利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法

专利名称：利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种大肠杆菌的检测方法，尤其涉及一种利用生物免疫测定技术检测 大肠杆菌的方法。
背景技术：
大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相 当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪 中叶，人们才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜 (禽)，常引起严重腹泻和败血症。大肠杆菌是一种普通的原核生物，属于细菌，根据不同 的生物学特性，我们可以将具有致病性的大肠杆菌分为五类致病性大肠杆菌(EPEC)、肠 产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性 大肠杆菌(EAEC)。这几类大肠杆菌是重要的食源性病原菌，主要通过受污染的食物(饮用 水、肉制品和原料奶等)向人类传播。迄今为止，全球已发生过多起因感染具有致病性大肠 杆菌(例如E. coli 0157:H7)而集体死亡的事件。因此，快速、灵敏的检测大肠杆菌(例如 E. coli 0157:H7等)对预防这类事件的再次发生具有非常重大的意义。目前，大肠杆菌的检测技术主要包括利用单克隆抗体的直接检测技术以及大肠杆 菌特征性核酸片段的分子生物学检测技术，常用的直接检测方法主要有利用单克隆抗体的 ELISA(enzyme linked immune sorbent assay)反应检测、荧光染料探针标记检测、化学发 光微阵列检测、压电石英晶体传感检测等，而分子生物学检测方法主要有基因探针方法、荧 光实时PCR方法等。相对于分子生物学检测技术来说，单克隆抗体用于检测大肠杆菌的直 接检测技术具有明显的特异性，并可较大程度地避免假阳性，其作为一种免疫试剂在临床 和食物标本的快速检测中具有广泛的应用前景。但是，利用单克隆抗体直接检测的一些信 号识别方法(如ELISA方法或荧光染料探针方法)已不能满足高灵敏检测的需求，因此，探 求准确、快速、灵敏地检测大肠杆菌的方法一直为医学界所关注。磁纳米颗粒为一种处于纳米级(Inm IOOnm)的磁性材料(Fe的氧化物为主)，其 特质使其具备有量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应及宏观量子隧道效应等。当磁纳米颗 粒粒径小于其超顺磁性临界尺寸时，粒子进入超顺磁状态，其表面可结合多种生物功能分 子，结合后的磁纳米颗粒在微生物检测、基因治疗等医学领域都有广泛的应用。流式细胞术(FCM)是利用流式细胞仪对细胞或其他微小生物颗粒的多种物理、生 物学参数同时进行定量分析的技术，它能在单细胞水平辨认细胞形态、大小和荧光特征，具 有检测速度快、采集数据量大、能同时进行多参数检测、方法灵活客观等优良特性，目前已 成为一种重要的细菌检测手段，并应用于环境、食品以及生物医学等相关领域。然而，由于 细菌体积微小、各种菌体成份含量相对较低，因此采用流式细胞术来实现对大肠杆菌的快 速、高灵敏检测既是一种机遇，同时也是一种挑战。例如，利用传统荧光染料作为标记物，其 荧光强度已难以满足高灵敏检测的需要，需要发展更明亮的荧光标记物。近年来，各种发光纳米颗粒，包括量子点、荧光乳胶颗粒以及二氧化硅荧光纳米颗粒等，由于具有更高的荧光 强度和更好的光稳定性而成功地应用于生物标记及病原菌检测等领域，这些发光纳米颗粒 标记技术为采用流式细胞术来实现对细菌的高灵敏检测提供了一种新的思路。然而，在细 菌浓度较低的情况下，要克服假阳性信号等问题，从而达到快速、准确地检测要求仍然存在 一定困难。因此，如何对低浓度的待测大肠杆菌样品进行快速、准确、灵敏地检测，对于本领 域技术人员来说仍然具有重要意义。

