专利名称：具有促细胞分裂活性的Bv8的核酸和多肽的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及利用具有促细胞分裂活性的蛋白BvS的方法，组合物和检测法。
背景技术：
内皮细胞局部微环境以组织特异性或器官特异性方式深刻影响着血管内皮细胞的表型和 生长特性，但局部有益信号本身的性质仍然很不明了。有明显迹象表明，血管内皮生长因 子(VEGF)和内皮细胞特异性生长因子的血管生成蛋白(angiopoietin)家族都是胚胎发育 和各种生理和病理情况下的血管生成所必需的(Ferrara and Alitalo,Nature Medicine, 5:1359-1364(1999) ；Carmeliet, Nature Medicine，6 :389_395 (2000))。另外，对内皮细 胞表型和生长的局部、组织特异性调节也有十分明显的证据(Aird等，J. Cell Biol. , 138 1117-1124(1997) ；Stewart and Wiley, Dev. Biol. ,84 183-192 (1981)) 内皮细胞的形 态和功能特征在不同器官中差别很大(Simionescu and Simionescu, Cell and Tissue Biology, Urban and Schwarzemberg, Baltimore, (1988)pp. 355—398) 。 Mi，MIlJii^iil 管生成因子的应用部位比类型更能决定新血管的特性(Dellian等，Am. J. Pathology. 149 59-71(1996) ；Roberts 等，Am. J. Pathology, 153 1239-1248 (1998)) 局部微环境对脉管 系统特性的这种影响的分子基础目前尚不清楚，但有人认为特化的基质在其中起主要作用 (Dellian，出处同上)。有理由相信，除了细胞的以及细胞外的基质成分以外，由刺激(可能 包括组织特异性分泌蛋白)所形成的一种集成的网络也能决定常驻内皮的结构和功能以 及生长调节。因此现在需要鉴定并定性能影响内皮细胞生长和/或分化的因子。这样的化合物 除了能帮助我们进一步了解脉管系统的发育以外，还可以用于诊断和治疗与脉管组织相关 的疾病。激素分泌细胞尽管现在的科学和医学治疗有了进步，但仍然需要新的针对社会的医学疾病的治 疗。一种发现新治疗的方法是研究器官如何操作。具体目标是传递信号的细胞如何控制生 物的行为。例如，内分泌细胞分泌所谓激素分子，这些激素的分泌出现故障时可以导致各种 疾病。特化的激素分泌细胞包括性腺细胞，它们分泌睾丸激素(睾丸间质细胞(Leydig cell))，雌激素(卵泡内膜细胞)和黄体酮(已分裂卵泡的黄体细胞)。尽管在医学领域有 各种利用外源给予睾丸激素，雌激素和黄体酮来进行的治疗，但是仍然需要对产生这些激 素的细胞进行调节。
其它特化的激素分泌细胞包括肾上腺的细胞和消化系统的细胞。例如，肾上腺的 细胞分泌肾上腺素，去甲肾上腺素和类固醇激素如盐皮质激素和糖皮质激素。尤其有兴趣 的是皮质醇(Cortisol)，它产生于肾上腺皮质，能影响多种类型细胞的代谢。消化系统的细 胞包括胰腺的细胞，它们分泌胰岛素。胰岛素由朗格汉岛(islets of Langerhans)分泌， 它是糖代谢所必需的。胰岛素用于治疗和控制糖尿病(diabetes mellitus)，但目前仍需要 针对诸如糖尿病(diabetes)等疾病的有效治疗。肠道和呼吸道的其它目的激素包括5_羟 色胺，内啡肽，生殖激素抑制素，胃泌素，分泌素，缩胆囊素，胰高血糖素和铃蟾肽。很多疾病与激素分泌细胞有关，尤其与内分泌腺中生成类固醇的内皮细胞有关。 因此，最好能鉴定特异性影响这类内皮细胞的生长因子。这种内皮细胞特异性生长因子将 会是，诊断和治疗与这类细胞相关的疾病，以及鉴定可用于诊断和治疗这类疾病的其它药 物的有价值的工具。Bv8Bv8是一种小分子蛋白，它最初是从青蛙(Bombina variegata)的皮肤分泌物中 分离得到的(Mollay 等 Eur. J. Pharmacol. 374 189-196(1999))。Bv8 与 MIT-I 有 40 % 以上的同一性，后者是来自黑色树蛇(mamba)毒液的一种小分子蛋白，已知它能强效诱导 小肠收缩(Schweitz等FEBS Lett. 461 183-188 (1999))。目前已经从小鼠和人中克隆 出Bv8的多种哺乳动物同系物，它们都具有相同的氨基末端序列(Wechselberger等FEBS Lett. 462 :177-181(1999))。与MIT-I —样，人Bv8使胃肠道平滑肌强烈收缩，EC50值在 亚纳摩尔水平(1^等船1.卩1^1~111.59:692-698(2001))。现已在人类中鉴定出Bv8的两种 形式，其中较长的形式反映了旁路剪接外显子的存在。人BvS的较长形式与美国专利申请 09/886，242中所述的VRPA有近78%的同源性和58%的同一性。发明简述本发明基于鉴定出BvS的新活性。具体地，发现BvS诱导内皮细胞增殖，促进内皮 细胞存活并促进血管生成。如本文详述，BvS核酸和多肽可用于多种检测法中，以及用于诊 断和治疗与内皮细胞相关的疾病。一方面，本发明提供了诱导内皮细胞增殖的方法。在一个实施方案中，所述方法包 括使细胞与能够有效诱导所述细胞增殖的量的BvS接触。所述方法还包括使所述细胞与 VEGF接触。在另一个实施方案中，所述方法包括将编码BvS的核酸引入所述细胞，所述核酸 的量能有效诱导细胞增殖。所述方法还包括将编码VEGF的核酸引入所述细胞中。在一个实施方案中，BvS是天然序列BvS多肽。优选天然序列BvS多肽是天然人 Bv8多肽。天然人Bv8多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO 2或氨基酸序列SEQ ID NO :4。 在另一实施方案中，天然序列BvS包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。在另一实施方案中，BvS 能与肝素结合。在另一实施方案中，BvS是BvS免疫粘附素。在另一实施方案中，BvS是嵌 合 Bv8。在一个实施方案中，所述细胞是内皮细胞，更优选生成类固醇的内皮细胞，如生成 类固醇的腺体的细胞。在另一方面，本发明提供了促进细胞存活的方法。在一个实施方案中，所述方法包 括使细胞与能够有效促进所述细胞存活的量的BvS接触。所述方法还包括使所述细胞与 VEGF接触。在另一个实施方案中，所述方法包括将编码BvS的核酸引入所述细胞，所述核酸
6的量能有效促进细胞存活。所述方法还包括将编码VEGF的核酸引入所述细胞中。在一个实施方案中，BvS是天然序列BvS多肽。优选天然序列BvS多肽是天然人 Bv8多肽。天然人Bv8多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO 2或氨基酸序列SEQ ID NO :4。 在另一实施方案中，天然序列BvS包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。在另一实施方案中，BvS 能与肝素结合。所述细胞优选内皮细胞，更优选生成类固醇的内皮细胞，如生成类固醇的腺体的 细胞。在另一方面，本发明提供了治疗哺乳动物与产激素组织相关的疾病的方法。在一 个实施方案中，所述方法优选包括对该哺乳动物给药能够有效治疗该疾病的量的BvS或其 激动剂或拮抗剂。在另一个实施方案中，所述方法还包括对该哺乳动物给药VEGF或其激动 剂或拮抗剂。所述哺乳动物优选人类。在一个实施方案中，BvS与肝素结合。在另一实施方案中BvS是天然序列BvS多 肽。优选天然序列BvS多肽是天然人BvS多肽。天然人BvS多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO 2或氨基酸序列SEQ ID NO :4。在另一实施方案中，天然序列BvS包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。在另一方面，本发明提供了抑制内皮细胞的方法。在一个实施方案中，所述方法包 括将内皮细胞与能有效抑制细胞增殖的BvS拮抗剂接触。在另一方面，本发明提供了治疗哺乳动物中BvS应答细胞的癌症的方法。所述方 法优选包括给药能有效治疗所述癌症的量的BvS拮抗剂。在另一实施方案中，所述癌症是 激素依赖性癌症。在另一实施方案中，所述癌症是睾丸癌。在另一方面，本发明提供了治疗哺乳动物(优选人)中生殖器官的癌症的方法。 在一个实施方案中，所述方法包括对该哺乳动物给药能有效治疗所述癌症的量的BvS拮抗 剂。所述癌症优选睾丸癌。在另一方面，本发明提供了诱导血管生成的方法。在一个实施方案中，所述方法包 括将细胞与能有效诱导血管生成的量的BvS接触。在另一实施方案中，所述方法包括将编 码BvS的核酸引物细胞中，所述核酸的量能有效诱导血管生成。在另一方面，本发明提供了治疗哺乳动物中与过度的、不希望有的或失控的血管 生成相关的疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法优选包括对该哺乳动物给药能有效 治疗所述疾病的量的BvS或其激动剂或拮抗剂。所述哺乳动物优选人。在另一方面，本发明提供了调节哺乳动物生育力的方法。在一个实施方案中，所述 哺乳动物为人。所述方法优选包括对该哺乳动物给药能有效调节生育力的量的BvS拮抗 剂。在另一方面，本发明提供了一种制品，它包含容器；BvS ；以及使用BvS的说明。在 一个实施方案中，所述说明是指如何用BvS治疗与产激素的内皮组织(优选睾丸组织)相 关的疾病。在另一方面，本发明提供了治疗哺乳动物中类固醇激素依赖性疾病的方法。在一 个实施方案中，所述方法包括对该哺乳动物给药能有效治疗所述类固醇激素依赖性疾病的 量的BvS或其激动剂或拮抗剂。优选哺乳动物为人。所述类固醇激素依赖性疾病优选选自 先天性脂样肾上腺增生，不育，性成熟，依赖雄性激素的肿瘤，性早熟，McCune-Albright综合征，先天性肾上腺发育不全，或低促性腺激素型性腺功能衰退。在另一方面，本发明提供了一种制品，它包含容器，BvS拮抗剂，以及如何使用BvS 的说明。在一个实施方案中，所述说明是指如何用BvS拮抗剂治疗癌症，优选睾丸癌。在另 一实施方案中，所述说明是指如何用BvS拮抗剂调节生育力。本发明另一方面提供了鉴定BvS拮抗剂的方法，是使候选化合物与BvS接触，测定 该化合物对BvS生物学活性的影响，并在BvS生物学活性受到抑制的情况中鉴定拮抗剂。在 一个实施方案中，BvS拮抗剂通过其抑制BvS刺激内皮细胞增殖的能力来鉴定。在另一实 施方案中，BvS拮抗剂通过其抑制BvS促进内皮细胞存活的能力来鉴定。本发明还涉及1.诱导内皮细胞增殖的方法，包括使所述细胞与能够有效诱导所述细胞增殖的量 的Bv8接触。2.项1的方法，其中所述细胞为血管内皮细胞。3.项2的方法，其中所述内皮细胞是生成类固醇的内皮细胞。4.项3的方法，其中所述内皮细胞是生成类固醇的腺体的细胞。5.项1的方法，其中所述BvS是天然序列BvS多肽。6.项5的方法，其中所述BvS是天然人BvS多肽。7.项6的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。8.项6的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :4。9.项5的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。10.项1的方法，其中所述BvS能与肝素结合。11.项1的方法，其中所述BvS是BvS免疫粘附素。12.项1的方法，其中所述BvS是嵌合Bv8。13.项1的方法，还包括使所述细胞与VEGF接触。14.诱导内皮细胞增殖的方法，包括将编码BvS的核酸引入所述细胞，所述核酸的 量能有效诱导细胞增殖。15.项14的方法，其中所述BvS能与肝素结合。16.项14的方法，其中所述BvS是天然序列BvS多肽。17.项14的方法，其中所述细胞是内皮细胞。18.项17的方法，其中所述内皮细胞是生成类固醇的内皮细胞。19.项18的方法，其中所述内皮细胞是生成类固醇的腺体的细胞。20.项14的方法，还包括将编码VEGF的核酸引入所述细胞。21.促进细胞存活的方法，包括将所述细胞与能有效促进存活的量的BvS接触。22.项21的方法，其中所述BvS能与肝素结合。23.项21的方法，其中所述BvS是天然序列BvS多肽。24.项23的方法，其中所述BvS是天然人BvS多肽。25.项24的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。26.项24的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :4。27.项23的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。28.项21的方法，其中所述细胞是内皮细胞。
29.项28的方法，其中所述内皮细胞是生成类固醇的内皮细胞。30.项29的方法，其中所述内皮细胞是生成类固醇的腺体的细胞。31.项21的方法，还包括使所述细胞与VEGF接触。32.促进细胞存活的方法，包括将编码BvS的核酸引入所述细胞，所述核酸的量能 有效促进存活。33.项32的方法，其中所述BvS能与肝素结合。34.项32的方法，其中所述BvS是天然序列BvS多肽。35.项32的方法，其中所述细胞是内皮细胞。36.项35的方法，其中所述内皮细胞是生成类固醇的内皮细胞。37.项36的方法，其中所述内皮细胞是生成类固醇的腺体的细胞。38.项32的方法，还包括将编码VEGF的核酸引入所述细胞。39.抑制内皮细胞增殖的方法，包括使所述细胞与能有效抑制细胞增殖的量的 Bv8拮抗剂接触。40.治疗哺乳动物的癌症的方法，包括将能有效治疗癌症的量的BvS拮抗剂给予 该哺乳动物。41.项40的方法，其中所述哺乳动物是人。42.项40的方法，其中所述癌症是激素依赖性癌症。43.项40的方法，其中所述癌症是生殖器官的癌症。44.项43的方法，其中所述癌症是睾丸癌。45. 一种治疗哺乳动物中与生成激素的组织相关的疾病的方法，包括给予有效量 的Bv8来治疗该疾病。46.项45的方法，其中所述与生成激素的组织相关的疾病选自先天性脂样肾上腺 增生，不育，性成熟，依赖雄性激素的肿瘤，性早熟，McCime-Albright综合征，先天性肾上腺 发育不全，或低促性腺激素型性腺功能减退症。47.项45的方法，其中所述哺乳动物是人。48. 一种制品，包含容器；Bv8 拮抗剂；如何用BvS拮抗剂治疗癌症的说明。49.项48的制品，其中所述癌症是睾丸癌。50. 一种制品，包含容器；Bv8 ；如何用BvS治疗与生成激素的组织相关的疾病的说明。
0090]51.项50的制品，其中所述组织是睾丸组织。52. 一种制品，包含容器；Bv8 拮抗剂；如何用BvS拮抗剂调节生育力的说明。
53.鉴定BvS拮抗剂的方法，包括以下步骤a)使候选化合物与Bv8接触；b)测定BvS刺激内皮细胞增殖的能力；和c)在BvS刺激内皮细胞增殖的能力受到抑制的情况下，将所述化合物鉴定为拮抗 剂。54.鉴定BvS拮抗剂的方法，包括以下步骤a)使候选化合物与Bv8接触；b)测定BvS促进内皮细胞存活的能力；和c)在BvS促进内皮细胞存活的能力受到抑制的情况下，将所述化合物鉴定为拮抗 剂。55.诱导血管生成的方法，包括使所述细胞与能有效诱导血管生成的量的BvS接 触。56.治疗哺乳动物受试者中与过度、不良、或失控的血管生成相关的疾病的方法， 包括给予受试者能有效治疗该疾病的量的BvS拮抗剂。
图1显示编码人Bv8同系物的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO :1)。用粗体和下 划线表示起始密码子和终止密码子的位置。图2显示人Bv8同系物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 2),由编码序列SEQ ID NO 1衍生。公认的信号序列由氨基酸1-21组成。图3显示编码人Bv8同系物旁路剪接形式的cDNA的核苷酸序列(SEQID NO 3)。 用粗体和下划线表示起始密码子和终止密码子的位置。图4显示人Bv8同系物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 4),由编码序列SEQ ID NO 3衍生。图5显示编码小鼠Bv8同系物的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)。用粗体和 下划线表示起始密码子和终止密码子的位置。图6显示小鼠Bv8同系物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)，由编码序列SEQ ID NO :5衍生。图7显示小鼠BvS同系物与人BvS同系物的序列比对。潜在的肝素-结合区用盒 子表示。如图所示，该区不出现在旁路剪接转录子中。小鼠BvS同系物与人BvS同系物有 近96%相同。图 8 显示人 Bv8(SEQ ID NO 2) ^P EG-VEGF (SEQ ID NO 7)的氨基酸序列比对。人 Bv8与人EG-VEGF有近60%相同。图9对人RNA样品的Northern印迹分析显示出约1. 8kb的单个转录子。在睾丸 中发现表达。各个泳道的内含物在印迹的上方示出，大小(kb)在右侧示出。图IOA和IOB显示小鼠和大鼠中Bv8表达的Northern印迹分析。在小鼠中，Bv8 表达可见于心脏和睾丸(图10A)。在大鼠中，BvS表达仅见于睾丸(图10B)。此外，在大 鼠睾丸中还可见到一条较小的0. Skb的带。图IlA和IlB显示，Bv8诱导内皮细胞增殖。图IlA显示，给药1，10和50nM的Bv8，使牛肾上腺皮质毛细管内皮(ACE)细胞的增殖与未处理的对照(“C”)相比增加了。 同样，图IlB表明，所有三种浓度的BvS使牛脑毛细管细胞的增殖增加。在这两种情况中， 由BvS诱导的增殖不及由VEGF诱导的增殖(“V” )。图12显示，Bv8促进内皮细胞存活。在含有5或25nM Bv8的培养基中保温，与在 2% FCS或EG-VEGF中保温相比，使更少的牛脑毛细管细胞的凋亡。Bv8和VEGF显示协同效 应，在同时含有Bv8和VEGF的培养基中保温，与在单独含有Bv8或VEGF的培养基中保温相 比，出现的凋亡细胞的数量少。图13显示BvS增加裸鼠睾丸中间质毛细胞的形成。给小鼠睾丸注射表达LacZ， VEGF, EG-VEGF,或Bv8的腺病毒载体以后，在经Bv8_处理的动物中，观察到睾丸内血管增殖 的增加。优选实施方案详述I.定义除非特别声明，本文中采用的技术和科学术语与本发明所述技术领域的普通技 术人员所通常理解的术语具有相同的含义。参见，例如Singleton等，Dictionafy of Microbiology and Molecular Biology 第 2 版，J. Wiley&Sons(New York, NY 1994)； Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)。为了本发明的目的，对以下术语作出如下限定。本文中术语“Bv8”和“Bv8多肽”可互换使用，它们指天然序列Bv8，BvS变体，和 嵌合Bv8，它们每一个都在本文中限定。可选地，BvS不与天然糖基化相关。“天然糖基化” 是指，当BvS在哺乳动物细胞(尤其天然产生BvS的细胞)中产生时，与其共价结合的糖组 分。因此，非人细胞中产生的人BvS是一例“不与天然糖基化相关”的Bv8。有时，BvS根本 不发生糖基化，正如它在原核细胞，例如大肠杆菌中产生时那样。Bv8核酸是编码上文定义的Bv8多肽的RNA或DNA，或者是与所述DNA或RNA杂 交并在严格杂交条件下与其稳定结合的、长度超过约10个核苷酸的RNA或DNA。严格杂 交条件是指，(1)利用低离子强度和高温洗涤，例如，0. 15M NaCl/0.015M柠檬酸钠/0. NaDodSO4, 50°C，或⑵在杂交期间使用变性剂，如甲酰胺，例如50% (vol/vol)甲酰胺以 及0. 牛血清白蛋白/0. 1% Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH6. 5， 750mM NaCl，75mM 柠檬酸钠，42°C。当核酸处于与另一个核酸序列有功能关系的位置上时，该核酸是可操作相连的。 BvS核酸可以与另一核酸序列在载体中可操作相连，使其能在具体宿主生物中表达。这可以 通过本领域已知方法进行。例如，前序列或分泌前导序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白 时，编码前序列或分泌前导序列的DNA与编码该多肽的DNA是可操作相连的；启动子或增强 子影响编码序列的转录时，其与该编码序列是可操作相连的；核糖体结合位点处在促进翻 译的位置上时，它与编码序列是可操作相连的。通常，“可操作相连”是指相连的DNA是邻接 的，而且，在分泌前导序列的情况中，是邻接并处在同一个阅读框中的。但增强子不是必需 邻接的。连接可通过，例如，在便利的限制性位点连接来完成的。如果不存在这类位点，可 根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头或连接区。“天然序列Bv8”包括具有与自然界衍生的BvS有相同氨基酸序列的多肽，无论其 通过什么方法制备。因此，天然序列BvS可以具有天然来源的人Bv8、鼠Bv8、或任何其它哺乳动物物种的BvS的氨基酸序列。例如，全长天然序列人BvS的氨基酸序列见图2(SEQ ID NO :2)。另一种全长天然序列人Bv8见图4(SEQ ID NO :4)。这两个序列是对编码标 准(canonical)肝素结合区的外显子进行两种不同剪接的结果。因此，氨基酸序列如图 2(SEQID NO 2)所示的那种天然序列人Bv8包含肝素结合区，而图4(SEQ ID NO 4)所示天 然序列Bv8不含该区。天然序列小鼠Bv8氨基酸序列见图6 (SEQ ID NO :6)。人和鼠Bv8的 序列也已经公开，参见 Wechselberger 等(FEBS Lett. 462 177-181 (1999))和 Li 等(Mol. Pharm. 59 :692_698 (2001))。这样的天然序列Bv8可以从自然界分离，也可以通过重组和/ 或合成手段制备。术语“天然序列Bv8”特别包含BvS的天然前原(pr印ro)形式，原(pro) 形式，成熟形式和截短形式，天然变体形式(例如旁路剪接形式，诸如图4(SEQ ID N0:4)所 示的形式)，以及天然等位变体。优选的天然序列BvS是图2 (SEQ ID NO 2)所示的全长天 然序列人Bv8。"Bv8变体”是指，具有不同于天然序列BvS多肽的氨基酸序列的生物活性BvS多 肽，如图2，4和6(SEQ ID NOs :2，4和6)所示的人和鼠Bv8，可通过在天然序列中插入、 缺失、修饰和/或取代一或多个氨基酸残基而获得。BvS变体通常与天然序列BvS有不到 100%序列同一性，如图2(SEQ ID NO :2)所示的人Bv8。但一般情况下，生物活性Bv8变 体具有与天然Bv8(如图2 (SEQ ID NO :2)所示的人Bv8)至少约70%氨基酸序列同一性 的氨基酸序列，优选至少约75 %，更优选至少约80 %，还更优选至少约85 %，还更优选至少 约90%，优选以的增量从至少约95%递增到至少约99%的氨基酸序列同一性。BvS变 体包括具有至少5个氨基酸且保留了编码天然序列BvS多肽的生物活性的肽片段。BvS变 体还包括在天然BvS序列的N-或C-末端，或者内部添加了一或多个氨基酸残基的BvS多 肽。BvS变体还包括缺失了多个氨基酸残基并且任选地被一或多个氨基酸残基取代的BvS 多肽。BvS变体还可以进行共价修饰，例如用不同于天然氨基酸的组分进行取代，或者修饰 氨基酸残基从而产生非天然氨基酸。BvS变体可以包含肝素结合区。BvS的“氨基酸序列同一性百分比”在本文中定义为，经过序列对比，并在必要时 导入空隙以获取最大序列同一性百分比，而不将任何保守取代视为序列同一性的一部分 时，候选序列中与BvS序列相同的氨基酸残基的百分比。在候选的BvS序列中，在N-末端、 C-末端或内部的延伸，缺失或插入，都不视为影响序列同一性或同源性。序列比对的方法和 计算机程序是已知的。一个这样的计算机程序是Genentech，Inc.公司拥有“ALIGN-2”，该 程序及其用户文件(user documentation)已提交美国版权局(United States Copyright Office)，Washington, D. C. 20559，其美国版权注册号为 TXU510087。“嵌合Bv8”分子是包含与异源多肽融合或键合的全长BvS或其一或多个结构域的 多肽。嵌合BvS分子通常与天然BvS共享至少一种生物学特性。嵌合BvS分子的一个实例 是带有可用于纯化的表位标签的分子。另一种嵌合BvS分子是BvS免疫粘附素。本文中“带有表位标签”是指，包含与“标签多肽”融合的BvS的嵌合多肽。标签 多肽具有足以提供制备抗体所需的表位的残基，但同时它又很短，不会干扰BvS的生物活 性。标签多肽优选非常独特，使其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多 肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常约8-50个氨基酸残基(优选约9-30个残基)。优选 聚_组氨酸序列，它可以与镍结合，从而能通过Ni-NTA层析分离带有该标签的蛋白(参见， 例如 Lindsay 等 Neuron 17 :571_574 (1996))。
