专利名称：一种苦瓜叶乙醇提取物化学成分的检测方法
技术领域：
本发明属于植物资源的综合开发技术领域，涉及采用现代分析检测仪器检测植 物、蔬菜化学成分的检测方法，更具体的说是一种苦瓜叶不同提取物中化学成分的检测方法。
背景技术：
苦瓜(Momordica Charantia L)又名锦荔枝、癞葡萄、癞瓜、凉瓜等，系葫芦科苦 瓜属蔓性草本植物，据嵩明人兰茂所著的《滇南本草》记载，苦瓜叶片具有治胃痛、痢疾、 疗疮肿毒、驱虫等功效，通过田间调查和实验证实苦瓜叶及其提取物还具有较强抗虫性， K. Prabakar等对苦瓜、蛇瓜、丝瓜、冬瓜和西瓜这五种葫芦科植物叶片的甲醇提取物对致倦 库蚊(Celux quinquefasciatus)幼虫杀虫活性进行了研究，结果表明苦瓜叶甲醇提取物对 致倦库蚊的杀虫活性最大，其LC5tl值为465. 85ppm，低于其它四种葫芦科植物。陈宏等采用 乙醚、丙酮、乙醇、石油醚4种有机溶剂浸提和热提苦瓜叶片，以提取液涂抹桑叶和甘蓝叶 分别饲喂家蚕和菜青虫，试验结果表明4种有机溶剂提取液处理试虫，其取食量降低，生 长速率缓慢，存活率下降，其中以乙醚提取液的作用效果最强。但苦瓜叶中对幼虫具有杀虫 活性的化学成分有哪些至今未见相关的文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种苦瓜叶不同提取物中化学成分的检测方法及结果。本文 通过气相色谱_质谱_计算机联用系统对苦瓜叶中的化学成分作了一个系统的分析，试图 揭示苦瓜叶抗虫作用的化学本质，为苦瓜叶片抗虫作用的进一步研究提供参考，并为苦瓜 叶作为一种植物资源的综合开发提供科学依据。为实现此目的，本发明内容提供如下的技 术内容一种苦瓜叶乙醇提取物化学成分的检测方法，其特征在于包括如下的步骤(1)苦瓜叶乙醇提取物称取5g磨成粉末过40 60目筛的干燥苦瓜叶片，加入200mL乙醇，于25 士 2°C避 光处浸提三天，抽滤，残渣用乙醇清洗2 3次，合并滤液和洗涤液，用乙醇定容至250mL ； 然后取ImL醇提液至2mL样品瓶中，用队吹干，加30yL MSTFA振摇30 s，70°C衍生化 30min, 300rPm离心，所得衍生液上机测试，备用；(2)采用GC-MS进行分析，气相色谱条件柱子初始温度60°C保持2min，以5°C / min升至150°C保持3min，再以10°C /min升至220°C，保持3min，进样口温度250°C ；质谱 连接线温度250°C，高纯氦气为载气，流速l.Oml/min，分流比60 1，进样量1. O μ L，质 谱条件质谱电离方式为ΕΙ，电子轰击源电子能量70eV，离子源温度250°C ；电子倍增器电 压1. 0X105 ；溶剂延迟时间:3min ；扫描范围m/z :35_1000aum ；(3)利用峰面积归一化法计算各峰面积的相对含量，从苦瓜叶醇提物中鉴定81种 化学成分，占总成分的重量百分比为90. 86%，其中(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和
3棕榈酸为苦瓜叶乙醇提取物中的主要化学成分，分别占总出峰面积的24. 48%,18. 18%和 13. 24% ；其它含量较高的化学成分还有龙脑(1.06% )，2_甲基-5-(l-甲基乙基)-苯酚 (2.86% )，4-(1，1_ 二甲基乙基酯)-1，2邻苯二酚(3. 31% )，氧化石竹烯(2.07% )，植物 醇(2. 14% )，维甲酸- -葡糖苷酸-6' ,3'-内酯(3. 19% )，辛烷酸(2.26% )；本发明采用GC-MS(气相色谱-质谱联用)分析技术对苦瓜叶乙醇提取物中的化 学成分进行研究。结果从醇提物中签定出81种化学成分，占总出峰面积的90. 86%，结果显 示(Ζ，Ζ)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和棕榈酸为苦瓜叶乙醇提取物中的主要化学成分， 本发明的检测方法为苦瓜叶作为一种植物资源的开发利用奠定了基础，提供了实证依据。本发明具更加优选的试验方法如下1、材料与方法1.1仪器和试剂GC-MS 联用仪(Thermo，Focus GC, DSQ II，美国)TR-5MS 色谱柱(30mX 25mmX0. 25 μ m)，NIST05 标准谱图库N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA，Fluka)，乙醇、乙醚、无水硫酸钠和氢 氧化钠均为分析纯(天津市元立化工有限公司)苦瓜叶采自天津市郊区，经鉴定为葫芦目葫芦科苦瓜属长丰三号苦瓜的叶片，用 去离子水洗净后烘干备用。