发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种更加快速、准确、灵 敏、且假阳性率低的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种利用磁纳米颗粒富集结合双 色流式细胞术检测大肠杆菌的方法，其特征在于首先利用所述磁纳米颗粒与待测样品共 培育并富集，该富集是指所述磁纳米颗粒与待测样品形成的复合物在外加磁场作用下富集 起来，如果待测样品中含有大肠杆菌，则所述磁纳米颗粒将与待测样品形成大肠杆菌_磁 纳米颗粒复合物并富集起来；然后以荧光纳米颗粒标记的大肠杆菌抗体与富集后的待测样 品进行免疫共培育并二次富集，再以核酸染料对二次富集后的待测样品进行染色，最后采 用多参数流式细胞术和激光共聚焦显微镜对染色后的待测样品进行检测，根据检测到的单 位体积中具有荧光双阳性信号(该荧光双阳性信号即为所述荧光纳米颗粒和染色操作后 得到的核酸染料-细菌核酸复合物所发出的不同颜色的荧光信号)的对象的数量来对待 测样品中大肠杆菌的检测结果进行分析和判断。最后的分析和判断的具体操作对于本领 域技术人员而是显而易见的，例如可以对10，000个对象进行统计分析，分析结果以红色荧 光-绿色荧光的对数双参数点图表示，在阳性对照中，结合绿色荧光与红色荧光信号，如果 荧光双阳区(UR区)呈现出清晰可辨的群，则可判断待测样品中含有大肠杆菌。本发明提出的上述技术方案中，所述磁纳米颗粒用于富集待测样品中的目标菌体 以放大检测信号，所述荧光纳米颗粒标记的羊抗大肠杆菌抗体用于灵敏、特异性地对大肠 杆菌进行免疫荧光染色，而核酸染料用于对细菌进行核酸染色以区分细菌与待测样品中的 其它颗粒性杂质，该技术方案充分结合了磁纳米颗粒的超顺磁效应和双色流式细胞术的灵 敏特异性，整个检测过程(包括样品预处理)可在3h 3. 5h完成，能够真正实现对大肠杆 菌样品进行快速、准确、灵敏地检测。上述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法中，所述荧 光纳米颗粒和所述染色操作后得到的核酸染料_细菌核酸复合物具有不同的荧光最大发 射波长，所述荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物的荧光最大激发波长、荧光最大 发射波长均优选处于300nm 700nm。上述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法中，所述荧 光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物的荧光最大发射波长的差值优选不小于45nm。因 为根据我们反复实验的结果，在该差值以上的两种最大发射波长能够产生较好的荧光双阳 性信号，更有利于后续步骤中借助双色流式细胞术对检测结果进行分析和判断。上述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法中，所述磁 纳米颗粒同样可以为带有激发波长和发射波长的颗粒，但优选为无激发波长和发射波长的
5颗粒，这样能够避免对前述的荧光双阳性信号产生干扰。上述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法中，所述磁 纳米颗粒优选为二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒(该颗粒可直接外购)。上述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法中，所述二 氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒为表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒，所述 待测样品在与该表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒进行共培育以前，先与 刀豆蛋白A进行共培育。事实上，本领域技术人员可以自行选择磁纳米颗粒富集待测样品 的具体方式，而在本优选的技术方案中，所述待测样品中的大肠杆菌先与刀豆蛋白A孵育， 刀豆蛋白A可与大肠杆菌表面0抗原结合，再利用甘露糖和凝集素刀豆蛋白A(ConA)特异 性结合这一特点，通过在氨基化磁纳米颗粒表面修饰甘露糖即可实现磁纳米颗粒对待测样 品的有效富集。更优选的，上述技术方案中的表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗 粒，其制备方法包括以下步骤(1)羧基化甘露糖的制备向去离子水中分别加入甘露糖、一氯醋酸钠溶液和 NaOH溶液，混合，然后加入磷酸二氢钠溶液并滴加盐酸，使混合液中的pH值控制在中性，得 到羧基化甘露糖溶液；(2)磁纳米颗粒表面修饰甘露糖取30 35体积的上述羧基化甘露糖溶液，并添 加适量的PB缓冲液、NHS试剂和EDC试剂，恒温摇床振荡，再向振荡后的羧基化甘露糖溶液 中加入未经修饰的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒使该颗粒在羧基化甘露糖溶液中的浓 度达到3X IO5 3. 