“分离的Bv8”是指，从BvS来源纯化得到的，或者是通过重组或合成方法制备并纯 化的Bv8。纯化的BvS基本上不含其它多肽或肽。“基本上不含”是指，其它来源的蛋白的 污染少于约5 %，优选少于约2 %，更优选少于约1 %，还更优选少于约0. 5 %，最优选少于约 0.1%。“基本纯”的蛋白是指一种组合物，其总重量中有至少约90%重量是所述蛋白，优 选至少约95%重量，更优选至少约90%重量，还更优选至少约95%重量。“基本均一”的蛋 白是指一种组合物，其总重量中有至少约99%重量是所述蛋白。BvS “激动剂”是具有天然序列BvS的一或多种生物学特性的分子或化合物。包括 但不限于，有机小分子，肽，和激动剂抗-BvS抗体。术语“拮抗剂”使用其最广泛含义，包括任何能部分地或完全地阻断、抑制、或中和 天然BvS多肽的生物活性的分子。合适的拮抗剂分子具体包括拮抗剂抗体或抗体片段，天 然BvS多肽的片段或氨基酸序列变体，肽，有机小分子等。鉴定BvS多肽的激动剂或拮抗剂 的方法包括使BvS多肽与候选的激动剂或拮抗剂分子接触，并测定通常与BvS多肽有关的 一或多种生物活性的改变。本文中“活性”是指保留了天然BvS的生物活性或免疫活性的BvS形式，其中“生 物”活性是指由天然BvS导致的生物功能(抑制或刺激)，但它不是指天然BvS诱导产生抗 天然BvS加工的抗原性表位的抗体的能力，“免疫”活性是指天然BvS诱导产生抗天然BvS 加工的抗原性表位的抗体的能力。因此，当“生物活性”与“Bv8”或“分离的Bv8”或BvS激动剂联合使用时，是指具 有或共有天然序列BvS的效应功能的BvS多肽。BvS的一种基本效应功能是其刺激内皮细 胞增殖的能力。还更优选，生物活性是指在内分泌腺体内部的毛细管内皮细胞(优选生成 类固醇的细胞)中诱导增殖的能力。BvS的另一种效应功能是其诱导血管生成的能力。“生物学特性”当与“Bv8”或“分离的Bv8”或BvS激动剂联合使用时，是指具有由 天然序列BvS (不管是其天然构型还是非天然构型)直接或间接导致或实施的效应功能或 效应活性或抗原功能或抗原活性。效应功能包括增强内皮细胞的增殖和/或诱导血管生 成。"Bv8受体”是与BvS结合并介导BvS的生物学特性的分子。术语“抗体”是指最广义上的抗体，具体包括人、非-人(例如鼠)和人源化的单 克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体 片段，只要它们显示所需的生物学活性。“抗体” (Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体表现出对 特异抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和其它缺少抗原特异性的抗体-样分子。 后一类多肽例如是，在淋巴系统中低水平产生而在骨髓瘤中高水平产生的那些。“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由 两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相 连，而不同免疫球蛋白同种型的重链具有不同的二硫键数目。每条重链和轻链还有规则间 隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(Vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有 可变区(\)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与 重链的可变区相对。人们相信有一些氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
术语“可变”是指可变区一些部分的序列在不同抗体之间有很大差异，它们可在各 个具体抗体针对其具体抗原的结合和特异性方面发挥作用。然而，该变异性并非均勻分布 于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中三个称为超变区的节段中。可变区中 高度保守的区域称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包括4个FR(分别为FR1， FR2，FR3和FR4)，主要采取β折叠构型，由三个超变区相连，形成环状连接，在某些情况下 可形成所述β折叠结构的部分。每条链的超变区通过FR紧密相连，彼此十分靠近，并且与 其它链的超变区一起形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，Sequences of Proteins of Iroanzmaological Interest,第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)，第647-669页)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但 是表现出各种效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性作用。本文中术语“超变区”是指抗体上负责与抗原结合的氨基酸残基。超变区包含来 自“互补决定区”或“CDR，，的氨基酸残基(即，轻链可变区中的残基24-34 (Li)，50-56 (L2) 和 89-97 (L3)，重链可变区中的 31-35 (Hl)，50-65 (H2)和 95-102 (H3) ；Kabat 等，Sequence of proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))，和 / 或来自“超变环”的那些残基(即， 轻链可变区中的残基26-32 (Li)，50-52 (L2)和91-96 (L3)，重链可变区中的26-32 (Hl)， 53-55 (H2)和 96-101(H3) ；Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901_917 (1987))。“框架区，， 或“FR”残基是那些可变区的残基而不是本文定义的超变区残基。用木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的各带有单个抗原结合位点的抗原结合 片段(称为“Fab”片段)和残余的“Fe”片段，Fc片段的名称反应了其易于结晶的能力。经 胃蛋白酶处理可产生具有两个抗原结合位点并仍然能与抗原交联的F(ab’)2片段。“Fv”是含有完整的抗原_识别和_结合位点的最小抗体片段。此区由一个重链可 变区与一个轻链可变区紧密地非共价连接形成的二聚体组成。在这个构型中，每个可变区 的三个CDR相互作用，在Vh-Vl 二聚体表面限定一个抗原结合位点。这六个CDR共同赋予抗 体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv上仅含有三个抗原特异性超变区的 一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管与完整的结合位点相比其亲和力较低。Fab段还包括轻链恒定区和重链的第一个恒定区(CHl)。Fab，片段区别于Fab片段 之处在于，Fab'在重链CHl区的羧基末端多出几个残基，包括抗体铰链区的一个或多个半 胱氨酸。Fab’ -SH在本文中是指恒定区半胱氨酸残基带有至少一个游离巯基的那些Fab’。 F(ab' )2抗体片段最初产生为Fab’片段对的形式，在它们之间具有铰链区半胱氨酸。抗体 片段的其它化学偶联是众所周知的。脊椎动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可依据其恒定区氨基酸序列 而归为两种完全不同类型(称为κ和λ)中的一类。免疫球蛋白根据其重链恒定区的氨基酸序列可分为不同的类。主要有5类免疫球 蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ 和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的 实例包括Fab、Fab，、F (ab，)2和Fv片段；二价抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。本文中术语“单克隆抗体”是指来自基本均一的抗体群的抗体，S卩，除了可能少量 存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。单克隆抗体具有高度特异性，仅针对 单个抗原位点。而且，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆) 抗体制剂相反，每种单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆”表明该抗体 的特点，即，它来自基本均一的抗体群，不解释为需通过任何特殊方法产生该抗体。例如，根 据本发明应用的单克隆抗体可通过由Kohler等，Nature, 256 =495(1975)首先描述的杂交 瘤法进行制备，或者可通过重组DNA法进行制备(例如见美国专利4，816，567)。“单克隆 抗体”还可利用例如 Clackson 等，Nature, 352 :624_628 (1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.， 222 581-597(1991))所述技术从噬菌体抗体库中分离。本文中单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其重链和/或轻链的一 部分与源自具体物种或属于具体抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，但所述链 的剩余部分的序列与源自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体(以及此抗体 的片段，只要它们显示所需的生物学活性)的相应序列相同或同源(美国专利4，816，567; Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851_6855 (1984))。“人源化”非人(例如小鼠)抗体是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗 体。大多数场合，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，但其中受体的超变区残基被 具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类等非人源物种抗体(供 体抗体)的超变区残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应 的非人类残基所取代。而且，人源化抗体可包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。 这些修饰旨在进一步细化(refine)抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个 (通常包括两个)可变区的全部，其中超变区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋 白的相应部分，而FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白的序列。人源化抗体还任选包 括免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常为人的免疫球蛋白恒定区。详见Jones等，Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323_329 (1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 593-596(1992)。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，这些结构域存在于 单个多肽链上。Fv多肽在Vh和\结构域之间通常还包含一个多肽接头，它能使scFv 形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluclcthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,卷 113, Rosenburg and Moore 编 Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994)。术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条 多肽链(Vh-Vl)上含有相连的一个重链可变区(Vh)和一个轻链可变区(VL)。利用一种太 短以至于同一条链上的两个结构域无法配对的接头，可以迫使这些结构域与另一条链上的 互补结构域配对，并形成两个抗原结合位点。二价抗体的详细说明参见，如EP 404,097 ；WO 93/11161 ；以及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)。本申请全文中用到的“线性抗体”，是指在Zapata等，Protein Eng. 8 (10) 1057-1062(1995)中描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd片段 (Vh-ChI-Vh-ChI)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以具有双特异性或单特异性。
术语“表位”是指蛋白抗原上与(单克隆或多克隆)抗体结合的位点。“激动剂抗体”是指可以作为BvS激动剂并因此具有天然序列BvS的一或多种生物 学特性的抗体。术语“Bv8免疫粘附素”与术语“Bv8_免疫嵌合体”可以互换使用，它们都是指将 BvS分子(天然或变体)的至少一部分与免疫球蛋白序列组合形成的嵌合分子。免疫球蛋 白序列优选，但并非必需是，免疫球蛋白恒定区。免疫粘附素可以具有人抗体的多种有价值 的化学或生物学特性。由于可以将具有所需特异性的人蛋白序列与适当的人免疫球蛋白铰 链区和恒定区(Fe)序列相连来构建免疫粘附素，因此可以用完整的人组分获得所需的结 合特异性。这样的免疫粘附素对患者的免疫原性最小，长期或反复使用的安全性较好。已报道可用于治疗的同型多体免疫粘附素包括⑶4-IgG免疫粘附素，它可以使 HIV与细胞表面的CD4结合。在I期临床试验中，将CD4-IgG施用于即将临产的孕妇，所得 的数据提示，这种免疫粘附素可以有效防止HIV的母婴传播(Ashkenazi等，Intern. Rev. Immunol. 10 :219-227 (1993))。还有人开发了与肿瘤坏死因子(TNF)结合的免疫粘附素。 TNF是一种前炎性(proinflammatory)细胞因子，有证据表明它是败血性休克的主要介质。 基于小鼠败血性休克模型的试验表明，TNF受体免疫粘附素有望作为临床治疗败血性休克 的药物(Ashkenazi，Α.等(1991)PNAS USASE 10535-10539)。ENBREL (etanercept) 也是一种免疫粘附素，它包含与IgG Fc区融合的TNF受体，美国食品和药品管理局(FDA) 于1998年11月2日批准将它用于治疗类风湿性关节炎。2000年6月6日，经FDA批 准，ENBREL 在治疗类风湿性关节炎方面的应用进一步扩展。有关TNF阻断药(包括 ENBREL )的最新信息，可参见 Lovell 等，N. Engl. J. Med. 342 =763-169 (2000)，以及第 810-811 页的相关评论；Weinblatt 等，N. Engl. J. Med. 340 :253_259 (1999)；综述见 Maini and Taylor, Annu. Rev. Med. 51 207-229(2000.当免疫粘附素结构的双臂具有不同特异性时，将这种免疫粘附素称为“双特异性 免疫粘附素”，类似于双特异性抗体。Dietsch等，J. Immunol. . Methods 162 123 (1993)描 述了一种这样的双特异性免疫粘附素，它组合了粘附分子E-选择素和P-选择素的胞外区， 这两种选择素在自然状态下是在不同类型的细胞中表达。结合研究表明，如此形成的双特 异性免疫球蛋白融合蛋白与衍生出它的单特异性免疫粘附素相比，与髓样细胞系的结合能 力增强了。术语“异型粘附素”与“嵌合异型多体粘附素”可以互换使用，是指嵌合分子(氨 基酸序列)的复合物，其中每一嵌合分子将每一异型多体受体单体的生物活性部分(如胞 外区)与一种多体化结构域组合在一起。“多体化结构域(multimerization domain) ”促 进了该异型多体复合物内部的嵌合分子之间稳定的相互作用。多体化结构域可以借助以下 结构发生相互作用免疫球蛋白序列，亮氨酸拉链，疏水区，亲水区，或者形成嵌合异型多体 的嵌合分子之间的分子间二硫键的游离巯基。多体化结构域可包含免疫球蛋白恒定区。经 过工程改造，多体化结构域还可以使其空间相互作用不仅有利于稳定的相互作用，而且有 利于在由单体混合物形成的同型二聚体上形成异型二聚体。“突起(Protuberances) ”是将 第一种多肽的界面上的氨基酸小侧链替换为较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)而形成的。备 选地，可以在第二种多肽上，通过用较小的氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代较大侧 链，而形成与所述突起具有相同或相似大小的互补型“空穴”。所述免疫球蛋白序列优选，但并非必需是，免疫球蛋白恒定区。本发明嵌合体中的免疫球蛋白组分优选来自IgG，，IgG2， IgG3 或 IgG4 亚类，IgA, IgE, IgD 或 IgM，但优选 IgG，或 IgG3。本文中“治疗”是指获得有益的或所需的临床后果的方法。为了本发明的目的，有 益的或所需的临床后果包括，但不限于，症状缓解，疾病的程度减轻，疾病状态稳定(即，不 恶化)，疾病进展延迟或减慢，疾病状态改善或减轻，以及消退(部分或全部)，无论是可以 检测到的还是不能检测到的。“治疗”还可以指与不接受治疗所预期的存活相比，存活延长。 “治疗”是为了阻止疾病进展或改变疾病的病理学而实施的介入。因此，“治疗”既指治疗性 措施也指预防性措施。需要治疗的个体包括那些已经患有疾病或者希望预防患病的个体。 具体地，治疗可直接阻止，减缓或降低细胞变性或损伤的病理学，如癌症治疗中肿瘤细胞的 病理学，或者可以使细胞对其它治疗剂的治疗更敏感。“类固醇生成(Steroidogenesis) ”是由激素诱导、CAMP-介导的对“生成类固醇的 细胞”中类固醇激素生物合成的急性调节，其特征在于胆固醇从细胞内贮藏地转移到线粒 体外膜，以及转移到内膜，胆固醇在那里被转化为孕烯醇酮(pregnenolone)。“生成类固醇的组织”是指通过类固醇生成过程产生类固醇激素的组织。实例包括 肾上腺，生殖器官，肠道和呼吸道组织。“长期(Chronic) ”给药是指将试剂以连续方式而非短期(acute)方式给药，使得 能将最初的治疗效应(活性)维持更长的时间。“间断(Intermittent)”给药是指一种治 疗，它不是没有中断地连续进行，本质上是一种循环。需要治疗的“哺乳动物”是指哺乳类任何动物，包括人、其它高等灵长类，家养动 物、农用动物，和动物园、运动项目用的动物或宠物，如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。 优选哺乳动物是人。本文中“肿瘤”是指所有瘤细胞(neoplastic cell)生长和增殖(无论恶性或良 性)，和所有前癌性(pre-cancerous)和癌性(cancerous)细胞和组织。术语“癌”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长失控为特点的病理 状态。本文中癌的实例包括但不限于生殖器官癌，例如，卵巢癌，睾丸癌，子宫癌，宫颈癌；前 列腺癌；肾上腺癌，包括肾上腺皮质癌(例如肾上腺皮质瘤(carcinoma))和肾上腺髓质癌； 甲状腺癌；甲状旁腺癌；胰腺癌；以及子宫内膜癌。疾病的“病理学”包括患者健康状况(well-being)在内的所有现象。对于癌症而 言，包括但不限于，异常或失控的细胞生长，转移，干扰邻近细胞的正常功能，释放异常水平 的细胞因子或其它分泌产物，抑制或加重炎症或免疫应答，等等。与一或多种其它治疗剂“联合”给药包括同时给药和以任何顺序连贯给药。本文所用“载体”包括在所用剂量和浓度下对所暴露的细胞或哺乳动物没有毒性 的可药用载体、赋形剂、或稳定剂。可药用载体常常是含水的PH缓冲的溶液。可药用载体 的实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量 (小于10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡 咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水 化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA ；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反离子 如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和PLUR0NICS 。“脂质体”是由能向哺乳动物有效运送药物(如BvS多肽或其抗体)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小分子囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，与生物膜 的脂质排列相似本文中“小分子”是指分子量小于约500道尔顿。本文中术语“血管内皮生长因子”，“VEGF”，“VEGF多肽”和“VEGF蛋白”包括天然 序列VEGF和VEGF变体(见下文详述)。VEGF多肽可以从各种来源分离，如从人组织类型 或从其它来源分离，或通过重组和/或合成方法制备。“天然序列VEGF”包括具有与自然界衍生的VEGF相同的氨基酸序列的多肽。所 述天然序列VEGF可以从自然界分离或者通过重组和/或合成手段制备。术语“天然序 列VEGF”具体包括VEGF的天然截短形式或分泌形式(如，胞外区序列)，天然变体形式 (如，旁路剪接形式)以及天然衍生的等位变体。在本发明一个实施方案中，天然序列 VEGF是分别由121，145，165，189和206个氨基酸残基组成的五种同工型之一，对这五种 同工型的描述见美国专利 5，332，671 和 5，240，848 ；W098/10071 ；Leung 等，Science 246 1306-1309(1989) ；Keck 等，Science 246:1309-1312(1989)。"VEGF变体多肽”是指如下定义的活性VEGF多肽，其与天然序列VEGF的氨基酸序 列有至少约80 %，优选至少约85 %，更优选至少约90 %，还更优选至少约95 %，最优选至少 约98 %的氨基酸序列同一性。这样的VEGF变体多肽包括，例如，在天然序列的N-和/或 C-末端、以及一或多个内部结构域中添加或删除一或多个氨基酸残基所形成的VEGF多肽。VEGF的序列同一性(无论氨基酸或核酸)采用与BvS相同的方法来确定。类似 地，对BvS的激动剂和拮抗剂(包括但不限于抗体)的定义也适用于VEGF激动剂和拮抗剂。B.实施本发明的方法1.鉴定Bv8变体除了本文所述全长天然序列BvS多肽，本发明还涉及鉴定，制备和应用BvS变体。 BvS变体可通过将适合的核苷酸变化引入BvSDNAJP /或通过合成所需BvS多肽来制备。 本领域技术人员可以理解，氨基酸的变化可以改变BvS的翻译后加工，例如改变糖基化位 点的数目或位置。制备BvS变体的方法优选下文将详细描述的制备天然序列BvS的方法相 同，唯一的差别是用编码BvS变体的核酸取代编码天然序列BvS的核酸。本发明的方法中用到了编码BvS的核酸分子。编码人BvS的两种全长变体的cDNA 示于图1和2(SEQ ID N0S:1和2)，相应的推导氨基酸序列示于图2和4(SEQ ID NOS :2和 4)。编码小鼠Bv8的cDNA示于图5(SEQ ID NO :5)，其相应的推导氨基酸序列示于图6 (SEQ ID NO :6)。本发明中使用的多核苷酸可以用本领域技术人员熟知的标准技术，如杂交筛选 和PCR方法来获得。编码BvS的氨基酸序列的任何核苷酸序列都可以用于制备能指导BvS表达的重组 分子。本发明的方法还可以利用由BvS编码序列与编码异源蛋白的第二种序列形成的融合 多核苷酸。为了从编码完整Bv8cDNA的任何物种(species)克隆出全长同源cDNA序列，或者 克隆出家族成员或变体形式(如等位变体)，可以从对应于本文所述cDNA序列任何部分的 片段制备DNA探针，将该探针带上标记，然后用于筛选从据信能表达BvS的细胞或组织类型 衍生的cDNA文库。更具体地，可以用对应于编码序列的5’或3’末端的寡核苷酸获得更长 的核苷酸序列。