1.2分析样品的制备苦瓜叶乙醇提取物称取5g磨成粉末的干燥苦瓜叶片(40 60目)置于棕色瓶中，加入200mL乙醇， 于室温(25士2°C )避光处浸提三天，抽滤，残渣用乙醇清洗2 3次，合并滤液和洗涤液， 用乙醇定容至250mL。苦瓜叶醇提物的衍生化处理取ImL醇提液至2mL样品瓶中，用N2吹干，加30 μ L MSTFA，盖紧盖子，振摇30s， 70°C衍生化30min，所得衍生液上机测试。1. 3 GC-MS 分析条件气相色谱条件柱子初始温度60°C保持2min，以5°C /min升至150°C保持3min， 再以10°C /min升至220°C，保持3min ；进样口温度250°C ；质谱连接线温度250°C，高纯氦 气为载气，流速l.Oml/min ；分流比60 1;进样量1.01^。质谱条件质谱电离方式为EI，电子轰击源电子能量70eV，离子源温度250°C ；电 子倍增器电压1. OX IO5 ；溶剂延迟时间3min ；扫描范围m/z :35_1000aum。按上述GC-MS分析条件对苦瓜叶醇溶性成分上机测试，得乙醇提取物的总离子流 色谱图(见图1)和苦瓜叶乙醚提物物的总离子流色谱图。各峰的鉴定主要通过NIST05谱 库检索，并根据有机化合物的质谱断裂一般规律和文献报道的数据分析确定，利用峰面积 归一化法计算各峰面积的相对含量(结果见表1)。本发明共鉴定了苦瓜叶醇提物中的81种化学成分，占总成分的90. 86%，结果显 示(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和棕榈酸为苦瓜叶乙醇提取物中的主要化学成分， 分别占总出峰面积的24. 48%,18. 18%和13. 24% ；其它含量较高的化学成分还有龙脑 (1. 06，这是本实验首次在苦瓜叶中发现的，龙脑具有驱虫作用，这可能就是苦瓜叶片具有抗虫作用的原因之一 ；2-甲基-5-(l-甲基乙基)-苯酚(2.86% ) ；4-(1，1_ 二甲基乙基 酯)-1，2邻苯二酚(3.31%)；氧化石竹烯(2.07%)；植物醇(2. 14% )；维甲酸_ _葡糖 苷酸-6'，3'-内酯(3.19%)；辛烷酸(2.26%)等。从化合物类型来看，苦瓜叶乙醇提 取物的主要化学成分为脂肪酸、醇类、酯类和萜类等，其中以醇类的含量最为丰富。表1苦瓜叶乙醇提取物化学成分的GC-MS分析结果 3 结论将样品衍生化技术和GC-MS联用技术应用于苦瓜叶化学成分的分析鉴定上，本发 明从乙醇提取液中鉴定出81种化学成分，占总出峰面积的90. 86%。结果显示(Z，Z)-9， 12-十八碳二烯酸、百里酚和棕榈酸为苦瓜叶乙醇提取液中的主要化学成分。本研究首次发 现苦瓜叶中含有龙脑和百里酚，相对含量分别为1.06%和18. 23%，龙脑具有驱虫作用，百 里酚对昆虫有毒杀作用，这与苦瓜叶提取液具有驱虫和毒杀害虫的药理作用相一致，这为 苦瓜叶抗虫作用的进一步研究和苦瓜叶的综合开发利用提供了实证依据。
图1苦瓜叶乙醇提取物的总离子流色谱图。
具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅 仅是解释、而不是限制本发明的范围，所用原料均有市售。实施例1(1)苦瓜叶乙醇提取物将采自天津市郊区的苦瓜叶，用去离子水洗净后烘干备用。称取5g磨成粉末过60 目筛的干燥苦瓜叶片，加入200mL乙醇，于25士2°C避光处浸提三天，抽滤，残渣用乙醇清洗 3次，合并滤液和洗涤液，用乙醇定容至250mL ；然后取ImL醇提液至2mL样品瓶中，用N2吹 干，加30 μ L N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺振摇30s，70°C衍生化30min，300rPm离心， 取上层液作GC-MS分析。实施例2采用GC-MS进行分析，气相色谱条件柱子初始温度60°C保持2min，以5°C /min升至150°C保持3min，再以10°C /min 升至220°C，保持3min，进样口温度250°C ；质谱连接线温度250°C，高纯氦气为载气，流速 1. Oml/min，分流比60 1，进样量1.0yL。质谱条件质谱电离方式为EI，电子轰击源电子能量70eV，离子源温度250°C ；电 子倍增器电压1. OX IO5 ；溶剂延迟时间3min ；扫描范围m/z :35_1000aum。按上述GC-MS分析条件对苦瓜叶醇溶性成分上机测试，得乙醇提取物的总离子流 色谱图(见图1)。各峰的鉴定主要通过NIST05谱库检索，并根据有机化合物的质谱断裂一 般规律和文献报道的数据分析确定，利用峰面积归一化法计算各峰面积的相对含量(结果 见表1)。实施例3(1)苦瓜叶乙醇提取物