5X IO5个/mL，恒温摇床振荡，富集、去上清液，用PB缓冲液洗涤后再富 集，制得表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒。上述的各技术方案中，所述检测对象大肠杆菌主要是指对人体具有致病性的几类 大肠杆菌，其中优选是指肠出血性大肠杆菌(EHEC)，根据检测对象的不同，所选用的大肠 杆菌抗体作适应性调整即可，例如大肠杆菌06的检测可选用兔抗肠致病性大肠杆菌06抗 体；大肠杆菌DH5 α的检测可选用兔抗大肠杆菌DH5 α多克隆抗体；大肠杆菌Κ12的检测 可选用鼠抗大肠杆菌Κ12抗体。根据我们反复实验的结果，本发明的技术方案特别优选适 用于大肠杆菌0157:H7(E. coli 0157:Η7)，相应的大肠杆菌抗体则选用羊抗大肠杆菌抗体 即可。与此相类似的，本发明的技术方案甚至可用于大肠杆菌以外的其他革兰氏阴性致病 菌的检测，例如沙门氏菌的检测对应选用羊抗沙门氏菌特异性抗体，百日咳杆菌对应选用 Bordetellapertussis-百日咳杆菌IgM抗体检测试剂，霍乱弧菌对应选用小鼠单克隆IgA 抗霍乱弧菌抗体，伤寒杆菌对应选用伤寒杆菌IgM抗体，痢疾杆菌对应选用志贺氏痢疾杆 菌单克隆抗体等。上述的各技术方案中，所述荧光纳米颗粒优选为嵌合联吡啶钌配合物(Ru(BPY)3) 的羧基化二氧化硅荧光纳米颗粒；所述核酸染料优选为SYBR Green I。作为对上述技术方案的进一步改进，所述嵌合联吡啶钌配合物的羧基化二氧化硅 荧光纳米颗粒优选是采用以下方法制备得到将环己烷、表面活性剂曲拉通Χ-100和正己 醇(大约为4 1 1的体积比)混合均勻，再加水作分散相，搅拌均勻后形成反相微乳 液，向所述反相微乳液中加入联吡啶钌配合物的水溶液使联吡啶钌配合物在反相微乳液中 的浓度为0. 007mol/L 0. 009mol/L，搅拌均勻后加入适量的正硅酸乙酯和氨水，反应完全(例如22h 24h)后加入羧基化试剂，再充分反应(例如22h 24h)后加入无水乙醇破乳， 离心收集纳米颗粒，依次用乙醇、水洗涤反应后的纳米颗粒，制得嵌合联吡啶钌配合物的羧 基化二氧化硅荧光纳米颗粒。作为对上述技术方案的进一步改进，所述荧光纳米颗粒标记的羊抗大肠杆菌抗体 优选是采用以下方法制备得到取0. 9 1体积的荧光纳米颗粒离心分散，去上清液后加入 MES缓冲液超声分散，离心洗涤后再次充分分散在PB缓冲液中，加入适量的NHS试剂和EDC 试剂，恒温摇床振荡反应25min 30min，再加入0. 05 0. 06体积的羊抗大肠杆菌抗体并 于恒温摇床中振荡反应完全，离心去上清后充分分散在PB缓冲液中，制得荧光纳米颗粒标 记的羊抗大肠杆菌抗体。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明方法通过将磁纳米颗粒和荧光纳米颗粒的两次信号放大作用同时与流式 细胞术能同时进行多参数、快速检测的特点有机地结合在一起，不仅大大缩短了检测时间， 而且在很大程度上提高了检测的准确度，相比于使用普通有机染料作为荧光标记物的传统 流式细胞术，本发明具有更高的检测灵敏度；本发明方法在荧光纳米颗粒标记的特异性抗体识别的基础上，增加核酸染料作为 第二步的确证，这不仅极大地减小了荧光纳米颗粒团聚所造成的高背景噪声，同时也减少 了荧光纳米颗粒与样品中颗粒性杂质的非特异性吸附所造成的假阳性信号，相比于采用异 硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗大肠杆菌抗体作为荧光标记物的单色流式细胞术相比， 本发明显著地降低了检测方法中的假阳性率。综上，本发明的检测方法可以在很短时间内将较低浓度的目标羊抗大肠杆菌捕获 并富集，放大检测信号，真正实现对大肠杆菌进行快速、准确、灵敏地检测。