有可能必需筛选来自不同组织的多重cDNA文库，以便获得全长cDNA。进行cDNA 克隆时，常常难于鉴定编码完整5’端编码区的cDNA克隆，在这样的事件中，可以使用 RACE(cDNA末端快速扩增)技术。RACE是业已证实的一种以PCR为基础、扩增不完整cDNA 的5’端的策略。从人的胎盘合成的、含有唯一锚着序列的5’ -RACE-Ready RNA已有商品 (Clontech)。为了获得cDNA的5，端，用所提供的锚着引物和3，引物对5，-RACE-Ready cDNA进行PCR。然后用被锚着的引物和一种巢式3’引物按照厂家建议进行第二轮PCR。一 旦获得了全长cDNA序列，就可以将其翻译成氨基酸序列，并检查特定的标记(landmark)， 如，以翻译起始和终止位点为两侧的连续的开放阅读框，潜在的信号序列，以及整体结构与 本文所述BvS序列的相似性。备选地，可以使用下文所述的相应严格条件，用标记的探针筛选从目的生物衍生 的基因组文库。可以根据本文所述的BvS编码序列，设计两个简并寡核苷酸引物库，通过聚合酶 链反应(PCR)分离出BvS编码序列或同源序列。该反应的模板可以从，例如，人或非人细胞 系，或者已知或怀疑表达BvS等位基因的组织制备的mRNA进行反转录(RT)而获得。可以将PCR产物再克隆并测序，以确保所扩增的序列代表BvS的编码序列。然后， 用PCR片段经各种方法分离全长cDNA克隆。例如，可以将所扩增的片段进行标记，并用于 筛选噬菌体cDNA文库。另一种方法是，用带有标记的片段通过筛选基因组文库来分离基因 组克隆。PCR技术也可以用于分离全长cDNA序列。例如，可以按照标准方法从相应的细胞 来源或组织来源分离RNA。可以用特异于扩增片段5’最末端的寡核苷酸引物对所述RNA进 行RT反应，从而引发第一链合成。然后，使所得RNA/DNA杂合体的尾部通过标准的末端转 移酶反应而带上(tailed with)鸟嘌呤，用RNAase H消化该杂合体，然后用poly-C引物引 发第二链合成。如此一来，可以轻易分离出扩增片段上游的cDNA序列。也可以利用，例如PCR，分离出BvS基因的突变体或等位基因变体的cDNA克隆。在 这种情况中，通过使oligo-dT寡核苷酸与从推定携带BvS等位基因突变的个体中已知或怀 疑表达BvS的组织分离得到的mRNA杂交来合成第一条cDNA链，并用逆转录酶延伸这条新 链。然后用与正常基因的5’末端特异性杂交的寡核苷酸合成第二条cDNA链。再用这两种 引物将产物通过PCR进行扩增，克隆到合适的载体中，用本领域已知的方法进行DNA序列分 析。将BvS等位基因突变与正常的BvS等位基因的DNA序列进行比较，确定使突变的BvS 基因产物的功能发生损失或改变的突变。另一种方法是，从怀疑或已知携带突变的BvS等位基因的个体获得DNA，用该DNA 构建基因组文库；或者，从已知或怀疑表达突变的BvS等位基因的组织获得RNA，用该RNA 构建cDNA文库。再将未受损的(unimpaired)BvS基因或其任何合适的片段带上标记，并用 作探针，来鉴定所述文库中相应的突变的BvS等位基因。然后将包含所述不同的BvS基因 序列的克隆纯化，按照本领域已知方法进行序列分析。另外，可以从怀疑或已知携带突变的BvS等位基因的个体中已知或怀疑表达该突 变的等位基因的组织分离出RNA，从该RNA合成cDNA，再用该cDNA构建表达文库。在这种 方法中，由推定的突变组织制备的基因产物得以表达，并可以按照标准的抗体筛选技术，用 抗正常BvS基因产物的抗体进行筛选，如下所述。
本文中，术语核酸，多核苷酸和核苷酸可以互换使用，它们指任何核酸，无论是 脱氧核糖还是核糖核酸，也无论是由磷酸二酯键构成还是由下述经过修饰的键构成， 所述经过修饰的键如磷酸三酯，氨基磷酸酯，硅氧烷，碳酸酯，羧甲基酯，氨基乙酸酯 (acetamidate)，氨基甲酸酯，硫醚，桥联(bridged)氨基磷酸酯，桥联亚甲基膦酸酯，桥联 氨基磷酸酯，桥联氨基磷酸酯，桥联亚甲基膦酸酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸 酯，桥联硫代磷酸酯或磺内酯(sultone)键，或这些键的组合。术语核酸，多核苷酸和核苷酸具体包括由除了 5种生物学天然碱基(腺嘌呤，鸟嘌 呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，和尿嘧啶)以外的其它碱基组成的核酸。例如，本发明的多核苷酸可 以包含至少一个选自下组的经修饰的碱基5_氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿 嘧啶，次黄嘌呤，xantine，4-乙酰基胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲 基-2-硫代尿苷，5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶，二氢尿嘧啶，beta-D-半乳糖基queosine， 次黄嘌呤核苷N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基次黄嘌呤核苷2，2- 二甲基鸟 嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基 鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，beta-D-甘露糖基 queosine, 5N-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代_N6_异戊烯基腺 嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2_硫代胞嘧啶，5_甲 基-2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基 酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，3-(3_氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧 啶，(acp3)w，和2，6_ 二氨基嘌呤。本发明所用的多核苷酸还可以包含至少一个修饰的糖组分，该糖组分选自阿拉伯 糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖，和己糖。本发明的方法并不想限定多核苷酸的来源。所述多核苷酸可以来自人或非人哺乳 动物，衍生自任何重组来源，通过体外合成或化学合成。所述核苷酸可以是DNA或RNA，可以 是双链，单链或部分双链形式。本发明有用的核酸包括，例如但不限于，寡核苷酸如反义DNA和/或RNA ；核酶；用 于基因治疗的DNA ；DNA和/或RNA嵌合体；DNA的各种结构形式，包括单链DNA，双链DNA， 超螺旋DNA和/或三螺旋DNA ；Z-DNA ；等等。核酸可以通过常用于大量制备核酸的任何常 规手段来制备。例如，DNA和RNA可以用市售试剂和合成仪按照本领域已知的方法进行化学 合成(参见，例如，Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, IRL Press，牛津，英国)。RNA 可以例如诸如 SP65(Promega Corporation, Madison, WI)等质粒 通过体外转录而大量制备。由BvS核酸序列编码的任何mRNA转录子都可以用于本发明的方法中，包括对mRNA 前体进行旁路剪接或加工所得的mRNA转录子。在有些情况下，当希望增加核酸酶的稳定性时，优选具有修饰的核苷酸之间连接 键的核酸。具有修饰的核苷酸之间连接键的核酸也可以用本领域已知的试剂和方法合成。 例如，合成含有以下核苷酸之间连接键的核酸的方法是本领域已知的，所述连接键是指膦 酸硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，氨基磷酸甲氧基乙基氨基磷酸酯，甲乙缩醛(formacetal)， 硫代甲乙缩醛(thioformacetal)，二异丙基甲硅烷基(diisopropylsilyl)，氨基乙酸酯， 氨基甲酸酯，二亚甲基-硫醚(sulfide) (-CH2-S-CH2)，二亚甲基-亚砜(-CH2-S0_CH2)，二亚甲基-砜(-CH2-S02-CH2)，2，-0-烷基，和2’ -脱氧-2’ -氟硫代磷酸酯(参见，Uhlmarm 等，1990，Chem. Rev. 90 :543_584 ；Schneider 等，1990, Tetrahedron Lett. 31 335 以及其中 引用的参考文献)。在本发明一些实施方案中，所用的核苷酸是α-端基异构(anomeric)核苷酸。 α -端基异构核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂合体，其中的链彼此平行，而不是形成通 常的 β-单位(Gautier 等，1987，Nucl. Acids Res. 15 :6131_6641)。所述核苷酸是 2N-0-甲 基核糖核苷酸(Inoue 等，1987，Nucl. Acids Res. 15 :6131_6148)，或嵌合 RNA-DNA 类似物 (Inoue 等，1987，FEBS Lett. 215 :327_330)。所述核酸可以用本领域已知的任何适当方法进行纯化。例如，可以通过反相或离 子交换HPLC，大小排阻层析或凝胶电泳来纯化核酸。当然，本领域技术人员应能认识到，纯 化方法部分地取决于需要纯化的DNA的大小。BvS编码序列的经过分离或纯化并具有至少10个核苷酸(即可杂交部分)的多核 苷酸或其片段，也可以用于本发明的方法中。在其它实施方案中，所述多核苷酸包含BvS编 码序列的至少25个(连续)核苷酸，50个核苷酸，100个核苷酸，150个核苷酸，或200个核 苷酸，或包含BvS编码序列的全长。核酸可以是单链或双链。此外，本发明涉及与上述编码 序列选择性杂交的多核苷酸。在优选的实施方案中，所述多核苷酸包含BvS编码序列的至 少10，25，50，100，150或200个核苷酸或其全长。编码BvS突变体，BvS肽片段，BvS截短形式，和BvS融合蛋白的核苷酸序列也可以 用于本发明的方法中。编码融合蛋白的核苷酸包括，但不限于，全长BvS序列，BvS的截短 形式，或者与不相关蛋白或肽融合的编码BvS肽片段的核苷酸，例如，与Ig Fc区融合而增 强所得融合蛋白(如BvS-Ig)在血流中的稳定性和半寿期；或者酶，例如可以用作标志物的 荧光蛋白或发光蛋白。此外，本发明方法中可以使用至少部分地通过一些形式的变革，如基因改组和/ 或回归(recursive)序列重组(美国专利5，605，793和5，837，458)而产生的Bv8多核苷 酸变体。例如，可以利用这样的技术，以一或多个BvS编码序列作为起始点，来产生编码具 有改变的功能和/或结构特性的功能性和/或结构性类似蛋白的新序列。与上述编码BvS的多核苷酸序列高度相关的基因同系物也可以用于本发明。高 度相关的基因同系物是编码蛋白的多核苷酸，它们与天然BvS的氨基酸序列，例如图2或 图4(SEQ ID NOs 2和4)所示的人成熟Bv8的氨基酸序列，具有至少约60%的氨基酸序列 同一性，优选至少约65 %，70 %，75 %，80 %，优选以1 %的增量从至少约85 %递增到至少约 99%的氨基酸序列同一性。高度相关的同系物可以编码与BvS具有相同功能活性的蛋白。本发明方法的有利之处还在于可以利用以下物质(a)DNA载体，包含上述任一种 BvS编码序列和/或其互补体(即反义序列)；(b) DNA表达载体，包含上述任一种BvS编 码序列、且该序列与指导其表达的调节元件可操作相连；(c)遗传工程化宿主细胞，包含上 述任一种BvS编码序列、且该序列与指导其在宿主细胞中表达的调节元件可操作相连；和 (d)遗传工程化宿主细胞，其在外源引入的调节元件控制之下表达内源BvS基因(即基因活 化)。天然序列BvS中或者本文所述BvS的结构域中的变异，可以通过，例如，进行保守 和非保守突变的任何技术和指南来产生，例如，参见美国专利5，364，934。变异可以是取代、缺失或插入一或多个编码BvS的密码子，使该BvS的氨基酸序列与天然序列BvS相比发生 改变。可选地，所述变异是将BvS的一或多个结构域中的至少一个氨基酸用另一氨基酸取 代。确定哪一个氨基酸残基可以进行插入、取代或缺失而不影响所需活性的方法可以是，将 BvS的序列与已知的同源蛋白分子的序列进行比较，并使高度同源区域中氨基酸序列变化 的数量最小。氨基酸取代可以是将一个氨基酸替换为具有相似结构和/或化学特性的另一 氨基酸，如将亮氨酸替换为丝氨酸，即保守氨基酸替换。插入或缺失可以任选在约1-5个氨 基酸的范围内。所能允许的变异可以如下确定在所述序列中进行总体(systematically) 的氨基酸插入、缺失或取代，并检验所得变体是否具有全长或成熟天然序列的活性。BvS多肽片段也可以用于本发明方法中。这样的片段可以是，与全长天然蛋白相 比，在N-末端或C-末端截短，或缺少内部残基。一些片段缺少BvS多肽的目标生物活性所 不必需的氨基酸残基。BvS片段可以用多种常规技术中的任一种来制备。所需肽片段可以化学合成。另 外的方法涉及对BvS片段进行酶消化，例如用已知在特定氨基酸所占据的位点进行切割的 酶处理所述蛋白，或用合适的限制酶消化DNA并分离所需片段。另一种合适的技术涉及分 离并通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码所需多肽片段的DNA片段。在PCR中，可以利用该 DNA片段所需末端的寡核苷酸作为5’和3’因为。优选BvS多肽片段与天然BvS多肽具有 至少一种相同的生物学和/或免疫学活性。在具体实施方案中，感兴趣的保守取代见表1的“优选取代”栏。如果这些取代引 起生物学活性的改变，则可引入表1中“取代举例”栏的更实质性改变，或进一步在下文的 氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。表1
原始残基取代举例优选取代
Ala(A)val ；Ieu ；ileval
Arg(R)Iys ；gin ；asnIys
Ash(N)gin ；his ；asp, Iys ；arggin
Asp (D)glu ；asnglu
Cys(C)ser ；alaser
Gln(Q)asn ；gluasn
Glu(E)asp ；ginasp
Gly(G)alaala
His(H)asn ；gin ；Iys ；argarg
Ile(I)Ieu ；val ；met ；ala ；phe ；正亮氨酸leu
Leu(L)正亮氨酸；ile ；val ；met ；ala ；pheile
Lys(K)arg ；gin ；asnarg
Met (M)Ieu ；phe ；ileleu
Phe (F)Ieu ；val ；ile ；ala ；tyrtyr
Pro (P)alaala
Ser(S)thr ；cyscys
Thr(T)serser 22
Trp (W) tyr ；pheTyr (Y) trp ；phe ；thr ； serVal (V) ile ；Ieu ；met ；phe ；ala ；正亮氨酸
tyr
phe
IeuBvS多肽的功能或免疫学特性的实质改变可通过选择性取代来完成，所选的取代 应在维持(a)取代区多肽骨架的结构，例如片层结构或螺旋构象，(b)该分子的靶位点的电 荷或疏水性，(c)侧链的大小，这几方面有显著不同的效应。天然残基根据共有的侧链特性 可分为(1)疏水性正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸异亮氨酸(2)中性亲水半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)碱性天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸(5)影响侧链定向的残基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。也可以将这类取代残基弓I入 保守取代位点，更优选引入剩余(非保守)位点。可以使用本领域已知方法如寡核苷酸_介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描，和PCR 诱变技术来产生变异。可以对克隆的DNA实施定点诱变(Carter等，Nucl. Acids Res., 13 4331(1986) ；Zoller 等，Nucl. Acids Res.，10 :6487 (1987))、盒式诱变(Wells 等， Gene，34 :315 (1985))、限制选择诱变(Wells 等，Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317 415(1986))或其它已知技术以产生Bv8变体DNA。扫描氨基酸分析也可用于沿邻接序列鉴定一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸 是相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通 常是此组中优选的扫描氨基酸，因为它不存在β “碳上的侧链并且极少改变变体的主链构 象(Cunningham 和 Wells，Science, 244 1081-1085 (1989))。优选丙氨酸的另一原因是因 为它是最常用氨基酸。而且，它常常既出现在埋藏位置也出现在暴露位置(Creight0n，The Proteins, (W. H. Freeman&Co. , N. Y.) ；Chothia，J. Mol. Biol.，150 1 (1976))。如果丙氨酸 取代不能产生足够量的变体，则可使用同构(isoteric)氨基酸。2.制备Bv8和Bv8变体适合于制备BvS和BvS变体的技术是本领域已知的。鉴于优选的技术对于BvS和 BvS变体而言是一样的，因而下述技术既可以应用于BvS变体也可以应用于天然序列Bv8。优选的制备方法包括从BvS的内源性来源分离该多肽，肽合成(用肽合成仪)和 重组技术(或这些技术的任意组合)。以下论述主要涉及，通过培养已被含有BvS核酸的载体转化的细胞并从培养物中 回收该多肽来重组制备Bv8。但本领域技术人员将认识到，还有其它很多种制备BvS的方法。简言之，该方法涉及用构建体(即载体)转化含有BvS编码基因的原代人细胞，所 述构建体包含可以扩增的基因(如二氢叶酸还原酶(DHFR)或下述其它基因)和至少一个 侧翼区，该侧翼区有至少约150bp且与BvS基因编码区座位上的DNA序列同源，因而能扩增 BvS基因。所述可以扩增的基因必须位于不影响BvS基因表达的位置。转化应使得所述构建体同源整合到该原代细胞的基因组中，以便限定可以扩增的区域。。含有该构建体的原代细胞然后可以借助所述可以扩增的基因或该构建体中存在 的其它标记物来进行选择。标记基因的存在可以确认该构建体在宿主基因组中的存在和整 合。不需要再对原代细胞进行其它选择，因为可以在第二宿主中进行选择。需要时，同源重 组事件的发生可以在进行PCR之后如下确定对所扩增的DNA序列测序，或者当存在来自正 确的同源整合体的DNA时确定PCR片段的合适长度并且仅仅扩增含有这类片段的细胞。另 外，如果需要，可以在这时，通过将适当的扩增试剂(当可以扩增的基因是DHFR时，扩增试 剂是氨甲蝶呤)作用于(stress)所选出的细胞，使这些细胞扩增，从而获得靶基因的多个 拷贝。但优选直到下述第二轮转化之后再进行扩增步骤。上述扩增步骤之后，从所选的原代细胞中分离出具有足以包括完整可扩增区的大 小的基因组DNA部分。然后用这些基因组DNA部分转化第二种哺乳动物表达宿主细胞，对 细胞进行克隆，选出包含可扩增区的克隆。然后，在可扩增区尚未在原代细胞中扩增的情况 下，用扩增试剂使可扩增区扩增。最后，对那些已包含多拷贝可扩增区(含有Bv8)的第二 种表达宿主细胞进行培养，从而表达所述基因并产生所述蛋白。编码Bv8的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库是从据信具有Bv8mRNA并 且以可测得的水平表达BvS的组织制备的。因此，可以从人多重组织制备的cDNA文库中很 方便地得到BvSDNA。也可以从基因组文库或通过寡核苷酸合成来获得编码BvS的基因。文库可以使用为鉴别目的基因或其编码的蛋白而设计的探针(如抗BvS抗体或至 少约20-80个碱基的寡核苷酸)来筛选。用所选探针筛选cDNA或基因组文库可以按照标 准操作进行，如 Sambrook 等在 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (New York : Co Id Spring Harbor Laboratory, 1989)中第10-12章所述方法。另一种分离Bv8编码基因的方 法，是使用Sambrook等(出处同上)第14章所述的PCR方法。分离BvScDNA的优选方法是，使用精心选出的寡核苷酸序列筛选来自各种 人组织的cDNA文库。选作探针的寡核苷酸序列应当具有足够的长度并且足够明确 (unambiguous)，以便使假阳性出现机率最小。优选的序列是从本文所述天然BvS获得的。寡核苷酸必须带有标记，使其能通过与正在筛选的文库中的DNA杂交而被检测。 优选的标记方法是如本领域所公知的那样，用32P-标记的ATP和多核苷酸激酶使寡核苷酸 带上放射性标记。也可以使用其它方法标记寡核苷酸，包括但不限于，生物素标记或酶标 记。可以将编码BvS的核酸(如cDNA或基因组DNA)插入复制载体以便进一步克隆 (扩增该DNA)或进行表达。可以使用的载体有很多。载体组分通常包括，但不限于，以下一 或多项信号序列，复制起点，一或多个标记基因，增强子元件，启动子，以及转录终止序列。本发明的BvS不仅可以直接重组制备，还可以制备成与异源多肽融合的多肽，所 述异源多肽优选信号序列或在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特异性切割位点的其它多 肽。通常，信号序列可以是载体的组分，或者是插入该载体的BvSDNA的一部分。所选的异源 信号序列优选是能被宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的信号序列。对于不能识 别并加工天然BvS信号序列的原核宿主细胞来说，可以将信号序列替换为选自下组的原核 信号序列碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或热稳定肠毒素II前导序列。为了进 酵母分泌， 可以将天然信号序列替换为，例如，酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括糖酵母α因子前导序列和1991年4月23日授权的美国专利5，010, 182所述的克鲁维酵母α因子 前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导序列(EP 362，179，公 开于1990年4月4日)，或于1990年11月15日公开的WO 90/13646描述的信号。在哺 乳动物细胞表达中，天然信号序列(如通常在体内指导BvS从人的细胞中分泌的BvS前序 列)可以满足要求，但其它哺乳动物信号序列也是适合的，如来自其它动物BvS多肽的信号 序列，来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒的分泌前导序列，如单纯疱疹 病毒gD信号。