-连接的聚糖而获得0-连接的聚糖制剂。在一些实施方案中，通过b_消除反应从糖蛋白(例如，糖蛋白)中移出0-连接的聚糖。在一些实施方案中，通过还原性b-消除反应从糖蛋白(例如，糖蛋白)中移出0-连接的聚糖。在一些实施方案中，通过非还原性b-消除反应从糖蛋白(例如，糖蛋白)中移出0-聚糖。在一些实施方案中，通过在包括碱性四氢硼酸盐的溶液中孵育一种糖蛋白(例如，糖蛋白)制剂而从该制剂中移出0-连接的聚糖。在一些实施方案中，例如使用四氘硼酸盐(tetradeuterioborate)来结合氘标记从而有助于检测0_连接的聚糖。在不同的示例性的方法中，在42°C _45°C下将糖蛋白制剂在包含0. 8-1. OM NaBH4以及0. 05-0. IM NaOH 的溶液中孵育2-M小时。可以通过加入酸(例如，1.0M HCl)而终止用来移出0-连接的聚糖的反应。在一些实施方案中，通过在包括NaOH的溶液中孵育一种糖蛋白制剂而从该制剂中移出0-连接的聚糖。在不同的示例性的方法中，在27°C _45°C下将糖蛋白在包含 50-200mM NaOH的溶液中孵育2_48小时。通过加入酸可以终止反应。在一些实施方案中，通过在包括NH4OH的溶液中孵育一种糖蛋白制剂而从该制剂中移出0-连接的聚糖。在不同的示例性的方法中，在45°C -60°C下将糖蛋白在包含 25% -28% NH4OH的溶液中孵育2_40小时。通过在真空下移除NH4OH可以终止反应。在一些实施方案中，该溶液包括碳酸铵(例如，处于饱和浓度下)。在一些实施方案中，用酸(例如硼酸)来处理该NH4OH处理过的制剂。在一些实施方案中，通过在包括乙胺(例如，处于约70%浓度的乙胺)或甲胺(例如，处于约40%浓度的甲胺)的水溶液中孵育一种糖蛋白制剂约4-M小时而从该制剂中移出0-连接的聚糖。在一些实施方案中，从已经从中移出N-连接的聚糖的糖蛋白群获得0-连接的聚糖制剂。标记聚糖在一些实施方案中，在从糖蛋白中释放之前或之后可以使这些标记与聚糖结合。 N-连接的聚糖或0-连接的聚糖(例如，已经从一种糖蛋白群中移出的N-聚糖)可以与一种或多种可检测的标记物相结合。可检测的标记物典型地与这些聚糖的还原性末端相结合。在一些实施方案中，可检测的标记物是荧光部分。根据本披露可以使用的示例性的荧光团包括但不限于2-氨基苯甲酸QAA)、2-氨基苯甲酰胺QAB)、和/或2-氨基嘌呤QAP)。 总体而言，根据本披露而使用的荧光团的特征在于在不损害和/或破坏该聚糖的条件下具有与一种寡糖和/或单糖的还原性末端的反应性。在一些实施方案中，荧光部分被直接附连到还原性末端。例如，直接附连可以通过还原性胺化作用的直接结合而实现。在一些实施方案中，荧光部分被间接地附连到还原性末端。例如，间接附连可以通过一个反应性的连接臂而实现。在一些实施方案中，可检测的标记物包括放射性部分或经同位素标记分子。根据本披露可以使用的示例性的放射性部分包括但不限于氚(3H)、氘(2H)、和/或35S。典型地，这些部分被直接附连到该荧光团上或者以别的方式与该荧光团相结合。仅给出一个放射性荧光团的实例，可以对2AP进行修饰这样将所有的氢都被氘化。聚糖的释放本披露提供了改进的确定糖蛋白的糖基化作用模式的方法。此类方法可以涉及将一种聚糖群经受一种或多种外切糖苷酶处理并且分析这些消化产物的结构和/或组成。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割仅仅一种特定类型的糖苷键。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割一种以上的特定类型的糖苷键。在这些外切糖苷酶中，对于本发明可能是有用的是α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶；己糖胺酶、甘露糖苷酶；以及它们的组合(如表1中所描述的)。外切糖苷酶外切糖苷酶是从聚糖的非还原性末端切割末端糖苷键的酶类。它们对于特定的单糖连接以及异头性(anomericity) (α/β)典型地是高度特异性的。在一些实施方案中，相邻的分枝模式可以影响外切糖苷酶的特异性。外切糖苷酶处理通常导致标准的触角连接 (antennary linkage)的聚糖被切割成五糖核心(M3N》(包含3个甘露糖以及2个GIcNAc 残基)。