图1为本发明实施例中多参数流式细胞术检测到的目标菌的流式散点图；其中，a 图 f图分别表示本发明实施例中编号a 编号f的待测样品的检测分析结果；各图中右 上角的百分数表示当用流式细胞术收集10，000个信号时，位于荧光双阳区域的荧光双阳 性信号的占比，图中UR所在的右上部区域即为荧光双阳区域。图2为本发明实施例中本发明检测方法与涂板计数法的检测结果对比图，图2中 横坐标表示由涂板计数法得到的大肠杆菌浓度的对数值，纵坐标表示由流式细胞仪测得的 大肠杆菌浓度的对数值。图3为本发明实施例中利用双色流式细胞术的激光共聚焦显微镜进行观察后的 效果图；其中，a图 f图分别表示本发明实施例中编号a 编号f的待测样品的检测分析 结果荧光图。图4为本发明实施例中表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒的透 射电镜图。图5为本发明实施例中荧光纳米颗粒标记的羊抗大肠杆菌抗体的透射电镜图。图6为本发明实施例中单个大肠杆菌被图4、图5中所示的两种颗粒捕获后得到的 大肠杆菌_磁纳米颗粒_荧光纳米颗粒复合体的透射电镜图。图7为本发明实施例中对比近似技术方案的分析考察及效果对比图；其中
7
a图为E. coli 0157:H7经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒富 集后，用荧光纳米颗粒标记的羊抗大肠杆菌抗体(以下简称Ab-FNPs)和SYBR Green I核 酸染料(以下简称SYBR Green I)进行双色标记的检测结果；b图为E. coli 0157:H7经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒富 集后，用荧光纳米颗粒(以下简称FNPs)和SYBR Green I进行双色标记的检测结果；c图为E. coli 0157:H7经裸磁纳米颗粒富集后，用Ab-FNPs和SYBR Green I进行 双色标记的检测结果；d图为无菌PB缓冲液经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒富集 后，用Ab-FNPs和SYBR-I进行双色标记的检测结果；e图为E. coli 0157:H7经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒富 集后，用Ab-FNPs进行标记的检测结果；f图为E. coli 0157:H7经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒富 集后，用FNPs进行标记的检测结果；g图为E. coli 0157:H7经裸磁纳米颗粒富集后，用Ab-FNPs进行标记的检测结 果；h图为无菌PB缓冲液经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒富集 后，用Ab-FNPs进行标记的检测结果。图8为本发明实施例中基于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的传统流式细胞术获得 最优信噪比(S/N)的对照图。图9为本发明实施例中基于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的传统流式细胞术与涂 板技术法检测大肠杆菌0157 :H7的效果对照图。
具体实施例方式实施例本发明的检测方法在检测大肠杆菌0157:H7中的应用1、磁纳米颗粒捕获和富集E. coli 0157:H7配制浓度分别为2. 6X106cells/mL、2. 6X105cells/mL、2. 6X104cells/mL、 2. 6X103cells/mL、l. 3X 103cells/mL 的 Ε. coli 0157:H7 菌悬液，将各菌悬液与刀豆蛋白 A 于35°C 37°C温度下培育lh，离心冲洗两次；然后取6支体积为IOmL的离心管(编号分 别为a、b、c、d、e、f)，向各管中分别加入以下前述的菌悬液和PB缓冲液配制成梯度浓度的 待测样品，同时在各离心管中加入100 μ L表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米 颗粒(该磁纳米颗粒的透射电镜图如图4所示)，各离心管中的物质成分组成如下所示编号a 10000 μ L ρΗ为7. 4的PB缓冲液和100 μ L表面修饰甘露糖的二氧化硅包 被氨基化磁纳米颗粒，作为空白对照；编号b:9900yL ρΗ 为 7. 4 的 PB 缓冲液、100 μ L 1. 