可以将所述前体区域的DNA与编码成熟BvS或其可溶性变体的DNA连接在同一个 阅读框内。表达载体和克隆载体都包含能使该载体在一或多种选定的宿主细胞中复制的核 酸序列。一般情况下，在克隆载体中，这种序列是能使该载体独立于宿主染色体DNA而复制 的序列，包括复制起点或自我复制序列。这样的序列在各种细菌、酵母和病毒中都是众所周 知的。质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌，2 μ质粒起点适合酵母菌，多种 病毒起点(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆 载体。复制起点组分一般不是哺乳动物表达载体所必需的(SV40起点的使用通常仅仅是由 于其包含早期启动子)。大多数表达载体都是“穿梭”载体，即它们能在至少一类生物中复制但可以转移到 另一生物中进行表达。例如，可以在大肠杆菌中克隆出载体，然后将该载体转移到酵母或哺 乳动物细胞中进行表达，即使它不能独立于宿主细胞染色体而复制也无所谓。DNA也可以通过插入宿主基因组而扩增。这可以利用芽孢杆菌作为宿主，通过，例 如在该载体中包含与芽孢杆菌基因组DNA中找到的序列互补的DNA序列而很容易地实现。 用该载体转化芽孢杆菌导致基因组与BvSDNA插入片段之间发生同源重组。但编码BvS的 基因组DNA的回收比外源复制载体的回收更复杂，因为必需用限制酶消化BvSDNA。表达载体和克隆载体应该包含选择基因，也称选择标记。该基因编码使经过转化 的宿主细胞在选择性培养基中存活或生长所必需的蛋白。没有被包含该选择基因的载体 转化的宿主细胞在所述选择性培养基中不能存活。典型的选择基因编码具有以下性质的 蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四环素)的抗性， (b)弥补营养缺陷，或(c)提供复合培养基不能供给的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙 氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个实例是利用药物限制(arrest)宿主细胞的生长。那些被异源基 因成功转化的细胞产生一种赋予药物抗性的蛋白，从而在该选择环境中存活。这种显性选 择可以采用的药物有新霉素，霉酚酸和潮霉素。适合于哺乳动物细胞的另一例选择标记是允许鉴定能摄取BvS核酸的细胞的那 些，如DHFR或胸苷激酶。可以将哺乳动物细胞转化体置于仅有转化体能通过摄取该标记物 而存活的选择压力下。选择压力通过将转化体培养在具有连续变化的选择试剂浓度的培养 基中来实施，所述连续变化的浓度导致选择基因和编码BvS的DNA都被扩增。扩增是指，对 生长十分关键的那些蛋白的生产所重点需要的基因在连续数代重组细胞的染色体中被不 断复制(reiterated in tandem)的过程。扩增的DNA不断地合成Bv8。扩增基因的其它实 例包括金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。一种优选的载体系统可参见美国专利5，561，053。例如，用DHFR选择基因转化的细胞首先通过将所有转化体培养在包含氨甲蝶呤 (Mtx，为DHFR的一种竞争型拮抗剂)的培养基中来进行鉴定。当采用野生型DHFR时，合适 的宿主细胞包括DHFR活性有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其制备和增殖参见Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216 (1980)。然后将经过转化的细胞暴露于浓度渐增的 氨甲蝶呤。这导致合成多拷贝的DHFR基因，同时还合成多拷贝的包含在所述表达载体中的 其它DNA，如编码BvS的DNA。当采用Mtx高抗性DHFR突变基因时，这种扩增技术可以使用 其它合适的宿主细胞，如ATCC CCL61 CHO-Kl，尽管它存在内源DHFR(EP 117,060)。或者，宿主细胞(尤其包含内源DHFR的野生型宿主)被编码BvS的DNA序列，野生 型DHFR蛋白，以及另一种选择标记如氨基糖苷3’ -磷酸转移酶(APH)转化或共转化以后， 可以通过在含有针对该选择标记的选择试剂如氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素，新霉素或 G418)的培养基中培养细胞来进行选择。参见美国专利4，965，199。适用于酵母的合适选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb 等，Nature, 282 :39(1979))。Trpl基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株(例如ATCC 44076 或 PEP4-1)提供了选择标记(Jones, Genetics，85 :12 (1977))。此后，酵母宿主细 胞基因组中trpl损伤的存在提供了通过在缺乏色氨酸的条件中生长而检测转化的有效环 境。类似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)可以由携带Leu2基因的已 知质粒来互补。此外，源自1. 6 μ m环状质粒pKDl的载体可以用于转化克鲁维酵母(Kluyveromyces)。 Bianchi 等，Curr. Genet. ,12 185 (1987)。 最近，Van den Berg, Bio/Technology, 8 135(1990)报道了一种用于在乳克鲁维酵母(K. Iactis)中大规模制备重组小牛凝乳酶的 表达系统。还有人公开了用于通过克鲁维酵母工业菌株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳 定、多拷贝表达载体。Fleer 等，Bio/Technology, 9 :968_975 (1991)。表达载体和克隆载体通常包含能被宿主生物识别的启动子，它与BvS核酸可操作 相连。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(5’，一般相距不超过大约IOO-IOOObp) 的非翻译序列，它控制着与之可操作相连的具体核酸序列，如BvS核酸序列的转录和翻译。 这种启动子通常分为诱导型和组成型这两类。诱导型启动子，当培养条件发生一些改变，例 如存在或缺乏某种营养，或者温度改变时，应答这样的改变而使受其控制的DNA的转录水 平升高的那些启动子。迄今为止，由不同的宿主细胞识别的非常多种启动子已为本领域熟 知。通过限制酶消化而从来源DNA取出启动子，并将分离的启动子序列插入载体，从而将这 些启动子与编码BvS的DNA可操作相连。天然BvS启动子序列和多种异源启动子都可以用 于指导BvSDNA的扩增和/或表达。但优选异源启动子，因为它们与天然BvS启动子相比， 通过能引起BvS的更强转录并获得更高的产量。适用于原核宿主的启动子，包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等， Nature, 275 615(1978) ；Goeddel 等，Nature, 281 :544 (1979))，碱性磷酸酶，色氨酸(trp) 启动子系统(Goeddel，Nucleic acids Res.，8 :4057 (1980) ；EP36776)，和杂化启动子如 tac 启动子。deBoer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 :21_25(1983)。也可以使用其它已知 的细菌启动子。它们的核苷酸序列已经公开，因此本领域技术人员可以利用接头或衔接子 来提供任何所需的限制性位点，将已知启动子与编码BvS的DNA可操作相连(Siebenlist等，Cell，20 =269(1980)) 0适用于细菌系统的启动子还可以包含与编码Bv8的DNA可操作 相连的 Shine-Dalgamo (S. D.)序列。真核生物的启动子序列也是已知的。几乎所有的真核基因在转录起始点上游约 25-30个碱基处具有AT-富集区。很多基因在其转录起始点上游70-80个碱基处有另一种 序列CXCAAT，其中X可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以 作为一种信号用于将poly-Α尾添加到编码序列3’端。所有这些序列都适合于插入真核表 达载体中。适用于酵母宿主的启动序列的实例包括:3_磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J. Biol. Chem.，255 2073 (1980))或其它糖酵解酶(Hess 等，J. Adv. EnzymeReg.，7 149 (1968)； Holland, Biochemistry, 17 =4900(1978))的启动子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油 醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖_6磷酸异构酶，3-磷酸 甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。其它的酵母启动子，即那些还具有由生长条件控制转录的优点的诱导型启动子， 是下述基因的启动子区醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、 金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73，657中进 一步描述了适用于酵母表达系统的载体和启动子。酵母增强子与酵母启动子联合使用也是 有利的。在哺乳动物宿主细胞中，从载体转录BvS可以受启动子调控，所述启动子例如来 自病毒基因组，如多形瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如 腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒 40(SV40)的启动子，或者来自异源哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启 动子等，来自热休克启动子，以及来自通常与BvS序列相连的启动子，前提是这些启动子与 宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可以作为还包含SV40病毒复制起点的SV40限 制性片段而方便地获得。Fiers 等，Nature，273 :113 (1978) ；Mulligan 等，Science, 209 1422-1427 (1980) ；Pavlalcis 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 :7398_7402 (1981)。人巨 细胞病毒的即早期启动子可以作为Hind III E限制性片段方便地获得。Greenaway等， Gene, 18 :355_360 (1982)。美国专利4，419，446中公开了在哺乳动物宿主中用牛乳头瘤病 毒作为载体来表达DNA的系统。美国专利4，601，978中叙述了对这个系统改进。另见Gray 等，Nature，295 =503-508(1982)中关于在猴细胞中表达编码免疫干扰素的cDNA ；Reyes等， Nature, 297 =598-601(1982)中关于在单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中 表达人 β 干扰素 cDNA ；Canaani 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 5166-5170 (1982)中关 于在培养的小鼠和兔细胞中表达人干扰素β 1基因；以及Gorman等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 6777-6781(1982)关于在CV-I猴肾细胞、鸡胚成纤维细胞、中国仓鼠卵巢细胞、 HeLa细胞和小鼠OTH-3T3细胞中，用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子来表达细菌 CAT序列。编码BvS的DNA在高等真核生物中的转录常常通过将增强子序列插入载体中来 增加。增强子是作用于启动子以增加其转录的DNA顺式作用元件，一般约10 300bp。增 强子相对不太依赖于方向和位置，见于转录单元的5，端(Laimins等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 78 993(1981))和 3，端(Luslcy 等，Mol. Cell Bio.，3 1108 (1983)),内含子内部 (Banerji 等，Cell，33 729(1983)),以及编码序列的内部。Osborne 等，Mol. Cell Bio.，4 1293(1984)。目前已知很多哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛 素)的增强子序列。但通常使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在其复制起始点晚期侧 的SV40增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在其复制起始点晚期侧的多 形瘤增强子，和腺病毒增强子。也可参见Yaniv，Nature，297 17-18 (1982)所述用于活化真 核启动子的增强元件。所述增强子可以剪接插入载体中BvS编码序列的5’或3’侧，但优 选位于启动子的5’侧。用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有 核细胞)的表达载体，还包括对转录终止和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常来自真 核或病毒DNA或cDNA的5’ (偶尔为3’)非翻译区。这些区域包含转录为编码BvS的mRNA 的非翻译区中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。包含上述一或多个组分的合适载体的构建可以利用标准连接技术。分离的质粒或 DNA片段经过切割，修剪(tailored)，并重新连接为所需形式，以便产生所需质粒。为了通过分析来证实所构建的质粒中的正确序列，可用连接混合物转化大肠杆菌 K12菌株294(ATCC 31，446)，并用相应的氨苄青霉素或四环素抗性选择成功的转化子。从 转化子制备质粒，通过限制性内切核酸酶消化来分析，和/或用Messing等，Nucleic Acids Res.，9 309(1981)所述方法或 Maxam 等，Methods in Enzymology, 65 499(1980)所述方 法测序。在BvS和BvS变体的制备中特别有用的是，能在哺乳动物细胞中瞬时表达编码BvS 的DNA的表达载体。通常，瞬时表达涉及应用能在宿主细胞中有效复制的表达载体，从而 该宿主细胞积累所述表达载体的多个拷贝，并合成高水平的由该表达载体所编码的所需多 肽。Sambrook等，出处同上pp. 16. 17-16. 22。包含适宜表达载体及宿主细胞的瞬时表达系 统，允许对克隆化DNA所编码的多肽进行方便地阳性鉴定，还允许快速筛选这些多肽的所 需生物特性或生理特性。因此，瞬时表达系统特别可用于本发明鉴定具有BvS生物活性的 BvS类似物和变体的目的。适应于在重组脊椎动物细胞培养物中合成BvS的其它方法，载体，和宿主细胞 在 Gething 等，Nature, 293 :620_625 (1981) ；Mantei 等，Nature, 281 40-46 (1979) ；EP 117，060 JPEP 117，058中描述。特别可用于BvS的哺乳动物细胞培养表达的质粒是 pRK5 (EP 307,247)或 pSVI6B。WO 91/08291，1991 年 6 月 13 日公开。克隆或表达本文所述载体中DNA的适宜宿主细胞，包括原核生物、酵母或高等真 核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如肠杆 菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌(E. coli), 肠杆菌属(Enterobacter)，欧文菌属(Erwinia)，克雷白菌属(Klebsiella)，变形菌杆属 (Proteus)，沙门菌属(Salmonella)(如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium))，沙雷 菌属(Serratia)(如粘质沙雷菌(Serratia marcescans))和志贺菌属(Shigella)等，以及 芽孢杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis) (例如1989年4月12日出版的DD 266，710中所述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属 (Pseudomonas)如铜绿菌假单胞菌(P. aeruginosa)，及链霉菌(Str印tomyces)。优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294 (ATCC 31，446)，但其它菌株，如大肠杆菌B，大肠杆菌 X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110 (ATCC 27, 325)也是合适的。这些实例是用于说明， 并非限制。W3110株是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是重组DNA产物发酵常用 的宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌少量蛋白水解酶。例如，可以修饰W3110株以使编码蛋 白的基因中发生遗传突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌W3110株27C7。27C7的完整基因 型是 tonA Δ ptr3 phoA Δ Ε15 Δ (argF-lac) 169ompT Δ degP41kanr。菌株 27C7 已于 1991 年 10月31日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏 号为ATCC 55，244。或者，可以采用1990年8月7日授权的美国专利4，946，783中公开的 具有突变型周质蛋白酶的大肠杆菌株。除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合于BvS编码载体的克隆或 表达宿主。酿酒酵母或常见的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。还有多个其它 属、种和株已有商品供应，并且可以用于本发明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Beach 等，Nature，290 140 (1981) ； 1985 年 5 月 2 日公布的 EP 139,383)；克鲁维酵 母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利4，943，529 ；Fleer等，出处同上)，例如乳克鲁维酵 母(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574 ；Louvencourt 等，J. Bacteriol.，737 (1983))、脆 壁克鲁维酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克曼氏克鲁维酵母(K. wickeramii) (ATCC24, 178)、K. waltii (ATCC 56，500)、 果蝇克鲁维酵母(K. drosophilarum) (ATCC36, 906 ；Van den Berg等，出处同上)、耐热克 鲁维酵母(K. thermotolerans)和马克斯克鲁维氏酵母(K. marxianus)等；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris) (EP 183，070 ;Sreekrishna 等，J.Basic Microbiol. ,28 265-278(1988))；念珠菌 M ；Trichoderma reesia(EP 244，234)；粗 糙链孢霉(Case 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 :5259_5263 (1979))；许旺氏酵母属 (schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis) (1990 年 10 月 31日公布的EP 394, 538)等；和丝状真菌，例如链孢霉属、青霉属、T0lyp0Cladium(1991 年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉属宿主如构巢曲霉(Ballance等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，112 :284_289 (1983) ；Tilburn 等，Gene，26 :205_221 (1983) ；Yelton 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 :1470_1474(1984))和黑曲霉等(Kelly 等，EMBO J. ,4 475-479(1985))。适合于表达糖基化BvS的宿主细胞来自多细胞生物。这样的宿主细胞能将加工 活性和糖基化活性组合在一起。原则上，任何高等真核细胞培养物都是可以的，无论它来 自脊椎动物培养物还是无脊椎动物培养物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细 胞。目前已经从下述宿主中鉴定了大量的杆状病毒株和变体以及相应的容许型昆虫宿主 细胞草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白 纹伊岐(Aedes albopictus,岐子)、Drosophila melanogaster (果蝇)禾口家蚕蛾(Bombyx mori)等。参见，例如 Luckow 等，Bio/Technology,6 47-55(1988) ；Miller 等，在 Genetic Engineering 中，Setlow 等编，Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277—279 ；Maeda 等， Nature, 315 =592-594(1985)。用于转染的各种病毒株可以公开地获得，例如加利福尼亚Y 级夜蛾(Autographa California)NPV的L-I变体和家蚕蛾NPV的Bm_5株，并且这些病毒 可以在此用作本发明的病毒，尤其是用于转染草地夜蛾细胞。
棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿 主。通常，植物细胞通过与事先经过操作而含有Bv8-DNA的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株一起保温来进行转染。在植物细胞培养物与根癌土壤杆菌一起保温期 间，编码BvS的DNA被转移到该植物细胞宿主中，使它被转染，然后在适当的条件下表达编 码BvS的DNA。此外，与植物细胞相容的调节序列和信号序列也是可以获得的，如胭脂氨酸 合成酶启动子和聚腺苷酸化信号序列。D印iclcer等，J.Mol.Appl.Gen.，1 :561(1982)。此 外，从T-DNA 780基因上游区分离的DNA节段能活化或增加含有重组DNA的植物组织中植 物可表达型基因的转录水平。EP 321，196，1989年6月21日公开。然而，关注最多的是脊椎动物细胞，而且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞 已经成为常规方法。参见，例如 Tissue Culture,Academic Press,Kruse and Patterson, 编(1973)。有效哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CVl细胞系(C0S_7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或经过再克隆以便能在悬浮培养物中生长的293细胞， Graham 等，J. Gen Virol. 36 59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵 巢细胞/-DHFR(CH0，Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 77 4216 (1980))；小鼠足细 胞(ΤΜ4，Mather，Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))；猴肾细胞(CVIATCC CCL 70)；非洲绿 猴肾细胞(VER0-76, ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞 OffiLA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)； TRI 细胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 :44_68 (1982)) ；MRC 5 细胞；FS4 细胞；和人肝细胞癌细胞系Ofep G2)。宿主细胞用上述用于制备BvS的表达或克隆载体转染(优选转化)，并在改进型传 统营养培养基上培养，所述培养基经改进已适于诱导启动子、筛选转化体或扩增编码所需 序列的基因。转染是指由宿主细胞摄取表达载体，而不论事实上是否表达了任何编码序列。多 种转染方法是本领域普通技术人员已知的，例如，CaPOjX淀和电穿孔。成功的转染一般在 宿主细胞中出现关于该载体操作的任何征兆时可以予以识别。转化是指，将DNA引入生物体，使DNA能够作为染色体外元件或以染色体整合体 的形式复制。根据所用的宿主细胞，用适合于所述细胞的标准技术进行转化。利用氯化钙 进行钙处理的方法(见Sambrook等，出处同上的1.82章节)或电穿孔常用于包含坚固的 细胞壁屏障的原核细胞或其它细胞。用根癌土壤杆菌进行的感染可以用于转化一些植物细 胞，参见Shaw等，Gene，23 :315 (1983)以及1989年6月29日公开的WO 89/05859。此外， 植物可以用1991年1月10日公开的WO 91/00358中所述的超声处理方法进行转染。对于没有所述细胞壁的哺乳动物细胞，优选Graham等，Virology, 52 456-457(1978)所述的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的综述见1983年8月 16日公布的美国专利4，399，216。酵母转化通常根据Van Solingen等，J. Bact.，130 946 (1977)和 Hsiao 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 3829 (1979)所述方法进行。但也可 使用将DNA引入细胞中的其它方法，如核显微注射、电穿孔、使细菌原生质体与完整无损的 (intact)细胞融合，或聚阳离子如polybrene，聚鸟氨酸等。哺乳动物细胞转化的各种技 术可参见 Keown 等，Methods in Enzymology, 185 :527_537 (1990)和 Mansour 等，Nature,336 348-352(1988)。用于产生BvS多肽的原核细胞在Sambrook等，出处同上所一般性描述的合适培养 基中进行培养。用于产生本发明BvS的真核宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基如 Ham，s FlO(Sigma)，基本必需培养基((MEM) Sigma)，RPMI-1640 (Signma)，和 Dulbecco 改 良Eagle培养基((DMEM)，Sigma)都适于培养所述宿主细胞。此外，Ham and Wallace, Meth. Enz.，58 44 (1979)，Barnes 等，Anal. Biochem.，102 255 (1980)，U. S. 4，767，704 ； 4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；WO 90/03430 ；WO 87/00195 ；U. S. Pat. Re. 30，985所述的任一种培养基也可以用作宿主细胞培养基。任何上述培养基可以根据 需要添加激素和/或其它生长因子(如胰岛素，运铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(如氯 化钠，韩，镁，和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸腺嘧啶)，抗生素(如 Gentamycin )，痕量元素(定义为通常以微摩尔水平的终浓度出现的无机化合物)，和葡萄 糖或等效能源。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需添加物。培养 条件，如温度，PH等，都是前面在选定的表达宿主上用到的那些，并且对本领域技术人员而 言也是显而易见的。通常，使哺乳动物细胞培养物的生产力最大化的原则、方案、以及具体技术可以 参见 Mammalian Cell Biotechnology :aPractical Apprcach, Μ· Butler,编(IRL Press, 1991)。该文献中提到的宿主细胞包括培养的细胞以及宿主动物体内的细胞。基因扩增和/或表达，可以基于本文提供的序列选择适当标记的探针，利用诸如 常规 Southern 印迹、测定 mRNA 转录量的 Northern 印迹(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)或原位杂交，直接在样品中测定。可以采用 各种标记，最常见放射性同位素，尤其是32P。也可以采用其它技术，如用生物素修饰的核苷 酸来引入多核苷酸。该生物素然后可以作为亲和素或抗体的结合位点，后者可以带有各种 标记，如放射性核素，荧光，酶等等。或者，可以使用能够识别特异双链体的抗体，所述双链 体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或者DNA-蛋白双链体。抗体也可以 带有标记，试验在双链体与表面结合之处进行，因此通过在表面形成双链体可以检测与双 链体结合的抗体的存在。或者，基因表达可以通过免疫学方法，如组织切片的免疫组化染色和细胞培养物 或体液的分析来测定，以便直接确定基因产物的表达量。有了免疫组化染色技术，就可以制 备细胞样品(通常通过脱水和固定来制备)，然后将其与特异于所结合的基因产物的标记 抗体反应，所述标记一般是可以目测观察到的，如酶标记，荧光标记，发光标记等。适用于本 发明的一种具体的敏感染色技术可参见Hsu等，Am. J.Clin Path. ,75 :734_738 (1980)。适用于免疫组化染色和/或样品液分析的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗 体，并且可以如本文所述进行制备。BvS优选从培养基中回收，为分泌多肽的形式，也可以从宿主细胞裂解物回收。如 果BvS为膜结合型，可以用合适的去污剂溶液(例如Triton-ΧΙΟΟ)从膜上释放。当BvS是在重组细胞中产生而不是从人源产生时，该BvS完全不含人源蛋白或多 肽。但必需从重组细胞蛋白或多肽纯化Bv8，以获得本质上均一的BvS制剂。第一步，可以使培养基或裂解物离心以除去微粒状细胞残渣。然后用以下举例说明的适宜纯化方法， 从污染的可溶性蛋白和多肽中纯化出BvS 在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相 HPLC ；硅层析；层析聚焦；免疫亲和；表位_标签结合树脂；SDS-PAGE ；硫酸铵沉淀；使用例 如S印hadex G-75进行凝胶过滤；和蛋白A Sepharose柱以除去污染物如IgG。3.修饰 Bv8本发明包括BvS和BvS变体的共价修饰。一种共价修饰形式包括使BvS多肽的靶 氨基酸残基与能与该BvS的选定侧链或N-或C-末端残基发生反应的有机衍化剂进行反 应。用双功能剂进行的衍化可以用于，例如，使BvS与水溶性支持物基质或表面发生交联， 以便在纯化抗-BvS抗体的方法中使用，反之亦然。常用的交联剂包括，例如，1，1_双(二偶 氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟琥珀酰亚胺酯，如与4-叠氮基水杨酸的酯，同型双功 能酰亚胺酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3，3' -二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、双功能马 来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷和试剂如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫]丙炔 亚胺酯。其它修饰包括，谷氨酰胺基和天冬酰胺基分别脱酰胺成为相应的谷氨酰基和天 冬氨酰基，脯氨酸和赖氨酸羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和 组氨酸侧链的 α -氨基甲基化(Τ· E. Creighton，Proteins :Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman&Co.，San Francisco, pp. 79-86 (1983))，N-末端胺的乙酰化，以 及任何C-末端羧基的酰胺化。本发明还包括BvS多肽的另一类共价修饰，所述共价修饰包括改变多肽的天然糖 基化模式。“改变天然糖基化模式”为本文目的是指，删除天然序列BvS中一个或多个糖组 分(方法是除去潜在的糖基化位点或利用化学和/或酶手段消除糖基化)，和/或添加一或 多个在天然序列BvS中本不存在的糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白糖基化中的性 质变化，它涉及不同糖组分在性质和比例上的变化。在BvS多肽中添加糖基化位点还可以通过改变氨基酸序列来现。所述改变可以 是，例如，向天然序列BvS中添加、或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对0-连接糖基化 位点而言)。任选地，可以通过DNA水平的变化，特别是通过使编码BvS多肽的DNA中的预 定碱基发生突变从而产生出翻译所需氨基酸的密码子，来改变BvS的氨基酸序列。另一种增加BvS多肽上糖组分数目的方法是，将配糖体(glycolside)通过化 学处理或酶处理而与所述多肽偶联。这类方法可参见，例如1987年9月11日公布的WO 87/05330，以及 Aplin 和 Wriston，CRC Crit. Rev. Biochem.第 259-306 页(1981)。BvS多肽中糖组分的去除可以通过化学处理或酶处理来实现，或者通过使编码 糖基化靶点的氨基酸残基的密码子发生突变性取代来实现。化学脱糖基化技术为本领域 所公知，例如参见 Hakimuddin 等，Arch. Biochem. Biophys.，259 52 (1987)和 Edge 等， Anal. Biochem.，118 :131(1981)。多肽上糖组分的酶切除可以利用Thotakura等，Meth. Enzymol.，138 350 (1987)所述的各种内-和外-糖苷酶来实现。Bv8的另一类共价修饰包括，按照美国专利4, 640,835,4, 496,689 ；4, 301, 144、 4，670，417 ；4, 791, 192或4，179，337所述方式，将Bv8多肽连接与诸如聚乙二醇(PEG)、聚 丙二醇或聚氧化烯等各种非蛋白聚合物之一连接。本发明BvS也可被修饰成嵌合分子，其中包含与另一异源多肽或氨基酸序列融合的 Bv80在一个实施方案中，所述嵌合分子包含BvS与标签多肽所形成的融合体，该 标签多肽提供抗-标签抗体可以选择性结合的表位。表位标签一般位于BvS的氨 基_或羧基_末端。BvS的这类表位-标记形式的存在可以使用抗标签多肽的抗体来 检测。另外，提供表位标签，使BvS能利用抗-标签抗体或另一类与该表位标签结合 的亲和基质容易地进行亲和纯化。各种标签多肽及其各自的抗体是本领域众所周知 的。实例包括聚-组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签； flue HA 标签多肽及其抗体 12CA5 (Field 等，Mol. Cell. Biol.，8 :2159_2165 (1988))； c-myc 标签以及针对它的 8F9、3C7、6E10、G4、B7 禾Π 9Ε10 抗体(Evan 等，Molecular and Cellular Biology，5 :3610_3616 (1985))；单纯疱疹病毒糖蛋白 D (gD)标签及其 抗体(Paborsky 等，Protein Engineering, 3 (6) :547_553 (1990))。其它标签多肽包 括 Flag-肽(Hopp 等，BioTechnology, 6 12041210 (1988)) ；KT3 表位肽(Martin 等， Science, 255 192-194 (1992)) ；α-微管蛋白表位肽(Skinner 等，J. Biol. Chem.，266 15163-15166(1991))；和 T7 基因 10 蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 6393-6397(1990))。在另一实施方案中，嵌合分子可包括BvS与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的 融合。对于二价形式的嵌合分子(也称“免疫粘附素”)而言，所述融合可以是与IgG分子 的Fc区融合。最简单和最直接的免疫粘附素设计是将“粘附素”蛋白的结合区与免疫球蛋白重 链的铰链区和Fc区结合。通常，制备本发明所用的BvS-免疫球蛋白嵌合体时，将编码BvS 的核酸在C末端与编码免疫球蛋白恒定区序列的N末端融合，也可以进行N末端融合。通常在此融合中，编码的嵌合多肽至少保留免疫球蛋白重链恒定区的功能活性铰 链区、CH2和CH3区。还可以与恒定区的Fc区的C末端或者紧邻重链CHl的N-末端处或 轻链的相应区域进行融合。进行所述融合的确切位点并不重要；具体位点是众所周知的，并且为了使BvS-免 疫球蛋白嵌合体的生物活性最佳，可以对这些位点进行选择。在一些实施方案中，BvS-免疫球蛋白嵌合体被组装成单体，或者异型或同型多聚 体，尤其二聚体或四聚体，基本上如WO 91/08298所述。在优选实施方案中，BvS序列与抗体C末端区(尤其Fc区)的N末端融合，所述 C末端区具有免疫球蛋白，例如免疫球蛋白Gl(IgGl)的效应功能。可以将整个重链恒定区 与BvS序列融合。然而，更优选在融合中应用起始于铰链区中正好在木瓜蛋白酶切割位点 (它从化学上限定IgG Fc ；以重链恒定区的第一个残基为114时的残基216，或其它免疫球 蛋白的类似位点)上游的序列。在具体优选实施方案中，BvS氨基酸序列与IgGl，IgG2，或 IgG3重链的铰链区和CH2和CH3，或与CH1、铰链、CH2和CH3区融合。融合的确切位点并非 关键，最佳位点可以通过常规实验来确定。 在一些实施方案中，所述免疫粘附素被组装为多聚体，尤其是同型_ 二聚体或_四 聚体。通常，这些组装好的免疫球蛋白具有已知的单元结构。可以形成一种基本的四链结 构单元，其中有IgG、IgD和IgE。四-单元在较高分子量免疫球蛋白中重复；IgM —般以通 过二硫键维持的基本四-单元的五聚体形式存在。IgA球蛋白，偶尔也包括IgG球蛋白，在血清中也以多聚体的形式存在。在多聚体的情况中，每个四-单元可以相同或不同。或者，可将BvS序列插入免疫球蛋白重链和轻链序列之间，以得到含有嵌合重链 的免疫球蛋白。在这个实施方案中，将BvS序列与免疫球蛋白每个臂中的重链3’末端融合， 可以是在铰链和CH2区之间或在CH2和CH3区之间。类似的构建体可参见Hoogenboom等， Mol. Immunol. ,28 1027-1037 (1991)的报道。尽管本发明的免疫粘附素不需要免疫球蛋白轻链的存在，但也可使免疫球蛋白轻 链与BvS-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合，或直接与BvS融合。在前一种情况中，编 码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码BvS-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。通 过分泌，杂合重链和轻链共价结合，从而提供一种免疫球蛋白_样结构，它含有两个二硫 键连接的免疫球蛋白重链-轻链对。适合制备此类结构的方法可以参见，例如美国专利 4,816, 567 (1989 年 3 月 28 日授权)。在一优选实施方案中，用于构建本发明免疫粘附素的免疫球蛋白序列来自IgG免 疫球蛋白重链恒定区。对人免疫粘附素而言，优选使用人IgGl和IgG3免疫球蛋白序列。使 用IgGl的主要好处是，IgGl免疫粘附素可以在固相蛋白A上有效纯化。IgG3的纯化需要 蛋白G，这是一种远不及蛋白A常用的介质。然而，当选择具体免疫粘附素构建体的Ig融合 配对物时，应该考虑免疫球蛋白的其它结构和功能特性。例如，IgG3铰链较长且较易弯曲 (flexible)，因此它与可以适应较大的粘附素结构域，这样的结构域在与IgGl融合时可能 不能正确折叠或发挥功能。另一考虑是化合价；IgG免疫粘附素都是二价同型二聚体，而Ig 亚型象IgA和IgM分别可产生基本Ig同型二具体单元的二聚体或五聚体结构。对那些为 体内应用而设计的BvS免疫粘附素而言，由Fc区决定的药代动力学特性和效应功能也是重 要的。尽管IgGl，IgG2和IgG4都具有21天的体内半衰期，但它们激活补体系统的潜力是 不同的。IgG4不激活补体，IgG2的补体激活能力显著弱于IgGl0而且，与IgGl不同，IgG2 不结合单核细胞或中性粒细胞表面的Fc受体。IgG3对于补体激活而言是最佳的，但其体内 半寿期仅为其它IgG同种型的约三分之一。对设计用于人治疗的免疫粘附素而言，另一个 重点考虑是具体同种型的同种异型(allotypic)变体的数量。一般优选具有较少的血清学 限定性同种异型的IgG同种型。例如，IgGl仅具有四个血清学限定性同种异型位点，其中 两个(Glm和2)位于Fc区中；其中的Glml不具有免疫原性。而IgG3中有12个血清学限 定性同种异型，它们都位于Fc区中；其中仅3个位点(G3m5，ll和21)具有一种非免疫原性 同种异型。因此，Y 3免疫粘附素的潜在免疫原性大于Yl免疫粘附素的。对亲本免疫球蛋白而言，一个有效连接点是紧靠铰链区胱氨酸上游之处，它形成 两条重链之间的二硫键。在常用的设计中，将该分子BvS部分的C-末端残基的密码子置于 紧靠IgGl铰链区序列DKTHTCPPCP的密码子上游之处。适于构建和表达免疫粘附素的一般方法与上文中涉及BvS的方法相同。BvS免疫 粘附素最方便的构建方法是，将编码BvS部分的cDNA序列与Ig cDNA序列融合在同一阅 读框内。也可以与基因组Ig片段融合(参见，例如Gascoigne等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 2936-2940(1987) ；Aruffo 等，Cell，61 1303-1313 (1990) ；Stamenkovic 等，Cell， 66:1133-1144(1991))。后一种融合形式需要表达调节序列的存在。编码IgG重链恒定区 的cDNA，可以根据已公开的序列，从衍生自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库中，通过杂交 或通过聚合酶链反应(PCR)技术分离。将编码BvS的cDNA以及免疫粘附素的Ig部分串联插入能在所选宿主细胞中指导有效表达的质粒载体中。为了在哺乳动物细胞中表达，可以 采用基于 PRK5 的载体(Schall 等，Cell, 61 361-370 (1990))和基于 CDM8 的载体(Seed, Nature, 329 840 (1989))。可以利用寡核苷酸定向缺失诱变，除去所设计的连接密码子之间 的额外序列，来创建真正的连接(Zoller 等，Nucleic Acids Res. ,10 =6487(1982) ；Capon 等，NatUre，337 :525-531 (1989))。可以使用合成寡核苷酸，其中每一半与所需连接的任一 侧的序列互补；理想条件下，它们是36体-48体。或者，可以通过PCR用合适的载体将该分 子的两部分连接在同一阅读框中。对表达BvS免疫粘附素的宿主细胞系的选择主要取决于表达载体。另一个考虑 是需要的蛋白量。毫克量常常可以通过瞬时转染来产生。例如，经腺病毒EIA-转化的293 人胚肾细胞系可以用基于PRK5的载体通过改良的磷酸钙方法进行瞬时转染，从而有效表 达免疫粘附素。基于CDM8的载体可以用于通过DEAE-葡聚糖法转染COS细胞(ArufTo等， Cell, 61 1303-1313(1990) ；Zettmeissl 等，DNA Cell Biol. US，9 :347_353 (1990))。当希 望获得大量蛋白时，可以在稳定转染宿主细胞系之后表达免疫粘附素。例如，可以将基于 PRIC5的载体在存在编码二氢叶酸还原酶(DHFR)并赋于G418抗性的附加质粒的情况下引 入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在培养中选出G418抗性克隆；在有水平不断增加的DHFR抑制 剂氨甲蝶呤存在的情况下培养这些克隆；选出编码DHFR的基因拷贝和免疫粘附素序列的 数量一起被扩增的那些克隆。当免疫粘附素在其N-端包含疏水前导序列时，它倾向于被转 染细胞加工并分泌。具有更复杂结构的免疫粘附素的表达可能需要唯一匹配的宿主细胞； 例如，象轻链或J链等组分可以由特定的骨髓瘤或杂交瘤细胞宿主来提供(Gascoigne等， 1987，出处同上，Martin 等，J. Virol.，67 :3561_3568 (1993))。免疫粘附素可以通过亲和层析方便地进行纯化。蛋白A作为亲和配体的合适性取 决于嵌合体中所用的免疫球蛋白Fc区的类别和同种型。蛋白A可以用于纯化那些基于人 Y 1, Y 2，或 Y 4 重链的免疫粘附素(Lindmark 等，J. Immunol. Meth.，62 1-13 (1983))。蛋 白G被推荐用于小鼠的所有同种型和人的Y3(Guss等，EMBO J.，5 :1567_1575 (1986))。亲 和配体所附着的基质最常见琼脂糖，也可以用其它基质。机械稳定型基质如控制孔径的玻 璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯与琼脂糖相比能允许较快的流速和较短的处理时间。使免疫粘 附素与蛋白A或蛋白G亲和柱结合所需的条件完全取决于Fc区的特性；即，其类别和同种 型。一般而言，当选择了正确的配体时，在未经培养的培养液中可以直接产生有效结合。免 疫粘附素的区别特征之一是，对于人Y 1分子而言，与蛋白A结合的能力相对于具有相同Fc 型别的抗体而言在一定程度上减弱。结合的免疫粘附素可以在酸性PH(3. O或更高)或在 含有离液序列适中的盐的PH缓冲液中有效洗脱。这种亲和层析步骤可以获得> 95%纯的 免疫粘附素制剂。可以用本领域已知的其它方法替代，或补充在蛋白A或G上进行的亲和层析， 来纯化免疫粘附素。免疫粘附素的行为在嗜硫凝胶层析(Hutchens等，Anal. Biochem.， 159 217-226(1986))和固相金属螯合层析(Al-Mashikhi 等，J. Dairy Sci. ,71 1756-1763(1988))中与抗体类似。但与抗体相反，它们在离子交换柱上的行为不仅取决于 它们的等电点，还取决于它们的嵌合特性所导致的分子中的偶极电荷(charge dipole)。需要时，可以制备双特异性免疫粘附素。因此，本发明的免疫粘附素可以将BvS 区与另一区，如来自另一种生长因子的区组合。对于双特异性分子而言，由一条臂上的嵌合抗体重链和另一条臂上的嵌合抗体重链_轻链对组成的具有它们的抗体_样结构的三 聚体分子是有利的，因为它们易于纯化。常规用于生产双特异性免疫粘附素的抗体_生成 quadroma可以产生十种四聚体的混合物，与它相反，用编码三聚体免疫粘附素的三条链的 核酸转染的细胞仅仅产生三种分子的混合物，从该混合物中纯化所需产物要相对较容易。4.制备并鉴定Bv8活件的调节物本发明还涉及筛选化合物以便鉴定那些能模拟或增强BvS的一或多种生物活性 (激动剂)或阻止BvS的效应(拮抗剂)的方法。BvS激动剂和拮抗剂也称BvS调节物。 针对拮抗剂药物候选物的筛选试验经过设计，可以鉴定出与BvS多肽结合或与之形成复合 物，或者干扰BvS与其它细胞蛋白相互作用的化合物。a.小分子筛诜小分子可以具有作为BvS激动剂或拮抗剂的能力并因此具有治疗价值。这样的小 分子可以包括天然小分子，合成的有机或无机化合物和肽。但本发明的小分子不限于这些 形式。市场上已有广泛多种小分子文库，本领域也已知广泛多种筛选具有所需活性的小分 子的试验。候选的BvS激动剂或拮抗剂小分子优选首先在允许快速鉴定BvS活性的潜在调节 物的试验中予以鉴定。这类试验的一个实例是蛋白-蛋白结合试验，其中检测候选分子与 BvS受体结合的能力。在另一实例中，检测候选分子干扰BvS与BvS受体结合的能力。在优选实施方案中，小分子BvS激动剂通过它们模拟BvS的一或多种生物活性的 能力来鉴定。例如，筛选小分子的以下能力诱导内皮细胞增殖，促进内皮细胞存活，如下文 中实施例2和3所述，或诱导血管生成，如下文中实施例4所述。在另一实施方案中，小分子BvS拮抗剂通过它们抑制BvS的一或多种生物活性的 能力来鉴定。为此，将候选化合物与BvS接触。然后评估BvS的生物活性。在一个实施方 案中，测量了 BvS刺激内皮细胞增殖的能力，如实施例2所述。在另一实施方案中，测量了 BvS促进内皮细胞存活的能力，如实施例3所述。一种化合物当能抑制BvS的生物活性时被 鉴定为拮抗剂。鉴定为BvS激动剂或拮抗剂的化合物可以应用在本发明的方法中。例如，BvS拮 抗剂可以用于治疗癌症。b.制备和鉴定激动剂抗体能模拟BvS生物学特性的激动剂型的人和非_人多克隆和单克隆抗体(包括 非-人单克隆抗体的人源化形式)也包括在本发明中。这些包括抗体的氨基酸序列变体， 糖基化变体和片段。制备这类抗体并筛选激动剂抗体的一般技术是本领域已知的，简述如 下。( )多克隆抗体制备多克隆抗体的方法为本领域已知。多克隆抗体可在哺乳动物中产生，例如，通 过一次或多次注射致免疫剂，如果需要，可加入佐剂。通常，对哺乳动物皮下或腹膜内多次 注射致免疫剂和/或佐剂。将致免疫剂与针对所免疫的哺乳动物具有免疫原性的蛋白(如 血清白蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)进行偶联是有效的。可以使用的佐剂的实例包括弗氏 完全佐剂和MPL-TDM佐剂。(ii)单克隆抗体