然而，异常修饰的种类(例如，触角或核心岩藻糖基化的种类、高甘露糖以及杂聚糖、乳糖胺延长的聚糖、硫酸化聚糖、磷酸化聚糖，等等)对外切糖苷酶处理具有抗性，并且可以用色谱方式分辨出并且相对于M3N2五糖进行定量。根据本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶，包括但不限于唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。可以从任何来源(包括商业来源)或通过从细胞来源(例如，细菌、酵母、植物、等)分离和/或纯化而获得外切糖苷酶。在一些实施方案中，外切糖苷酶(例如，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶)可以被分成多种类别或“亚组”。在一些实施方案中，不同的亚组显示出不同的切割不同类型的连接的能力。表1呈现出了一些示例性的外切糖苷酶，它们的连接特异性、以及从中衍生出每一种外切糖苷酶的生物体。本领域的普通技术人员应当理解这仅仅是一个示例性的而非综合性的外切糖苷酶列表，并且具有任何连接特异性的外切糖苷酶都可以根据本披露进行使用。表1.外切糖苷酶
权利要求
1.一种用于评估中国仓鼠卵巢(CHO)细胞群的方法，该方法包括(a)提供来自该群的一个或多个CHO细胞；并且(b)测量由所述细胞产生的包含末端半乳糖_α-1-3-半乳糖残基的聚糖，其中这些CHO细胞没有被基因工程化以表达α -半乳糖苷转移酶编码序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中该测定步骤包括以下步骤中的任何步骤(a)分离由这些CHO细胞产生的糖蛋白，并且测量这些糖蛋白上包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的这些聚糖，(b)分离由这些CHO细胞产生的特异性糖蛋白成分，并且测量来自该分离的糖蛋白成分的包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的聚糖，(c)从分离的由这些CHO细胞产生的糖蛋白或一种糖蛋白制剂获得聚糖制剂，并且测量该聚糖制剂中包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的聚糖，(d)从由CHO细胞产生的糖蛋白上存在的聚糖或者从该一个或多个CHO细胞的表面上的聚糖切割单糖，并且检测来自些切割的单糖的末端释放的α-半乳糖残基。(e)提供来自由这些CHO细胞产生的糖蛋白制剂的至少一种肽，并且测量在该至少一种肽上的包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的聚糖，并且(f)测量包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，其来自该一个或多个CHO细胞的细胞表面上的聚糖。
3.如权利要求1所述的方法，其中该CHO细胞群是一种克隆细胞群。
4.如权利要求1所述的方法，进一步包括将步骤(b)中的测量水平与一种参比水平或规格进行比较的一个步骤。
5.如权利要求1所述的方法，其中的测量包括使用选自下组的一种方法来对包含末端半乳糖-α-半乳糖残基的聚糖进行鉴定或定量，该组由下列各项组成色谱法、质谱(MS) 法、电泳法、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收法、酶法、检测分子的使用、 以及它们的组合。
6.如权利要求1所述的方法，其中该CHO细胞群是来自在用于制造治疗性糖蛋白的生物反应器中的细胞培养物的一种样品。
7.如权利要求1所述的方法，其中该提供和测量步骤随着时间的过去而被重复至少一次。
8.如权利要求1所述的方法，其中该测量步骤包括使用一种结合到半乳糖_α-1-3-半乳糖表位上的检测分子。
9.如权利要求8所述的方法，其中该检测分子包括一种能够结合到半乳糖-α-1-3-半乳糖表位上的凝集素。
10.如权利要求8所述的方法，其中该检测分子包括一种抗半乳糖-α -1-3-半乳糖表位的抗体。
11.如权利要求8所述的方法，其中该检测分子包括一个包含标记部分的分子或结合到其上。
12.如权利要求1所述的方法，进一步包括将测量步骤中的结果记录在打印或计算机可读介质中的步骤。
13.如权利要求1所述的方法，其中该CHO细胞群存在于细胞培养物中。