3 X 103cells/mL Ε. coli 0157 :H7和100 μ L表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒，此时目标菌的终浓 度为 1. SXlO'cells/mL ；编号c:9900yL ρΗ 为 7. 4 的 PB 缓冲液、100 μ L2. 6X 103cells/mLE. coli 0157:H7 和100 μ L表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒，此时目标菌的终浓度为2. BXlO'cells/mL ；编号d :9900μ LpH 为 7. 4 的 PB 缓冲液、ΙΟΟμ L2. 6X104cells/mL Ε. coli 0157:H7 和ΙΟΟμ L表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒，此时目标菌的终浓度为 2. 6X102cells/mL ；编号e:9900yL pH 为 7. 4 的 PB 缓冲液、100 μ L 2. 6 X 105cells/mL Ε. coli 0157 :H7和100 μ L表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒，此时目标菌的终浓 度为 2. 6X103cells/mL ；编号f:9900yL pH 为 7. 4 的 PB 缓冲液、100 μ L 2. 6X 106cells/mL Ε. coli 0157 :H7和100 μ L表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒，此时目标菌的终浓 度为 2. 6X104cells/mL ；将含有梯度浓度待测样品(空白对照除外)和磁纳米颗粒的上述六支离心管放入 350C 37°C、ISOrpm的恒温摇床中共孵育lh，然后将孵育后的样品用磁富集器富集4min 5min后，轻轻去掉上清液，再加入ImL PH为7. 4的PB缓冲液冲洗两次，最后加入100 μ L的 PB缓冲液分散样品。2、对待测样品进行免疫荧光染色向步骤1后的上述六个含有梯度浓度待测样品的离心管中各加入20 μ L荧光纳米 颗粒标记的羊抗大肠杆菌抗体(该荧光纳米颗粒的透射电镜图如图5所示)，充分混勻后， 放入35°C 37°C、ISOrpm恒温摇床中共孵育lh，经过磁富集和洗涤，将剩余荧光纳米颗粒 及团聚体去掉，得到如图6所示的大肠杆菌_磁纳米颗粒_荧光纳米颗粒复合体，由图6可 以看出，目标大肠杆菌的表面结合有较多的颗粒，这充分证明本实施例中大肠杆菌先被磁 纳米颗粒富集起来，并成功被荧光纳米颗粒标记。3、对待测样品进行核酸染色向步骤2后的上述六个含有梯度浓度待测样品的离心管中各加入5μ L SYBR Green I核酸染料，室温下染色15min 30min。4、多参数流式细胞术的测定与分析用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜对上述步骤3后的各待测样品进行检测、观察 和分析，分析结果如图1、图2和图3所示。由图1中的a图 f图可见，当目标菌(即待 测E. coli 0157:H7)的浓度增大时，位于双阳区域的荧光双阳性信号的占比是逐渐上升 的。由图2可见，本发明方法所检测到的单位体积中具有荧光双阳性信号的对象的数量与 E. coli 0157:H7的浓度具有较好的线性关系(log Y=L 031ogX-0. 0235)，检测下限可达 到7cellS/mL。由图3中的a图 f图可见，由于a组待测样品体系中无目标菌(空白对 照)，因此通过激光共聚焦显微镜观察不到荧光；而b、c、d、e、f组中随着待测样品体系中 目标菌浓度的梯度增加，视野中观察到的目标菌的数目也逐渐增多，这与前述流式细胞术 测得的结果基本趋于一致。相比于近似技术方案的本发明可行性分析考察及效果对比分别考察下述各种近似技术方案的检测结果并于本发明技术方案的检测结果做 一比对，以证实本发明技术方案的可行性和优越性方案a :5. OX IO3 E. coli 0157:H7经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳 米颗粒富集后，用Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染料进行双色标记(方案a即为本发明的