单克隆抗体可以使用由Kohler和Milstein，Nature，256 495(1975)首次描述的 杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(美国专利4，816，567)。在杂交瘤方法中，对小鼠或其它适宜宿主动物如仓鼠或猕猴(macaque monkey)按 照进行上文所述免疫，以刺激那些产生或能够产生与免疫所用蛋白特异性结合的抗体的淋 巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外致敏。然后，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞用合适的融合剂， 如聚乙二醇融合，以便形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies principles and Practice,pp.59-103, (Academic Press,1986))。如此制备的杂交瘤细胞可以接种在适宜培养基中培养，所述培养基优选含有一或 多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌 呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)时，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶 呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。优选骨髓瘤细胞是那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生 抗体，并对诸如HAT培养基等类似培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓 瘤系，如由 Salk Institute Cell Distreibution Center, San Diego, California USA提供 的M0PC-21和Μ. C. -11小鼠肿瘤，和由美国典型培养物保藏中心，Rockvilie，Maryland USA 提供的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也有报道称人骨髓瘤以及小鼠-人异质性骨髓瘤细胞系 可用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J. Immunol.，133 3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63Marcel Dekker,Inc. ,New York,1987))。可在含有生长的杂交瘤细胞的培养基中分析抗所述抗原的单克隆抗体的产生。优 选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验， 如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。单克隆抗体的结合亲和力可通过，例如Muson等，Anal. Biochem.，107 220 (1980) 所述Scatchard分析来测定。鉴定出能产生具有所需特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后， 将这些细胞通过有限稀释法进一步克隆并用标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。适于此目的 的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以进行体内生长，为 动物中的腹水肿瘤形式。由这些亚克隆分泌的单克隆抗体可以适当地用常规免疫球蛋白纯化方法从培养 基、腹水或血清中分离，所述方法例如蛋白-A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析 或亲和层析。编码单克隆抗体的DNA可用常规方法很容易的分离和测序(如利用能与编码该单 克隆抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是这类DNA的优选来 源。DNA分离后，可将其插入表达载体中，然后用此表达载体转染宿主细胞，如大肠杆菌细 胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在重组 宿主细胞中合成单克隆抗体。DNA也可以通过，例如，用编码人类重链和轻链恒定区的序列 取代小鼠同源序列来修饰，Morrison 等，Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 81 :6851 (1984))，或 通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价结合来修饰。
37在这种方式中，可以制备出具有本文所述BvS激动剂单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或 “杂合”抗体。嵌合或杂合抗体也可以用合成蛋白质化学中的已知方法在体外制备，包括那些涉 及交联剂的方法。例如，可以用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适 于此目的的合适试剂包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和甲基_4_巯基丁基亚胺酸酯 (mercaptobutyrimidate) 0抗体的重组制备将在下文中详述。(iii)人源化抗体—般情况下，人源化抗体中已导入一或多个源自非人来源的氨基酸残基。这些非 人氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本是 按照 Winter 及其同事(Jones 等，Nature，321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature，332 323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science，239 :1534_1536 (1988))所述，用啮齿类 CDR 或 CDR 序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(Cabilly，出处同上)，其中完整人类可变 区的很少一部分被非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中 CDR残基且可能有部分FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为 达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列 和各种概念性人源化产物来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技 术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机 程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作 用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从共有序 列和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。 总之，CDR残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。详见1992年8月21日提交的美 国专利申请07/934，373，它是1991年6月14日提交的美国申请07/715，272的部分继续申 请。(iv)人的抗体人单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备。人骨髓瘤和小鼠-人异质性骨髓瘤细胞 系用于产生人单克隆抗体的相关报道可参见，例如，Kozbor，J. Immunol. , 133 =3001(1984)； Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63 Marcel Dekker, Inc., New York,1987))。现在可以制备转基因动物(如小鼠)，它经过免疫能在缺乏内源性免疫球蛋白生 成的情况下产生全套人抗体。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突变小鼠中，抗体 重链连接区(Jh)基因的纯合缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。将人胚系免疫球蛋 白基因阵列转移到此胚系突变小鼠中，将导致在抗原攻击的情况下产生人抗体。例如，见 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature, 362 255-258(1993)。Mondez 等(Nature Genetics 15 146-156 (1997))进一步改进了该技术并产生出 命名为“Xenomouse II”的转基因小鼠品系，当其受到抗原攻击时，可产生高亲和性完全人抗体。这是通过将兆碱基人重链和轻链基因座经胚系整合到上述具有内源JH节段缺失的 小鼠中实现的。Xenomouse II具有含约66VH基因，完全D1^P Jh区以及三种不同恒定区(μ， δ和χ )的1020Kb人重链基因座，并具有包含32VK基因，Jk节段和Ck基因的800Kb人κ 基因座。这些小鼠中产生的抗体与人类中所见的抗体在各方面均十分相似，包括基因重排、 组装和所有组成成分。由于内源Jh节段中的缺失阻止鼠基因座中的基因重排，人抗体优先 于内源抗体表达。或者，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，自然348 =552-553(1990))从未免疫 供体的免疫球蛋白可变(V)区基因的所有组成而体外产生人类抗体和抗体片段。依据此技 术，将抗体V区基因与丝状噬菌体(如Μ13或fd)主要或次要衣壳蛋白基因克隆在相同的 阅读框内，并在噬菌体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因 组的单链DNA拷贝，根据抗体的功能特点进行的选择也导致对显示这些性质的抗体的编码 基因进行选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行； 这些综述见 Johnson, Kevin S.禾口 Chiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology 3 :564-571(1993)。可使用V基因节段的多个来源进行噬菌体展示。Clackson等， Nature, 352 =624-628(1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因随机组合小文库中分离出一批 多样的抗-噁唑酮抗体。可基本如Marks等，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1991)，或Griffith 等，EMBO J. 12 725-734(1993)所述，构建未免疫的人类供体的V基因库，并分离针对多种 多样抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以较高速率积累突变(体 细胞超变)。其中一些变化赋于较高亲和力，而展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在随 后的抗原攻击阶段优先复制并分化。这种天然过程可以用已知为“链改组”的技术(Marks 等，Bio/Technol. 10，779-783 [1992])来模仿。在该方法中，通过噬菌体展示而获得的“原 代”人抗体的亲和力可以得到改进，方法是用未免疫供体的V区基因的天然变体所有组成相 继取代重链和轻链V区基因。该技术允许产生具有nM水平的亲和力的抗体和抗体片段。制 备非常大的噬菌体抗体库(也称“所有库的母库”(the mother-of-all library))的策略 在Waterhouse等，Nucl. Acids Res. 21，2265-2266 (1993)中描述，直接从这样的噬菌体大 文库中分离出高亲和力人抗体的技术可参见Griffith等，EMBO J. (1994)，待出版。基因改 组也可以用于从啮齿动物的抗体衍生出人抗体，其中的人抗体具有与起始的啮齿动物抗体 相似的亲和性和特异性。根据该方法(也称“表位印痕(印itope imprinting)”)，通过噬 菌体展示技术获得的啮齿动物抗体重链或轻链V区基因被人V区基因所有组成取代，产生 啮齿动物_人嵌合体。对抗原的选择导致分离出能重建原功能性抗原结合位点的人类可变 区，即表位控制(govern)(决定(imprint))对配对物的选择。当重复该方法以取代余下的 啮齿动物V区时，获得人抗体(见PCT专利申请WO 93/06213，公开于1993年4月1日)。 与啮齿动物的抗体通过CDR移植进行的传统人源化不同，该技术提供彻底的人抗体，其不 具有啮齿动物来源的框架或CDR残基。(ν)双特异性抗体双特异性抗体是具有针对至少两种不同表位的结合特异性的单克隆抗体(优选 人抗体或人源化抗体)。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体 的重组制备是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性 (Millstein and Cuello，Nature，305 :537_539 (1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤(quadroma)产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双 特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量 很低。类似的方法见W093/08829(1993年5月13日公开)和Traunecker等，EMBO J, 10 3655-3659(1991)。依据另一种并且是更优选的方法，可将具有所需结合特异性(抗体_抗原结合位 点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区、CH2及CH3区 的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒 定区(CHl)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码 免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。这使得在使用非等比 的三种多肽链进行构建的实施方案中，能够较灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获 得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义 时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。在该方法的一个优选实施方 案中，所述双特异性抗体由一条臂上的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一 条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称 结构有利于从非必要免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特 异性分子的一半存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于1994年3月3 日公开的W094/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节可以参见，例如Suresh等，Methods in Enzymology, 121 210(1986)。(vi)异源偶联抗体异源偶联抗体由两个共价连接的抗体组成。此种抗体据称例如可以使免疫系统 细胞靶向不需要的细胞(美国专利4，676，80)和用于治疗HIV感染(W0 91/00360和WO 92/200373 ；EP 03089)。异源偶联抗体可以用任何方便的交联方法来制备。适宜的交联剂 为本领域已知，并在美国专利4，676，980中与一些交联技术一起公开。(Vii)抗体片段在一些实施方案中，BvS拮抗剂抗体(包括鼠，人和人源化抗体，以及抗体变体) 是抗体片段。已开发了多种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过对完整抗体 进行蛋白水解消化来衍生(见例如，Morimoto等，J. Biochem. Biojphys. Methods 24: 107-117(1992)和Brennan等，Science 229:81(1985))。然而，这些片段现在可通过重组 宿主细胞直接产生。例如，Fab' -SH片段可从大肠杆菌直接回收并利用化学方法偶联形成 F(ab，)2 片段(Carter 等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。在另一实施方案中，利用 亮氨酸拉链GCN4形成F(ab，)2以便促进F(ab，)2分子的组装。根据另一方法，Fv, Fab或 F(ab' )2片段可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。制备抗体片段的其它技术对于熟练 技术人员而言是显而易见的。(Viii)鉴定激动剂抗体BvS激动剂抗体根据它们的生物活性来鉴定。在一个实施方案中，BvS激动剂抗体 通过它们诱导内皮细胞增殖的能力来鉴定，如实施例2所述。在另一实施方案中，BvS激动 剂抗体通过它们诱导血管生成的能力来鉴定，如实施例4所述。5.筛选与Bv8相互作用的蛋白的试验