14.如权利要求1所述的方法，其中已经用编码人类治疗性糖蛋白的载体转化了这些 CHO细胞。
15.如权利要求1所述的方法，进一步包括对存在于这些CHO细胞上的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖表位或包含这些表位的聚糖的量进行定量的步骤。
16.如权利要求1所述的方法，其中测量包括分离由这些CHO细胞产生的糖蛋白，并且测量这些糖蛋白上包含末端半乳糖- α -1-3-半乳糖残基的聚糖。
17.如权利要求1所述的方法，其中测量包括分离由这些CHO细胞产生的特异性糖蛋白成分，并且测量来自分离的糖蛋白成分的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖。
18.如权利要求1所述的方法，其中测量包括从分离的由这些CHO细胞产生的糖蛋白或一种糖蛋白制剂获得聚糖制剂，并且测量该聚糖制剂中包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的聚糖。
19.如权利要求1所述的方法，其中测量包括(d)从由CHO细胞产生的糖蛋白上存在的聚糖或者从该一个或多个CHO细胞的表面上的聚糖切割单糖，并且对末端进行检测。
20.如权利要求1所述的方法，其中测量包括提供来自由这些CHO细胞产生的糖蛋白制剂的至少一种肽，并且测量该至少一种肽上的包含末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基的聚糖。
21.如权利要求1所述的方法，其中测量包括对该一个或多个CHO细胞的细胞表面上的糖缀合物上的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖残基进行测量。
22.如权利要求1所述的方法，其中该测定步骤包括进行一种色谱法。
23.如权利要求1所述的方法，其中该测量步骤包括进行一种质谱(MQ法。
24.如权利要求1所述的方法，其中该测量步骤包括进行一种电泳法。
25.如权利要求1所述的方法，其中该测量步骤包括进行一种核磁共振色谱(NMR)法。
26.一种用于筛选一个或多个中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生糖蛋白的能力的方法，该糖蛋白包括包含-α -1-3-半乳糖表位的聚糖，该方法包括(a)提供多个CHO细胞群，其中该多个群中没有一个已经被基因工程化以在这些聚糖上产生末端α-半乳糖苷残基。(b)在适合用于表达糖蛋白表达产物的条件下，对该多个CHO细胞群的每一个进行培养；(c)测量由该多个CHO细胞中的每一个所产生的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，并且(d)基于目标水平的由选定的CHO细胞制剂所产生的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的存在来选择一种或多种CHO细胞制剂，其中还没有用α -半乳糖苷转移酶编码序列来转染这些CHO细胞。
27.如权利要求沈所述的方法，其中该多个CHO细胞群的每一个都是在一种细胞培养物中。
28.如权利要求沈所述的方法，其中在这些CHO细胞制剂的分离的糖蛋白表达产物上对这些包含末端半乳糖- α -1-3-半乳糖残基的聚糖进行了测量。
29.如权利要求沈所述的方法，其中在由这些CHO细胞制剂的糖蛋白表达产物获得的肽上对这些包含末端半乳糖- α -1-3-半乳糖残基的聚糖进行了测量。
30.如权利要求沈所述的方法，其中从这些CHO细胞制剂的细胞表面的聚糖对包含末端半乳糖- α -1-3-半乳糖残基的这些聚糖进行了测量。
31.如权利要求沈所述的方法，其中在由这些CHO细胞制剂或由其糖蛋白表达产物获得的聚糖制剂上对包含末端半乳糖- α -1-3-半乳糖残基的这些聚糖进行了测量。
32.如权利要求沈所述的方法，其中该测量步骤包括以下步骤(i)从该多个CHO细胞群的每一个中分离一种糖蛋白表达产物，并且(ii)在该糖蛋白表达产物上测量末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基。
33.如权利要求27所述的方法，其中该细胞培养物是在一个生物反应器中。