9技术方案)；方案b :5. OX IO3 E. coli 0157:H7经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳 米颗粒富集后，用荧光纳米颗粒(以下简称FNPs)和SYBR Green I核酸染料进行双色标 记；方案c :5. OXlO3 E. coli 0157:H7经裸磁纳米颗粒富集后，用Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染料进行双色标记；方案d 无菌PB缓冲液经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒富集 后，用Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染料进行双色标记；方案e :5. OX IO3 E. coli 0157:H7经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳 米颗粒富集后，用Ab-FNPs进行单色标记；方案f :5. OX IO3 E. coli 0157:H7经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳 米颗粒富集后，用FNPs进行单色标记；方案g:5.0X103 Ε. coli 0157H7经裸磁纳米颗粒富集后，用Ab-FNPs进行单色 标记；方案h 无菌PB缓冲液经表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒富集 后，用Ab-FNPs进行单色标记。上述的技术方案a h中，由于没有采取其他步骤去除体系中过量的磁纳米颗粒 和荧光纳米颗粒，因此由这些颗粒团聚造成的假阳性信号不能被忽略。我们主要是利用多 参数流式细胞术对上述各方案a h的检测结果进行考察、对比和分析，分析结论如图7所 示，其中上述方案a h的检测结果分别如图7中的a图 h图所示由图7的a图可见，被磁富集后的大肠杆菌0157:H7经过双色标记后，在荧光双阳 区域(即UR区)有一个明显的群落，这表明大肠杆菌0157:H7成功被磁纳米颗粒富集，且 经过双色标记后在荧光双阳区获得大量的荧光双阳性信号；由图7的b图可见，方案b中的大肠杆菌0157:H7经过磁富集，并用未修饰羊抗大 肠杆菌抗体的荧光纳米颗粒和SYBR Green I核酸染料标记后，阳性信号主要出现在绿色荧 光单阳区(即UL区)，这表明大肠杆菌0157:H7可以被表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨 基化磁纳米颗粒富集，同时可以被SYBR Green I核酸染料标记，但由于荧光纳米颗粒未修 饰羊抗大肠杆菌抗体，因此，方案b中的大肠杆菌0157 :H7没有特异性结合荧光纳米颗粒， 这样在红色荧光单阳区(即DR区)中几乎看不到阳性信号；由图7的c图可见，方案c中的大肠杆菌0157:H7经裸磁纳米颗粒富集，并用 Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染料进行双色标记后，其在荧光双阳区域并未出现明显的信 号群落，在绿色荧光单阳区也未出现明显的信号，这表明很可能因为裸磁纳米颗粒表面未 修饰甘露糖，而致使方案c中的大肠杆菌0157 :H7未被有效富集，大量的目标菌被洗涤脱除 后，自然也就无法成功进行双色标记，因此在荧光双阳区域和绿色荧光单阳区无法观察到 阳性信号；而在红色荧光单阳区中出现的信号可能是荧光纳米颗粒团聚引起假阳性信号；由图7的d图可见，方案d中不含大肠杆菌0157 H7，其中的无菌PB缓冲液经表面 修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒富集，并用Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染 料进行双色标记后，其在荧光双阳区域未出现明显的信号群落，在绿色荧光单阳区也未出 现明显的信号；这说明由于方案d中未含有目标菌，自然也就无法成功进行富集和双色标