适于检测蛋白-蛋白相互作用的任何方法都可以用于鉴定与BvS相互作用的蛋白 或其它分子，包括但不限于跨膜蛋白或细胞内蛋白。在众多可以应用的传统方法中，有免疫 沉淀，利用梯度或层析柱进行交联和共_纯化，来鉴定与BvS相互作用的蛋白。在这样的试 验中，BvS组分可以是全长蛋白，其可溶性衍生物，对应于目的结构域的肽，或含有BvS某一 区域的融合蛋白。可以采用能同时鉴定编码与BvS相互作用的蛋白的基因的方法。这些方法包括， 例如，用标记的BvS或其变体，按照类似于已知对Sgtll文库的抗体探测技术的方式来探测 表达库。一种体内检测蛋白质相互作用的方法，双杂合体系(two-hybrid system)在这里 详细描述作为举例，而非限制。该体系的一种版本已有文献描述(Chien等，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :9578_9582)，并且可以从 Clontech (Palo Alto, CA)购买。简言之，可以利用这样的体系构建编码两种杂合蛋白的质粒其中一种质粒由编 码转录激活蛋白的DNA-结合区的核苷酸与编码Bv8、或其多肽、肽、或融合蛋白的核苷酸序 列融合而组成，另一种质粒作为cDNA文库的一部分、由编码转录激活蛋白的激活区的核苷 酸与编码已重组在该质粒中的未知蛋白的cDNA融合而组成。将DNA-结合区融合质粒和 cDNA文库转化到含有报告基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，所述报告基 因(如HBS或IacZ)的调节区包含所述转录激活剂的结合位点。任何一种杂合蛋白单独都 不能激活该报告基因的转录所述DNA-结合区杂合体不能激活是因为它不能提供激活功 能，所述激活区杂合体不能激活是因为它不能定位到激活剂结合位点。这两种杂合蛋白的 相互作用可以重新组建功能性激活蛋白，并导致报告基因的表达，该表达可以通过测定该 报告基因产物的试验来检测。所述双杂合体系或相关方法学可以用于筛选与“诱饵(bait) ”基因产物相互作用 的蛋白的激活区文库。例如，但并非限制地，可以用BvS作为诱饵基因产物。将总基因组或 cDNA序列与编码激活区的DNA融合。用该文库和编码诱饵BvS基因产物与DNA结合区融合 的杂合体的质粒共转化到酵母报告菌株中，并筛选出表达该报告基因的转化体。例如，但并 非限制地，可以将诱饵BvS基因序列，例如所述基因的开放读框，克隆到载体中，使其与编 码GAL4蛋白的DNA-结合区的DNA融合在一起被翻译。纯化这些菌落，并分离出负责报告 基因表达的文库质粒。然后用DNA测序来鉴定所述文库质粒编码的蛋白。当从一种细胞系中检测出与诱饵BvS基因产物相互作用的蛋白时，可以用本领域 常规实践的方法制备该细胞系的cDNA文库。根据本文所述的具体体系，例如，可以将cDNA 片段插入载体中，使它们与GAL4的转录激活区融合在一起被翻译。该文库可以与诱饵BvS 基因-GAL4融合质粒共转化到含有IacZ基因的酵母菌株中，所述IacZ基因受到含有GAL4 激活序列的启动子驱动。由cDNA编码、与GAL4转录激活区融合、并与诱饵BvS基因产物相 互作用的蛋白可以重新组建活性GAL4蛋白并因此驱动表达。可以用本领域常规方法检测 出驱动表达的菌落。然后从这些菌株纯化出cDNA，将其用于通过本领域常规实践的技术来 制备并分离诱饵BvS基因-相互作用蛋白。a.分析能调节Bv8表达或活性的化合物设计以下试验来鉴定与BvS相互作用(即发生结合)的化合物，干扰BvS与其结 合配对物、关连物(cognate)或受体的相互作用的化合物，以及调节BvS基因表达活性(即调节BvS基因表达水平)或调节机体中BvS水平的化合物。还可以利用能鉴定出与BvS基 因调节序列(如启动子序列)结合、并因此可调节BvS基因表达的化合物的试验。参见，例 如 Platt，K. Α.，1994，J.Biol. Chem. 269 :28558_28562。可以根据本发明进行筛选的化合物包括，但不限于，肽，抗体及其片段，以及其它 有机化合物(例如肽模拟物)，它们可以与BvS或BvS受体结合并模拟由天然配体激发的活 性(即激动剂)或抑制由天然配激发的活性(即拮抗剂)。这类化合物包括但不限于肽，如可溶性肽，包括但不限于随机肽文库的成员；(参 见，例如，Lam, K. S.等，1991，Nature 354 :82_84 ；Houghten, R.等，1991，Nature 354 84-86)，以及由D-和/或L-构型的氨基酸组成的组合型化学衍生分子库的成员，磷肽 (phosphop印tides)(包括但不限于随机或部分变性的直接磷肽库的成员(members of random or partially degenerate, directed phosphopeptide libraries)；参见，例如， Songyang，Ζ.等，1993，Cell72 :767_778)，抗体(包括但不限于多克隆抗体，人源化抗体， 抗_独特型抗体，嵌合抗体或单链抗体，以及FAb，F (abN) 2和FAb表达库片段，及其表位-结 合片段)，还有有机或无机分小子。可以根据本发明进行筛选的其它化合物包括，但不限于，能进入相应细胞(如内 皮细胞)并影响BvS基因表达或影响与BvS介导的途径(例如，通过与涉及基因表达的调 节区或转录因子发生相互作用)有关的一些基因表达的有机小分子；或者，影响或替代BvS 活性或影响或替代与BvS信号传递、分解代谢，或代谢途径有关的一些其它细胞内因子的 活性的化合物。计算机建模和搜索技术允许鉴定能调节BvS表达或活性的化合物或已知化合物 的改进。在鉴定出这样的化合物或组合物后，可以鉴定出活性位点或区域。这样的活性位点 通常是配体结合位点。活性位点可以用本领域已知方法来鉴定，例如从肽的氨基酸序列，从 核酸的核苷酸序列，或从相关化合物或组合物与其天然配体形成的复合物的研究来鉴定。 在后一种情况中，可以用化学方法或X-线晶体成像方法，通过找出该因子(factor)上发现 复合配体之处来找出活性位点。接着，测定活性位点的二维几何结构。这可以通过已知方法(包括测定完整分子 结构的X-线晶体成像)来完成。另一方面，可以用固相或液相NMR来确定一些分子内间距。 任何其它测定结构的实验方法都可以用于获得部分或完整的几何结构。几何结构可以用天 然或人工的复合配体来测量，它可以提高所测定的活性位点结构的精确度。如果测定出不完整或不够精确的结构，可以用基于计算机的数字化建模方法来完 成该结构或提高其精确度。任何可以识别的建模方法都可以使用，包括特异于具体生物大 分子(如蛋白或核酸)的参数化模型，基于计算机化分子运动的分子动力学模型，基于热系 综(thermal ensemble)的统计学机械模型，或组合模型。对大多数类型的模型而言，标准 分子力场(代表原子和基团之间的力)是必需的，且可以选自物理化学中已知的力场。上 述不完整或不够精确的实验结构可以作为用这些建模方法通过计算机获得更精确的完整 结构时的一种限制。最后，通过实验，通过建模，或者通过组合而测定了活性位点(或结合位点)的结 构以后，可以通过搜索含有化合物以及它们分子结构的信息的数据库来鉴定候选的调节性 化合物。这样的搜索可找出具有与测定的活性位点结构相匹配的结构并与限定该活性位点的基团相互作用的化合物。这样的搜索可以是手动的，但优选有计算机辅助。根据该搜索 找出的这些化合物都是BvS活性的潜在调节物。另一方面，可以用这些方法从已知的调节化合物或配体鉴定改进的调节化合物。 可以对已知化合物的组合物进行修饰，修饰的结构效应可以用上述应用于新组合物的实验 方法和计算机建模方法来确定。然后将改变的结构与该化合物的活性位点结构相比较，从 而确定是否匹配得更好或相互作用更好。通过这种方式，可以对组合物中的系统变化，诸如 改变侧链基团所导致的变化进行快速评估，以便获得改进了特异性或活性的修饰型调节化 合物或配体。其它可以根据对BvS活性位点(或结合位点)，以及相关转导和转录因子的鉴定， 来鉴定调节化合物的实验方法和计算机建模方法，都是本领域已知的。分子建模系统实例如CHARMm 和 QUANTA 程序(Polygen Corporation, ffaltham, MA)。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行分子结构的构建，建立模型 图和分析。QUANTA允许交互构建、修饰、观察、以及分析分子相互之间的行为。关于与具体蛋白相互作用的药物的计算机建模综述可以参见多篇文献，如 Rotivinen，等，1988，Acta Pharmaceutical Fennica 97 159-166 ；Ripka，New Scientist 54-57 (June 16，1988) ；McKinalyand Rossmann，1989，Annu.Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29 111-122 ；Perry and DaviesiOSAR !Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989) ；Lewis and Dean，1989 Proc. R. Soc. Lond. 236 :125-140 and 141-162 ；关于核酸组分的模型受体，参见 Askew 等，1989，J. Am. Chem. Soc. Ill :1082_1090。其它用图像和画面描述化学物品的计算机程序可以从诸如 BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada), I^l Jk. Hypercube,Inc. (Cambridge,Ontario)公司获得。尽管这些程序主要是为具体蛋白的特异 性药物应用所设计的，它们也适于设计DNA或RNA区域特异性药物，只要该区域是确定的。上文针对能够改变结合的化合物的设计和制备进行了描述，但也可以在已知化合 物(包括天然产物或合成的化学物质)，以及生物活性物质(包括蛋白)的文库中筛选可以 作为抑制剂或激活剂的化合物。通过本文上述试验鉴定出的化合物可以用于，例如，阐述BvS基因产物的生物功 能。可以将这样的化合物以治疗有效剂量给予患者，以便治疗任一种生理学疾病。治疗有 效剂量是指化合物足以导致任何生物学症状的改善，阻碍(impediment)，预防或改变的量。b.分析与Bv8结合的化合物可以设计一些系统，用于鉴定能与BvS相互作用(如结合)或能模拟Bv8，或能干 扰BvS与关连受体、结合配对物或底物的相互作用的化合物。所鉴定的化合物可以用于，例 如，调节野生型和/或突变的BvS基因产物的活性；阐述BvS的生物功能；在筛选中鉴定那 些能破坏BvS的正常相互作用的化合物；或它们自身可以破坏或激活这类相互作用。用于鉴定与BvS结合，或与BvS关连受体或底物结合的化合物的试验，在原则上涉 及制备BvS与待测化合物的反应混合物，该过程所用的时间和条件足以允许这两种组分相 互作用并结合而形成复合物，该复合物可以从反应混合物中取出和/或检测出。所用的BvS 的类型可以根据筛选试验的目的不同而不同。例如，希望筛选出天然受体的激动剂时，可以 利用全长Bv8，或可溶性截短型Bv8，肽，或包含一或多个BvS结构域与在试验系统中提供便
43利(如，标记，分离所得复合物，等等)的蛋白或多肽的融合蛋白。当希望筛选出与BvS直 接相互作用的化合物时，可以使用对应于BvS的多肽以及含有BvS的融合蛋白。筛选试验可以通过多种方式来进行。例如，一种方法涉及将Bv8，其多肽，肽，或融 合蛋白锚着在固相上，并在反应结束时检测锚着在固相上的BvS/待测化合物复合物。在这 类方法的一个实施方案中，BvS反应试剂可以锚着在固体表面，未锚着的待测化合物可以被 直接或间接标记。在实践中，可以方便地用微滴板作为固相。将锚着组分通过非共价或共价结合作 用而固定。非共价结合可以通过将固体表面简单地包被蛋白溶液并干燥而实现。或者，可 以用特异于待固定蛋白的固相抗体(优选单克隆抗体)将该蛋白锚着到固体表面。所述表 面可以事先制备并贮藏。为了进行试验，将未固定的组分添加到含有锚着组分的包被表面。反应完成后，在 能使所形成的任何复合物仍然固定在固体表面的条件下除去(例如，通过洗涤)未反应的 组分。对锚着在固体表面的复合物的检测可以通过多种方式实现。当上述未固定组分事先 已有标记时，检测出固定在所述表面的标记就表明形成了复合物。当上述未固定组分事先 未被标记时，可以用间接标记物检测锚着在所述表面的复合物；例如，用带有标记的特异于 上述未固定组分的抗体(该抗体本身可以直接标记或用标记的抗-Ig抗体间接标记)。或者，可以在液相中进行反应，使反应产物与未反应的组分分离，并检测复合物； 例如用特异于BvS蛋白，多肽，肽，或融合蛋白或待测化合物的固相抗体来锚着溶液中形成 的任何复合物，以及用对抗可能的复合物中另一组分的特异性标记抗体来检测锚着的复合 物。c.分析那些能干扰Bv8的相互作用的化合物与BvS相互作用的大分子在本节中称为“结合配对物”。这些结合配对物都很倾向 于参与BvS介导的生物途径。因此，希望鉴定干扰或破坏所述结合配对物的相互作用的化 合物，它们可用于调节或增强机体中的BvS活性和/或控制与该活性相关的疾病(或该活 性的缺陷)。用于鉴定能干扰BvS与结合配对物或配对物相互作用的化合物的试验系统，其基 本原则涉及制备含有BvS或其一些变体以及结合配对物的反应混合物，该过程所用的时间 和条件足以允许这两种组分相互作用并结合而形成复合物。为了检验化合物的抑制活性， 所述反应混合物在有和没有该待测化合物的条件下制备。待测化合物可以是最初就包括在 反应混合物中，或者可以是在添加了 BvS和它的结合配对物之后间隔一段时间而加入混合 物中。对照反应混合物在不含待测化合物或含有安慰剂的条件下保温。然后检测BvS与结 合配对物是否形成任何复合物。在对照反应中形成复合物，但在含有待测化合物的反应混 合物中不形成复合物，则表明所述化合物干扰BvS与结合配对物的相互作用。另外，也可以 将在含有待测化合物和正常BvS蛋白的反应混合物中复合物的形成与在含有待测化合物 和BvS突变蛋白的反应混合物中复合物的形成进行比较。当在这些情况中希望鉴定出那些 特异性破坏突变体或突变的BvS而不是正常蛋白的相互作用的化合物时，这种比较是很重 要的。干扰BvS与结合配对物相互作用的化合物的分析可以采用异质(heterogeneous) 形式或同质(homogeneous)形式。异质试验涉及将BvS或者结合配对物锚着在固相上，并在反应结束时检测锚着在固相上的复合物。在同质试验中，整个反应在液相中进行。在每 一种方法中，可以改变反应试剂的添加顺序，以便获得关于待测化合物的不同信息。例如， 通过竞争来干扰相互作用的待测化合物，可以通过在有该待测物质存在的情况下进行反应 来鉴定；即，将待测物质先加入反应混合物中，然后再加入BvS和相互作用结合配对物；或 者将它们同时加入。另外，对已形成的复合物造成破坏的待测化合物，例如具有较高结合常 数因而能替换掉复合物上的一种组分的化合物，可以通过在形成复合物之后将该待测化合 物加入反应混合物中而进行检验。各种形式简述如下。在异质试验系统中，将BvS或者相互作用结合配对物锚着在固体表面，未锚着的 物质被直接或间接标记。在实践中，常常利用微滴板。锚着物质可以通过非共价或共价结 合作用而固定。非共价结合可以简单地通过将固体表面包被BvS或结合配对物溶液并干燥 而实现。或者，可以用特异于待锚着物质的固相抗体将所述物质锚着到固体表面。所述表 面可以事先制备并贮藏。为了进行该试验，在有或无待测化合物的条件下将所固定物质的配对物暴露于包 被表面。反应完成后，除去(例如，通过洗涤)未反应的组分，所形成的任何复合物仍然固 定在固体表面。对锚着在固体表面的复合物的检测可以通过多种方式实现。当未被固定的 物质事先已有标记时，检测出固定在所述表面的标记就表明形成了复合物。当未被固定的 物质事先未被标记时，可以用间接标记物检测锚着在所述表面的复合物；例如，用带有标记 的特异于最初未被固定的物质的抗体(该抗体本身可以直接标记或用标记的抗-Ig抗体间 接标记)。根据反应组分的添加顺序，可以检测出抑制复合物形成或者破坏已形成的复合物 的待测化合物。或者，可以在待测化合物存在或缺乏的条件下在液相中进行反应，使反应产物与 未反应的组分分离，并检测复合物；例如用特异于其中一种结合组分的固相抗体来锚着溶 液中形成的任何复合物，以及用特异于另一种配对物的标记抗体来检测锚着的复合物。同 样，根据液相中反应组分的添加顺序，可以鉴定出抑制复合物形成或者破坏已形成的复合 物的待测化合物。在本发明的另一实施方案中，可以采用同质试验。在该方法中，制备预形成的BvS 与结合配对物的复合物，使其中的BvS或其结合配对物被标记，但该标记所产生的信号由 于形成复合物而消失(参见，例如Rubenstein的美国专利4，109，496，它利用此方法进行免 疫分析)。加入能竞争并替换掉预形成复合物上的一种物质的待测物质，将产生高于背景的 信号。这样就可以鉴定出破坏所述相互作用的待测物质。 在一个具体实施方案中，可以制备BvS融合体用于进行固定。例如，可以用融合载 体(如PGEX-5X-1)将BvS或其肽片段与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合，所用的融合 方式使得在最终的融合蛋白中保留了 BvS的结合活性。可以将结合配对物纯化，并用于产 生单克隆抗体，其利用实践中常规的以及本发明上文中描述的方法。该抗体可以通过本领 域常规实践的方法用放射性同位素125I进行标记。在异质试验中，可以将融合蛋白锚着在 谷胱甘肽_琼脂糖珠上。然后在有或没有待测化合物的情况下，按照允许发生相互作用并 结合的方式，添加相互作用结合配对物。在反应结束时，将未结合的物质洗去，向该系统中 添加标记的单克隆抗体，使之与复合的组分结合。BvS与相互作用结合配对物之间的相互作 用，可以通过测量仍然保持与谷胱甘肽-琼脂糖珠结合的放射活性的量来检测。待测化合物对相互作用的成功抑制可以导致所测量的放射活性降低。或者，在缺乏固体的谷胱甘肽_琼脂糖珠的情况下，可以将GST融合蛋白与相互作 用结合配对物混合在液体中。待测化合物可以在上述物质发生相互作用期间或之后加入。 然后将该混合物添加到谷胱甘肽_琼脂糖珠上，洗去未结合的物质。BvS与结合配对物之 间相互作用受到抑制的程度，可以通过添加标记抗体并测量与珠结合的放射活性来进行检 测。在本发明另一实施方案中，可以用对应于BvS和/或相互作用配对物或结合配对 物(在结合配对物是蛋白的情况中)的结合区的肽片段，代替两种全长蛋白之一或两者，实 施上述相同的技术。可以用本领域常规实践的任意多种方法来鉴定并分离结合位点。这些 方法包括，但不限于，对编码其中一种蛋白的基因进行诱变并在共-免疫沉淀试验中筛选 对结合的破坏。然后可以选出编码复合物中第二种物质的基因中的补偿突变。对编码每种 蛋白的基因进行序列分析，可以揭示对应于蛋白上参与相互结合的区域的突变。或者，可以 用上述方法将一种蛋白锚着在固体表面，使之与其带有标记的结合配对物发生相互作用并 结合，所述配对物已经经过蛋白水解酶(如胰蛋白酶)处理。洗涤后，相对较短的、含有结 合区的标记肽可以保持与固体物质结合，可以将其分离并通过氨基酸测序而鉴定。一旦获 得了编码细胞内结合配对物的基因，可以对短基因节段进行工程化，以便表达所述蛋白的 肽片段，然后检验其结合活性，并进行纯化或合成。可以如上所述将BvS锚着在固体物质上，方法是例如，但并非限制地，制备GST融 合蛋白并使之与谷胱甘肽_琼脂糖珠结合。相互作用结合配对物可以被放射性同位素如35S 标记，并用诸如胰蛋白酶等蛋白水解酶切割。再将切割产物添加到锚着的融合蛋白上，使之 结合。洗去未结合的肽之后，可以用已知方法将标记的结合物质(代表细胞内结合配对物 结合区)洗脱，纯化，并分析其氨基酸序列。如此鉴定出的肽可以通过合成来制备，或者利 用重组DNA技术与适当的有利蛋白融合。6.药物组合物本文所述BvS多肽及其调节物可以以治疗剂的形式应用。本发明的BvS多肽和 BvS调节物可以按照已知方法配制，以便制备药物学有效的组合物，其中将这里的BvS产物 与可药用载体赋形剂混合。BvS的治疗性配制剂可以如下制备将具有所需纯度(优选基本 纯)的抗体与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences, 见上文)混合成冻干剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对暴露在所用剂 量和浓度下的细胞或哺乳动物无毒性。实例包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有 机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；小分子多肽(少于约10个残基)；蛋白，如血清白蛋白，明 胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如 EDTA ；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂，如Tween， Pluronics 或 PEG。用于体内给药的BvS必需是无菌的。这可以通过本领域已知的任何方法，如在冷 冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。BvS可以以冻干形式保存。 治疗性BvS组合物通常置于具有无菌存取口的容器中，例如静脉注射袋或带有能通过皮下 注射针刺穿的塞子的小瓶。
Bv8可以选择与其它生长因子组合或联合给药。例如，它可以与EG-ECGF或VEGF组合。BvS可以与癌症治疗的其它常规疗法一起使用。给药途径与已知方法一致，例如通过静脉，腹腔，大脑内，及肉牛，眼内，动脉内或 损伤内等途径进行注射或输注，局部给药，或通过缓释系统给药。本发明药物组合物的剂量和所需药物浓度将依预想的特定用途而异。决定适宜 剂量或给药途径是普通内科医师完全能够很好胜任的事情。动物实验可以为确定人类 治疗的有效剂量提供可靠的指导。可以按照Mordenti，J. and Chappel 1, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics，，In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi 等编，Pergamon Press, New York 1989，pp. 42-96 中所述原则，来换 算种属间有效剂量的比例(Interspecies scaling)。当希望将BvS多肽以配制剂形式给药且该配制剂具有治疗任何需要给药BvS多肽 的疾病所合适的释放特性时，考虑将BvS多肽或调节物包封在微胶囊中。例如，将纯化的 BvS包封在按照例如凝聚技术或界面聚合技术制备的微胶囊(分别例如羟甲基纤维素或明 胶微胶囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物释放系统(例如脂质体，白蛋白 微球体，微乳剂，纳米颗粒和毫微胶囊)中或在大乳剂中。这类技术公开在Remington' s Pharmaceutical Sciences，16th edition, Osol, A. Ed. (1980)中。可以将Bv8掺入缓释制剂中用于治疗用途。缓释制剂的适当实例包括具有一定形 状的半通透聚合物基质，如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙 基-异丁烯酸酯)(Langer 等，J. Biomed. Mater. Res. , 15 167-277 (1981) ；Langer, Chem. Tech. ,12 =98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利 3773919，EP 58，481)，L-谷 氨酸与Y乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22 :547 (1983))，不可降 解的乙烯乙酸乙酯(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron Depot (由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的 微球体)，以及聚D- (-) -3-羟丁酸(EP 133，988)。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸_羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一 些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化蛋白长时间停留在体内时，它们可能由于暴露 在37°C潮湿环境中而变性或凝聚，导致损失生物活性，且免疫原性可能会改变。可以根据相 关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换 而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的 添加剂、和开发特异性聚合物基质组合物来实现稳定。缓释的BvS组合物也可以包括用脂质体包裹的Bv8。含有BvS的脂质体通过本 领域已知方法来制备(Epstein 等，1985，Proc. Natl. Acid. Sci. 82 3688 ；Hwang 等，1980， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4030 ；DE 3. 218，121A ；EP 52322A ；EP 36676A ；EP 88046A ； EP 143949A ；EP 142641A ；日本专利申请 83-118008 ；美国专利 4，485，045 和 4，544，545 ；EP 102, 324A) 0脂质体通常为小单层(imilamelar)(约200-800人)，其中的脂质含量超过约 30mol. %胆固醇，调整所选比例以便使BvS治疗效果最佳。当局部用药时，BvS适合于与诸如载体和/或佐剂等其它成分组合。对所述其它成 分的特性没有限制，只要它们是生理上可接受的，对于其目的用药是有效的，并且不会降低
47组合物中活性成分的活性。合适的赋形剂的例子包括软膏剂，乳膏，凝胶剂，或悬液，含有或 不含纯化的胶原蛋白。组合物也可浸渗到经皮贴剂(patch)，硬膏剂(plaster)和绷带中， 优选以液体或半液体的形式浸渗。为了获得凝胶配制剂，可以将配制在液体组合物中的BvS与有效量的水溶性多肽 或合成聚合物如PEG混合，以便形成具有适合于局部应用的粘度的凝胶。可以使用的多 糖包括，例如，纤维素衍生物，如醚化的纤维素衍生物，包括烷基纤维素，羟基烷基纤维素， 和烷基羟基烷基纤维素，例如，甲基纤维素，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，羟丙基甲基纤 维素，和羟丙基纤维素；淀粉和分级淀粉；琼脂；藻酸和藻酸盐；阿拉伯胶；支链淀粉；琼脂 糖；角叉藻聚糖；葡聚糖(dextran)；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖； 脱乙酰壳多糖；糖原；葡聚糖(glucan)；和合成性生物聚合物；以及胶，例如黄原胶；瓜尔 豆胶；槐豆荚胶；阿拉伯胶；西黄蓍胶；和刺梧桐树胶；及其衍生物和混合物。本文优选的胶 化剂是对生物学系统为惰性的，无毒的，制备简单的，且不太流动或粘滞的胶化剂，它不会 使承载在其内部的BvS失去稳定性。优选的多糖是醚化的纤维素衍生物，更优选充分鉴定、纯化并在USP中列出的多 糖，例如，甲基纤维素和羟烷基纤维素衍生物，如羟丙基纤维素，羟乙基纤维素和羟丙基甲 基纤维素。本文最优选甲基纤维素。用于凝胶配制的聚乙二醇一般是低分子量和高分子量PEG的混合物，这样能获得 适当的粘度。例如，分子量400-600的PEG与分子量1500的PEG的混合物当以适当比率混 合而获得糊剂(paste)时对该目的是有效的。用于多糖和PEG的术语“水溶性”意在包括胶体溶液和分散液。一般来说，纤维素 衍生物的溶解度可以通过醚基团的取代程度来确定，本文有用的稳定衍生物在纤维素链中 每个脱水葡萄糖单元应具有足够量的这类醚基团以使所述衍生物具有水溶性。醚取代程度 为每个脱水葡萄糖单元上至少0. 35个醚基团一般是足够的。另外，纤维素衍生物可以是碱 金属盐，例如，Li，Na, K，或Cs盐的形式。 当凝胶中使用甲基纤维素时，优选它占该凝胶的约2-5%，更优选约3%，而BvS的 量为每毫升凝胶约300-1000mg。半通透的可植入膜装置可以作为在一些情况下运送药物的有效工具。例如，可以 将分泌Bv8，Bv8变体，BvS嵌合体或BvS激动剂或拮抗剂的细胞被囊化，并将这类装置植入 到患者体内。相应地，本发明还包括预防或治疗癌症的方法，包括将分泌Bv8、或根据具体情 况需要分泌其激动剂或拮抗剂的细胞植入到有需要的患者体内。最后，本发明包括通过在 患者体内植入植入体来预防或治疗癌症的装置，所述植入体包含半透膜，和分泌BvS (或根 据具体情况的需要分泌BvS激动剂或拮抗剂)的细胞，所述细胞包裹在所述膜中，且所述膜 可以透过BvS (或其激动剂或拮抗剂)但不能透过来自患者的对细胞有害的因子。可以将 患者自身的经过转化能回体(ex vivo)产生BvS的细胞直接植入该患者，任选不经过上述 被囊化。将活细胞用膜进行被囊化的方法是本领域普通技术人员很熟悉的，且被囊化细胞 的制备以及将它们植入患者都无需过多的实验就可以实现。含有BvS或BvS激动剂或拮抗剂的药物组合物优选装在合适的容器内。所述容器 优选带有详细说明该药物组合物的相应用途和剂量的说明。本领域技术人员将认识到，依 据治疗方法的不同，这些说明会有不同。