34.如权利要求26所述的方法，其中测量包括使用选自下组的一种技术来对包含末端半乳糖-α-1，3-半乳糖残基的聚糖进行鉴定或定量，该组由下列各项组成色谱法、质谱 (MS)法、电泳法、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收法、酶法、检测分子的使用、以及它们的组合。
35.如权利要求沈所述的方法，其中已经用编码人类治疗性糖蛋白的载体转化了该多个CHO细胞群中的至少一个。
36.如权利要求沈所述的方法，其中该多个CHO细胞群包括选择下组的至少一个特征， 该组由下列各项组成至少两个不同的CHO株，至少两个不同的克隆细胞群，以及来自用于治疗性糖蛋白的制造过程行进的至少两个不同的样品。
37.如权利要求沈所述的方法，进一步包括培养选定的CHO细胞制剂以产生一种治疗性糖蛋白产物的步骤。
38.一种用于对CHO细胞宿主体内产生的糖蛋白成分进行评估的方法，该方法包括测量存在于一种糖蛋白成分中的末端半乳糖- α -1-3-半乳糖的量，其中该糖蛋白成分是在CHO宿主细胞中产生的，并且其中这些CHO宿主细胞没有被基因工程化以表达一种α-半乳糖苷转移酶编码序列。
39.如权利要求38所述的方法，进一步包括将存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖的水平记录在一种打印物或计算机可读介质中。
40.如权利要求38所述的方法，进一步包括将存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖- α -1-3-半乳糖的测量水平与一个参比水平进行比较。
41.如权利要求40所述的方法，其中该参比水平是一种对于包含该糖蛋白成分的药物制剂的规格或质量标准。
42.如权利要求40所述的方法，其中该参比水平是基于聚糖/总聚糖的不大于5%的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖。
43.如权利要求38所述的方法，其中测量存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖的量包括进行一种色谱法。
44.如权利要求38所述的方法，其中测量存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖的量包括进行一种质谱(MQ法。
45.如权利要求38所述的方法，其中测量存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖的量包括进行一种核磁共振(NMR)法。
46.如权利要求38所述的方法，其中测量存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖的量包括进行单糖分析。
47.如权利要求38所述的方法，其中测量存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖的量包括进行一种荧光法。
48.如权利要求38所述的方法，其中测量存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖的量包括进行一种UV-VIS吸收法。
49.如权利要求38所述的方法，其中测量存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α -1-3-半乳糖的量包括进行一种酶法。
50.如权利要求38所述的方法，其中测量存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖- α -1-3-半乳糖的量包括一种检测分子的使用。
全文摘要
本发明提供了评估中国仓鼠卵巢(CHO)细胞群的方法，该方法是通过测量由所述细胞产生的包含末端半乳糖-α-1,3-半乳糖残基的聚糖来进行的，其中这些CHO细胞没有被基因工程化以表达一种α-半乳糖苷转移酶编码序列。
文档编号G01N33/68GK102292640SQ200980155081
公开日2011年12月21日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者C·刘, C·鲍斯克斯, H·萨维亚, J·墨菲, N·瓦斯博恩, X-J·徐 申请人:动量制药公司