10记，因此在荧光双阳区域和绿色荧光单阳区均无法观察到阳性信号；而在红色荧光单阳区 中出现的信号可能是荧光纳米颗粒团聚引起假阳性信号；图7的e图 h图是磁纳米颗粒富集结合荧光纳米颗粒标记的单色流式细胞术对 目标菌检测的考察由图7的e图可见，方案e中的大肠杆菌0157:H7经过表面修饰甘露糖的二氧化 硅包被氨基化磁纳米颗粒富集和Ab-FNPs进行单色标记后，其检测信号并不能和其他三个 对照组有效区分开来(如图7的f图 h图)，在其余三个对照组中位于阳性区域(即Rl 区)的信号仍分别占到38. 44% (图7的f图)、93· 46% (图7的g图)和79. 88% (图7 的h图)，这主要是因为其他三个对照组中由于荧光纳米颗粒的团聚造成了大量的假阳性 信号。通过上述对比考察，我们可以认定目标菌大肠杆菌0157 H7和刀豆蛋白A孵育后， 可以成功被修饰了甘露糖的磁纳米颗粒富集，然后用修饰羊抗大肠杆菌抗体的荧光纳米颗 粒和SYBR Green I核酸染料进行双色标记后，可通过多参数双色流式细胞术进行有效检 测。由于磁纳米颗粒的特异性富集、荧光纳米颗粒的特异性标记及核酸染料实现了免分离， 本发明的方法可有效用于对大肠杆菌的检测，且本发明避免了因颗粒团聚造成的假阳性信 号，相比其他各种近似方案具有明显的优势。相比于现有常规技术方案的效果对比现有常规的技术方案主要是指基于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的传统流式细胞 术检测大肠杆菌0157:H7的方法。基于异硫氰酸荧光素(FITC)标记的传统流式细胞术，采用市售异硫氰酸荧光素 (FITC)标记的羊抗大肠杆菌抗体与E. coli 0157:H7纯培养物培育并用流式细胞术进行检 测。首先，优化异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗体浓度以获得最高的信噪比(S/N)；然后将 不同浓度FITC标记的抗体(终浓度分别为5 μ g/mL、10 μ g/mL、20 μ g/mL、30 μ g/mL)分别 与Ε. coli 0157:H7悬浮液(A)和不含Ε. coli 0157:Η7的阴性对照(B)培育，用A与B平 均绿色荧光强度的比值来计算S/N，计算结果如图8所示。由图8可见，当FITC标记的抗体 终浓度为20 μ g/mL时，S/N最高。因此，采用该浓度的抗体结合流式细胞术对1.0 X IO3 1.0X IO7ceIlsAiL梯度浓度的E. coli 0157:H7进行检测，检测步骤及结果如下(1)配制浓度为 1. 0X107cells/mL、l. 0X106cells/mL、l. 0X105cells/mL、 1. 0X104cells/mL、l. 0X103cells/mL的目标菌悬液，并取六支体积为1. 5mL的离心管，编 号分别为a、b、c、d、e、f,各离心管中的物质成分组成如下所示编号a:200yL 1. 0X 107cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ L 终浓度为 20 μ g/mL 的 FITC标记的羊抗大肠杆菌抗体；编号b:200yL 1. 0X106cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ L 终浓度为 20 μ g/mL 的 FITC标记的羊抗大肠杆菌抗体；编号c:200yL 1. 0X105cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ L 终浓度为 20 μ g/mL 的 FITC标记的羊抗大肠杆菌抗体；编号d:200yL 1. 0X104cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ L 终浓度为 20 μ g/mL 的 FITC标记的羊抗大肠杆菌抗体；编号e:200yL 1. 0X 103cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ 1 终浓度为 20 μ g/mL 的FITC标记的羊抗大肠杆菌抗体；编号f 200 μ L PB缓冲液和6 μ L终浓度为20 μ g/mL的FITC标记的羊抗大肠杆 菌抗体；(2)在35°C 37°C、180rpm的恒温摇床中共孵育lh，并对孵育后的样品进行 流式细胞术的测定和分析，分析结果如图9所示，由图9可见，检测到的单位体积中具有 荧光信号的数量与大肠杆菌的浓度具有较好的线性关系，大肠杆菌0157:H7的检测限为 2. lX103cellS/mL，可见与使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体的传统流式细胞术相比， 本实施例的灵敏度提高了三个数量级。