称取5g磨成粉末过40目筛的干燥苦瓜叶片，加入200mL乙醇，于25士2°C避光处 浸提三天，抽滤，残渣用乙醇清洗2 3次，合并滤液和洗涤液，用乙醇定容至250mL ；然后 取ImL醇提液至2mL样品瓶中，用N2吹干，加30 μ L MSTFA振摇30s，70°C衍生化30min， 300rPm离心，所得衍生液上机测试，备用；(2)采用GC-MS进行分析，气相色谱条件柱子初始温度60°C保持2min，以5°C / min升至150°C保持3min，再以10°C /min升至220°C，保持3min，进样口温度250°C ；质谱 连接线温度250°C，高纯氦气为载气，流速l.Oml/min，分流比60 1，进样量1. O μ L，质 谱条件质谱电离方式为ΕΙ，电子轰击源电子能量70eV，离子源温度250°C ；电子倍增器电 压1. 0X105 ；溶剂延迟时间:3min ；扫描范围m/z :35_1000aum ；(3)利用峰面积归一化法计算各峰面积的相对含量，从苦瓜叶醇提物中鉴定81种 化学成分，占总成分的重量百分比为90. 86%，其中(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和 棕榈酸为苦瓜叶乙醇提取物中的主要化学成分，分别占总出峰面积的24. 48%,18. 18%和 13. 24% ；其它含量较高的化学成分还有龙脑(1.06% )，2_甲基-5-(l-甲基乙基)-苯酚 (2.86% )，4-(1，1_ 二甲基乙基酯)-1，2邻苯二酚(3. 31% )，氧化石竹烯(2.07% )，植物 醇(2. 14% )，维甲酸- -葡糖苷酸-6' ,3'-内酯(3. 19% )，辛烷酸(2.26% )。
权利要求
一种苦瓜叶乙醇提取物化学成分的检测方法，其特征在于包括如下的步骤(1)苦瓜叶乙醇提取物称取5g磨成粉末过40～60目筛的干燥苦瓜叶片，加入200mL乙醇，于25±2℃避光处浸提三天，抽滤，残渣用乙醇清洗2～3次，合并滤液和洗涤液，用乙醇定容至250mL；然后取1mL醇提液至2mL样品瓶中，用N2吹干，加30μL N 甲基 N 三甲基硅烷三氟乙酰胺振摇30s，70℃衍生化30min，300rPm离心，备用；(2)采用GC MS进行分析，气相色谱条件柱子初始温度60℃保持2min，以5℃/min升至150℃保持3min，再以10℃/min升至220℃，保持3min，进样口温度250℃，质谱连接线温度250℃，高纯氦气为载气，流速1.0ml/min，分流比60∶1，进样量1.0μL；质谱条件质谱电离方式为EI，电子轰击源电子能量70eV，离子源温度250℃，电子倍增器电压1.0×105，溶剂延迟时间3min，扫描范围m/z35 1000aum；(3)利用峰面积归一化法计算各峰面积的相对含量，从苦瓜叶醇提物中鉴定81种化学成分，占总成分的重量百分比为90.86％，其中(Z，Z) 9，12 十八碳二烯酸、百里酚和棕榈酸，分别占总出峰面积的24.48％、18.18％和13.24％；其它含量较高的化学成分还有1.06％龙脑，2.86％2 甲基 5 (1 甲基乙基) 苯酚，3.31％4 (1，1 二甲基乙基酯) 1，2邻苯二酚，2.07％氧化石竹烯，2.14％植物醇，3.19％维甲酸 á 葡糖苷酸 6′，3′ 内酯，2.26％辛烷酸。
全文摘要
本发明公开了一种苦瓜叶乙醇提取物化学成分的检测方法，即通过GC-MS技术鉴定苦瓜叶片化学成分的方法和结果。它是采用有机溶剂室温浸提苦瓜叶片的方法得到提取液，经过衍生化处理后再经毛细管色谱柱分离，将所得样品质谱图与标准谱图库中的谱图对比定性，并采用峰面积归一化法计算相对含量。从苦瓜叶乙醇提取物中鉴定出81种化学成分，占总出峰面积的90.86％，结果显示(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和棕榈酸为苦瓜叶乙醇提取物中的主要化学成分，并且还发现乙醇提取物中含具有驱虫作用的龙脑和对昆虫具有毒杀作用的百里酚。本发明为苦瓜叶作为一种植物资源的开发利用奠定了基础，提供了实证依据。
文档编号G01N30/88GK101929990SQ20101022532
公开日2010年12月29日 申请日期2010年7月14日 优先权日2010年7月14日
发明者吴志杰, 陈宏 , 雷盯函 申请人:天津师范大学