7.治疗方法本文提供的治疗剂可以在多种治疗中使用。所述治疗包括治疗哺乳动物(优选 人)的与产激素的组织或内分泌腺体相关的情况和/或与过度、不想要的或失控的血管生 成相关的情况。在一个方面，BvS或BvS激动剂以有效治疗疾病的剂量给予需要治疗的哺 乳动物。用于给药的BvS可以是多肽或核酸形式。优选，BvS或BvS激动剂用于要求使产 生具体激素的细胞存活或数量增加的情况中。这种情况的实例包括糖尿病。其它情况包括 希望增加生殖器官中细胞(如睾丸中的细胞)的数量或增强其存活的那些疾病。其它情况 包括希望减少新血管形成的那些。这种情况的实例包括肿瘤，如睾丸癌。BvS可以与另一种化合物或组合物联合给药。在一个实施方案中，所述化合物是 VEGF或其激动剂或拮抗剂。可选地，所述化合物为编码多肽(如VEGF)的核酸。在一个实施方案中，诸如由上文第4和第5章节所述筛选试验鉴定出的那些化合 物，可以用于调节BvS活性或表达的水平。具体地，鉴定为BvS激动剂的化合物或能刺激 BvS与其受体结合的化合物，可以用于希望增加BvS活性水平的治疗中。类似地，经鉴定能 增加BvS基因表达的化合物可以用于这类治疗中。优选地，将BvS或其激动剂或拮抗剂给药个体以便治疗与生成激素的组织或内分 泌腺体相关的情况，优选需要减少生成具体激素的细胞的数目、减少细胞增殖或减少血管 生成的情况。例如，本文提供一种调节个体的生育力的方法，它包括将BvS拮抗剂以有效调 节生育力的量给予个体。也可以给药BvS拮抗剂来治疗囊肿(cysts)和其它与生成激素的 组织过度增生有关的情况。类固醇激素依赖性疾病也可以用本发明的组合物和方法进行治疗。这类疾 病包括脂样先天性肾上腺肥大，不育，性成熟(sexual maturation)，雄激素依赖性 肿瘤，性早熟(precocious puberty)，McCune-Albright综合征，先天性肾发育不全 (adrenal-hypoplasia congenital), 氐生Ι/Ι "生 功倉^MilSS (hypogonadotropic hypogonadism)。可以用本文提供的试剂和组合物进行治疗的一种具体情况是癌症，尤其类固醇依 赖性癌症，如雄激素依赖性癌症。本文提供的治疗癌症的优选方法包括，对患有或易患癌症 的个体给药有效治疗该癌症的量的BvS拮抗剂。在一个实施方案中，所述癌症是睾丸的癌症。在另一实施方案中，将BvS拮抗剂与一或多种化疗剂联合给予患者，如在癌症 的治疗中。这里考虑在用化疗剂治疗之前、期间或之后给药BvS以便增强疗效。优选的 化疗剂包括但不限于长春新碱(vincristine)，顺钼(cisplatin)，氨甲蝶呤，3’ -叠氮 (azido)_3，-脱氧胸苷，紫杉醇(taxane) ( TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)和紫杉萜(doxetaxel) ( TAXOTERE , Rh0ne-Poulenc Rorer, Antony, France)和/或蒽环类(anthracycline)抗生素。这类化疗剂的制备和剂量 方案可以按照厂家的说明书所述来确定，或者可以由有经验的医师根据其经验来确定。 这类化疗剂的制备和剂量方案还可以参见Chemotherapy Service Ed. , Μ. C. Perry, ffilliams&ffilkins, Baltimore, MD(1992)。应理解，增加细胞的增殖和抑制细胞的增殖的方法可以在体内或体外进行。在一 些情况中，希望将BvS添加到体外细胞样品中以便刺激特定细胞类型的增殖。经BvS处理的样品然后可以用于筛选试验中或被移植到需要治疗的个体中或动物模型中。有效量的BvS或BvS激动剂或拮抗剂可以根据，例如治疗目的，给药途径，和病人 的情况而用于治疗。因此，临床医师必需根据获得最佳治疗效果的需要来滴定剂量并调整 给药途径。通常，临床医师会持续给药BvS直到获得所需效果。全身治疗的通常日剂量为约 10ng/kg-最多100mg/kg哺乳动物体重/天或更高剂量不等。优选约1 μ g/kg/天-IOmg/ kg/天，这取决于给药途径。应能预计到，不同配制剂可以针对不同的治疗化合物和不同的 疾病有效，针对一种器官或组织进行给药时所必需的方式可以不同于其它器官或组织。另一种建议是，将BvS以能在靶组织中建立有效但不含不当毒性的BvS水平的剂 量来配制并运送到靶位点或组织。该组织内浓度应通过连续输注、缓释、局部应用、植入BvS 表达细胞、或按照经验确定的频率进行注射等方式尽可能地维持。该治疗的进展可以通过 常规试验很容易地监控。用药方案必需根据个体的情况来确定。但在优选实施方案中，BvS或BvS激动剂 或拮抗剂是每天给药，更优选每隔天给药，还更优选一周至少两次给药。治疗优选持续6个 月，更优选持续1个月，还更优选持续至少两周。本领域技术人员将认同，真实的用药方案 必需由临床医师根据个体的情况来确定。编码BvS多肽的核酸可以用于基因治疗。在基因治疗的应用中，将基因引入细胞 以便实现在体内合成对治疗有效的基因产物，例如用于替换缺陷基因基因产物。“基因治 疗”既包括经单次治疗就可获得永久效果的常规基因治疗，也包括基因治疗剂的给药，后者 涉及一次或重复多次施用治疗有效量的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可用作体内阻断特定 基因表达的治疗剂。业已证明，可以将短链反义寡核苷酸运输到细胞中，它们在那里起抑制 剂的作用，该作用不受细胞膜限制其摄取所导致的其较低细胞内浓度。(Zamecnik等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :4143_4146[1986])。可以修饰寡核苷酸以增强其摄取，例如用不带 电荷的基团取代带负电荷的磷酸二酯基团。有多种技术可以用于将核酸引入到活细胞中。所述技术根据是将核酸转移到体 外培养的细胞中，还是转移到目标宿主体内的细胞中而异。适于将核酸转移到哺乳动物 体外细胞中的技术，包括脂质体的使用、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸 钙沉淀法等。目前优选的体内基因转移技术包括，用病毒(通常为逆转录病毒)载体进 行转染和用病毒衣壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等，Trends in Biotechnology 11， 205-210 (1993))。有些情况下，希望提供带有靶向靶细胞的试剂的核酸源，所述物质如对 细胞表面膜蛋白或靶细胞具有特异性的抗体，靶细胞表面受体的配体等。使用脂质体时， 将与参与胞吞的细胞表面膜蛋白结合的蛋白用于靶向和/或促进摄取，例如对特定类型细 胞具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中发生内化的蛋白的抗体、靶向细胞内位置并延 长细胞内半寿期的蛋白。有关受体-介导的胞吞的技术在例如Wu等，J.Biol. Chem. 262, 4429-4432(1987)；和 Wagner 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,3410-3414(1990)中有描 述。关于基因示踪(marking)和基因治疗方案的综述，请参见Anderson等，Science 256， 808-813(1992)。BvS序列也可以用于诊断方法中。BvS的过度表达可以指示生殖器官中的囊肿或 癌症。而且，可以分析患者样品中突变的或失去功能的Bv8。这类方法一般包括比较患者样 品和对照样品中BvS的表达。
8.制品本发明另一实施方案涉及一种制品，其包含可用于治疗或预防疾病或用于调节生 育力的材料。所述制品优选包括一个容器和位于该容器表面的或与该容器相连的标签或包 装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容 器内装载含有BvS或其激动剂或拮抗剂的组合物，标签或包装插页优选提供BvS或其激动 剂或拮抗剂的使用说明。在一个实施方案中，所述制品包含BvS拮抗剂和用BvS拮抗剂治 疗或预防癌症的使用说明。在另一实施方案中，所述制品包含BvS和用BvS治疗或预防与 产激素的内皮组织相关的疾病的使用说明。在另一实施方案中，所知制品包含BvS拮抗剂 和用BvS拮抗剂调节生育力的使用说明。包装插页还可以包括适当剂量方案的说明。在一 个实施方案中，该插页指示，可以按照约0. 01 μ g/kg-50mg/kg的量给药所述组合物。
实施例以下实施例中用到的市售试剂，除非特别说明，都按照厂家建议使用。以下实施例 以及说明书全文中用ATCC保藏号定义的细胞都来自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VTV0实施例1 Northern印迹分析为了阐明BvS的表达模式，用来自人、小鼠和大鼠的各种组织的RNA进行Northern 印迹分析。人RNA印迹与32P-标记的基于人Bv8cDNA的DNA探针杂交，小鼠和大鼠RNA印 迹与32P-标记的基于鼠Bv8 cDNA的DNA探针杂交。Northern印迹分析按照本领域已知方法进行。例如，用30_50ng人或小鼠cDNA 片段，Redi-Prime II 试剂盒(Amersham)，32P_dCTP 3000 μ Ci/mmol (Amersham)制备 cDNA探针。探针在S印hadex G50旋转柱(Pharmacia)上纯化，在ExpressHyb杂交溶液 (Stratagene)中68°C进行杂交。在另一实施例中，将印迹与探针在杂交缓冲液(5X SSPE ； 2X Denhardt溶液；100mg/mL变性并剪切的鲑精DNA ；50%甲酰胺；20Z0 SDS)中42°C孵育60 个小时。印迹在2X SSC ;0. 05% SDS中室温洗涤1小时，共数次，然后在0. IX SSC ；0. 1% SDS中50°C洗涤30分钟。将印迹用phosphorimager analysis (Fuji)曝光过夜进行显色。 等量的RNA加载量通过与对照肌动蛋白探针杂交来评估。检测Bv8mRNA的转录子。图9显示，用人Bv8探针在人睾丸中检测到1. 8kb的单 一 mRNA类型。在所分析的任何其它人类组织中都没有检测到表达。图10A显示，在小鼠睾 丸和心脏中检测到单一的mRNA类型。图10B显示，在大鼠睾丸中检测到1. 8kb和0. 8kb的 转录子，在其它的大鼠组织中未发现。这些发现总体上表明，睾丸是BvSmRNA表达的主要部 位。实施例2细胞增殖分析为了确定具体类型的细胞对BvS的应答，分析了牛肾上腺皮质毛细管内皮细胞 (ACE)和牛脑毛细管内皮细胞(BBC)的增殖应答。简言之，将ACE(肾上腺皮质毛细管内皮细胞)和BBC(牛脑毛细管)内皮细胞培养 在补加了 10%小牛血清的低葡萄糖DMEM中。为了进行细胞增殖分析，将6000个细胞铺在 12孔板的每一个含有上述培养基的孔中，不添加对照(图11中的“C”)，10ng/ml VEGF(图 11中的“V”)，50，10或InM BvS (Fe-标记的重组蛋白)。1周后用Coulter计数器获得细胞总计数。将对照条件随机设置为1，获得相对于它的细胞数增加倍数。培养基和其它细 胞培养试剂从Life Technolgies, Inc.公司获得。所述分析的进行可参见Aravind and Koonin, Curr. Biol. 8 :477_478 (1998)。初步结果见图IlA和11B，这些图显示了相对于对照的细胞数增加情况。BvS在所 有测试浓度下都使细胞增殖增加，最大效应发生在浓度为50nM时。阳性对照VEGF诱导的 ACE和BCC细胞增殖是未处理对照的将近3倍。实施例3细胞存活分析检测BvS对内皮细胞存活的影响。将大约2xl05个牛脑毛细管(BBC)细胞铺在 6孔板上含有完全培养基(见实施例2)的每一孔中。次日，吸出完全培养基，将细胞培养 在不含任何添加剂的培养基中，或者培养在含有以下一种成分的培养基中2% FCS, 10% FCS，20ng/ml VEGF(图 12 的 “V”)，5nM Bv8,25nM Bv8,20ng/ml VEGF+25nM Bv8 (图 12 的 “V+Bv8”)，或25nM EG-VEGF。孵育48小时后，细胞经胰蛋白酶处理后取出，在70%冷乙醇 中固定数小时。然后将细胞用5 μ g/ml碘化丙啶和20ng/ml RNase的PBS溶液室温染色 2-4个小时。亚-Gl期的细胞用FACS分析来确定。将该细胞群体的百分比作为图12中纵 轴上的凋亡细胞百分比来作图。如图12所示，BvS增强了 BBC内皮细胞的存活。具体地，在任一浓度的BvS存在 时，比在2% FCS或25nM EG-VEGF存在时，培养中凋亡细胞的数量少。Bv8和VEGF显示协 同效应，这两种化合物组合使细胞存活增加的程度高于它们各自或者10% FCS0实施例4体内诱导血管牛成检测BvS诱导血管生成应答的能力。在一组实验中，测定BvS对雄性Beige裸鼠 睾丸中血管增殖的影响。编码LacZ，VEGF,和 EG-VEGF 腺病毒有文献描述(LeCouter, Nature, 412 :877_84， 2001)。为了制备编码Bv8的腺病毒，将编码人Bv8的81个氨基酸的同工型的cDNA克隆 到CMV穿梭载体(Stratagene)中，按照厂家建议制备重组腺病毒载体和重组病毒。病毒用 Virapur的大规模试剂盒(Carlsbad，CA)纯化，并测定其效价。为了进行体内研究，将腺病毒载体(LacZ，VEGF, EG-VEGF和Bv8)以IO7 108pfu 注射到Beige裸鼠的睾丸中(n = 5)。7日后，处死动物，将睾丸固定并进行处理，以备组织 学分析。如图13所示，BvS与VEGF和EG-VEGF类似，都增加了裸鼠睾丸细胞中的间质毛细 管的体内形成。在PBS或LacZ腺病毒对照组中，都没有观察到间质毛细管形成或血管生成。 在多个经处理的动物中，观察到管萎缩。这种管萎缩可能源于诱导血管生成应答所导致的 间质压力的增加。以上说明书足以使本领域技术人员实施本发明。但，除了本文显示和描述的以外， 对本发明的各种修改都是本领域技术人员根据上述说明显而易见的，并且都落在所附的权 利要求范围内。
权利要求
诱导肾上腺皮质毛细管内皮(ACE)细胞增殖且包含与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽或编码该多肽的核酸分子在制备用于诱导生成类固醇组织的内皮细胞增殖、促进生成类固醇的组织的内皮细胞存活、或诱导生成类固醇的组织中血管生成的药物中的用途。
2.诱导ACE细胞增殖且包含与SEQID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的 氨基酸序列的多肽的拮抗剂在制备用于抑制生成类固醇的组织的内皮细胞增殖、生成类固 醇的组织的内皮细胞存活、或生成类固醇的组织中血管生成的药物中的用途。
3.诱导ACE细胞增殖且包含与SEQID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的 氨基酸序列的多肽的拮抗剂在制备用于治疗生成类固醇的组织中的癌症的药物中的用途。
4.权利要求3的用途，其中所述癌症是激素依赖性癌症。
5.权利要求2-4之一的用途，其中所述药物还包含VEGF拮抗剂。
6.权利要求1-4之一的用途，其中所述药物用于治疗人。
7.在体外诱导生成类固醇的组织的内皮细胞增殖、促进生成类固醇的组织的内皮细胞 存活、或诱导血管生成的方法，包括将所述细胞与诱导肾上腺皮质毛细管内皮(ACE)细胞 增殖且包含与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽或 编码该多肽的核酸分子接触。
8.在体外抑制生成类固醇的组织的内皮细胞增殖、生成类固醇的组织的内皮细胞存 活、或生成类固醇的组织中的血管生成的方法，包括将所述细胞或组织与诱导肾上腺皮质 毛细管内皮(ACE)细胞增殖且包含与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性 的氨基酸序列的多肽的拮抗剂接触。
9.鉴定BvS拮抗剂的方法，包括a)使候选化合物与诱导肾上腺皮质毛细管内皮(ACE)细胞增殖且包含与SEQID NO 2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽接触，其中所述多肽诱导内皮 细胞增殖、内皮细胞存活或血管生成；和b)测定该候选化合物抑制生成类固醇的组织的内皮细胞增殖、生成类固醇的组织的内 皮细胞存活、或生成类固醇的组织中血管生成的能力。
10.权利要求1-4之一的用途或权利要求7-9之一的方法，其中所述多肽是天然序列Bv8。
11.权利要求10的用途或方法，其中所述多肽包含氨基酸序列SEQID NO :6。
12.权利要求10的用途或方法，其中所述多肽是天然人BvS多肽。
13.权利要求12的用途或方法，其中所述天然人BvS包含氨基酸序列SEQID NO :2或 氨基酸序列SEQ ID NO :4ο
14.权利要求1-4之一的用途或权利要求7-9之一的方法，其中所述多肽能与肝素结合。
15.权利要求1-4之一的用途或权利要求7-9之一的方法，其中所述多肽是嵌合的Bv8。
16.权利要求15的用途或方法，其中所述嵌合的BvS是免疫粘附素。
17.权利要求1的用途或权利要求7的方法，其中所述核酸分子包含核酸序列SEQID NO :1，SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO :5。
18.权利要求1的用途或权利要求7的方法，其中所述药物还包含VEGF或编码VEGF的 核酸分子。
19.权利要求1或2的用途或权利要求7-9之一的方法，其中所述内皮细胞是内分泌腺 内皮细胞。
20.权利要求1-4之一的用途或权利要求7-9之一的方法，其中所述生成类固醇的组织 包括肾上腺、生殖器官、消化道或呼吸道组织。
21.权利要求20的用途或方法，其中所述生殖器官包括睾丸，卵巢，宫颈或子宫。
22.权利要求2-4之一的用途或权利要求8或9的方法，其中所述拮抗剂是抗体，抗体 片段或免疫粘附素。
23.权利要求22的用途或方法，其中所述抗体片段是Fab、Fab，、F(ab，)2或？￥片段。
24.权利要求22的用途或方法，其中所述抗体或抗体片段是单克隆的。
25.权利要求22的用途或方法，其中所述抗体或抗体片段是嵌合的。
26.权利要求22的用途或方法，其中所述抗体或抗体片段是人源化的。
27.一种制品，包含容器；诱导肾上腺皮质毛细管内皮(ACE)细胞增殖且包含与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4具 有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽的拮抗剂；和如何用所述拮抗剂治疗生成类固醇的组织中癌症的说明。
28.权利要求27的制品，其中所述生成类固醇的组织是睾丸组织或卵巢组织。
29.权利要求27的制品，其中所述拮抗剂是结合BvS多肽的抗体或其抗原结合片段，或 者与编码BvS多肽的多核苷酸杂交的反义分子。
30.权利要求5的用途，其中所述VEGF拮抗剂是结合VEGF多肽的抗体或其抗原结合片 段，或者与编码VEGF多肽的多核苷酸杂交的反义分子。
31.一种用于诱导内皮细胞血管生成、诱导内皮细胞增殖或促进内皮细胞存活的组合 物，其包含BvS或编码BvS的核酸分子。
32.一种用于治疗生成类固醇的组织的病症的组合物，其包含BvS或编码BvS的核酸分子。
33.权利要求32的组合物，其中所述生成类固醇的组织包括内分泌肾上腺、生殖器官、 消化道或呼吸道。
34.权利要求32的组合物，其中所述生成类固醇的组织的病症包括先天性脂样肾上腺 增生，不育，性成熟，依赖雄性激素的肿瘤，性早熟，McCime-Albright综合征，先天性肾上腺 发育不全，或低促性腺激素型性腺功能衰退。
35.一种用于抑制内皮细胞增殖、内皮细胞存活、或内皮细胞血管生成的组合物，其包 含BvS拮抗剂。
36.一种用于调节不育的组合物，其包含BvS拮抗剂。
37.权利要求31-34中任一项的组合物，其中所述组合物还包含VEGF或编码VEGF的核 酸分子。
38.权利要求31或35的组合物，其中所述内皮细胞包括血管内皮细胞。
39.权利要求31或35的组合物，其中所述内皮细胞包括生成类固醇的组织的细胞或内分泌腺细胞。
40.权利要求39的组合物，其中所述生成类固醇的组织包括肾上腺、生殖组织、消化 道、或呼吸道组织。
41.权利要求40的组合物，其中所述生殖组织包括睾丸、卵巢、子宫或宫颈。
42.权利要求35-36中任一项的组合物，其中所述组合物还包含VEGF拮抗剂。
43.权利要求35-36中任一项的组合物，其中所述拮抗剂包括抗体、抗原结合性抗体片 段、或反义分子。
44.权利要求43的组合物，其中所述抗原结合性抗体片段包括Fab、Fab，、F(ab，)2或 Fv片段。
45.权利要求43的组合物，其中所述抗体是人源化的，或者所述抗原结合性抗体片段 是人源化抗体的片段。
46.权利要求31-36中任一项的组合物，其中所述Bv8包含与SEQID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，并且诱导内皮细胞增殖。
47.权利要求46的组合物，其中所述BvS是天然序列Bv8。
48.权利要求47的组合物，其中所述Bv8包含SEQID NO 6的氨基酸序列。
49.权利要求47的组合物，其中所述BvS是天然人Bv8。
50.权利要求47的组合物，其中所述Bv8包含SEQID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸 序列。
51.权利要求46的组合物，其中所述BvS结合肝素。
52.权利要求46的组合物，其中所述BvS包括嵌合Bv8。
53.权利要求46的组合物，其中所述嵌合BvS包括免疫粘附素。
54.权利要求46的组合物，其中所述Bv8包含由SEQID NO 1的核酸11-400、SEQ ID NO 3的核酸10-336、或SEQ ID NO 5的核酸57-484编码的多肽。
55.权利要求31-34中任一项的组合物，其中所述多核苷酸包含SEQID N0:1的核酸 11-400、SEQ ID NO 3 的核酸 10-336、或 SEQ ID NO 5 的核酸 57-484。
56.诱导ACE细胞增殖且包含与SEQID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的 氨基酸序列的多肽或编码该多肽的核酸分子在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
57.一种用于治疗糖尿病的组合物，其包含诱导ACE细胞增殖且包含与SEQ ID N0:2或 SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽或编码该多肽的核酸分子。
全文摘要
本发明涉及具有促细胞分裂活性的Bv8的核酸和多肽，更具体地本发明提供了用Bv8多肽诱导内皮细胞增生和促进内皮细胞存活的方法。本发明还提供了筛选Bv8活性调节物的方法。本发明还提供了利用Bv8多肽进行治疗的方法。
文档编号G01N33/15GK101884784SQ20101022753
公开日2010年11月17日 申请日期2002年8月27日 优先权日2001年8月29日
发明者纳波利奥恩·弗拉拉, 詹妮弗·利考特 申请人:杰南技术公司