本发明上述实施例中用到的磁纳米颗粒为表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基 化磁纳米颗粒，该颗粒是用以下方法制备得到(1)羧基化甘露糖的制备在25mL的锥形瓶中加入Ig (0. 25g 3g均可)甘露糖、 1. 35mol/L 的一氯醋酸钠 3. 75mL(3. 7mL 4. OmL 均可)U0mol/L 的 NaOH 0. 5mL (0. 5mL 0. 6mL均可)和去离子水0. 8mL，室温下搅拌反应7h，然后加入浓度为lmol/L磷酸二氢钠 ImL,滴加6mol/L和lmol/L的盐酸调节pH值为7左右；(2)磁纳米颗粒表面修饰甘露糖在体积为1.5!^的离心管中加入3(^1^羧基 化甘露糖、100 μ L PH为7.4的？8缓冲液、0.35!^朋3试剂(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和
0.35mg的EDC试剂(1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐)，25°C、180rpm恒温摇 床中反应30min，然后加入IOyL IO6个/mL磁纳米颗粒，25°C、180rpm的恒温摇床中反应 3h 3. 5h，富集、去掉上清液、用PB缓冲液洗涤两次再富集，制得如图4所示的表面修饰甘 露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒。由图4可见，该磁纳米颗粒有些团聚，但颗粒形貌 较规则，大小比较均一。本发明上述实施例中用到的荧光纳米颗粒为嵌合联吡啶钌配合物的羧基化二氧 化硅荧光纳米颗粒，该荧光纳米颗粒是用以下方法制备得到将7. 5mL 7. 6mL的环己烷、
1.6mL 1. 8mL的表面活性剂曲拉通X-100和1. 6mL 1. 8mL的正己醇混合均勻，加入 400 μ L水作为分散相，搅拌均勻后形成反相微乳液，再加入80 μ L 0. lmol/L的联吡啶钌配 合物的水溶液，搅拌均勻后加入200 μ L的正硅酸乙酯和200 μ L的氨水，反应24h后加入 30 μ L羧基化试剂，继续反应24h后无水乙醇破乳，离心收集纳米颗粒，依次用乙醇、水洗涤 反应后的纳米颗粒，制得嵌合联吡啶钌配合物的羧基化二氧化硅荧光纳米颗粒。本发明上述实施例中用到的荧光纳米颗粒标记的羊抗大肠杆菌抗体用以下方法 制备得到取ImL荧光纳米颗粒12000rpm离心lOmin，去上清液后加入ImL PB缓冲液(MES 缓冲液亦可)超声分散，离心洗涤两次，再次充分分散在ImL PB缓冲液中，然后加入3. 5mg 的NHS和3. 5mg的EDC试剂，25 V、180rpm恒温摇床中反应30min，然后加入50 μ L羊抗大 肠杆菌抗体，并于25°C、180rpm恒温摇床中反应3 3. 5h，IOOOOrpm离心5min，去上清后 充分分散在ImL PB缓冲液中，制备得到如图5所示的荧光纳米颗粒标记的羊抗大肠杆菌抗 体，储存于4°C冰箱里备用。由图5可以看出该颗粒形貌较规则，大小均一，分散性好。
1权利要求
一种利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法，其特征在于首先利用所述磁纳米颗粒与待测样品共培育并富集，该富集是指所述磁纳米颗粒与待测样品形成的复合物在外加磁场作用下富集起来；然后以荧光纳米颗粒标记的大肠杆菌抗体与富集后的待测样品进行免疫共培育并二次富集，再以核酸染料对二次富集后的待测样品进行染色，最后采用多参数流式细胞术和激光共聚焦显微镜对染色后的待测样品进行检测和观察，根据检测到的具有荧光双阳性信号的对象的数量来对待测样品中大肠杆菌的检测结果进行分析和判断。
2.根据权利要求1所述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的 方法，其特征在于所述荧光纳米颗粒和所述染色操作后得到的核酸染料_细菌核酸复合 物具有不同的荧光最大发射波长，所述荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物的荧光 最大激发波长、荧光最大发射波长均处于300nm 700nm。
3.根据权利要求2所述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的 方法，其特征在于所述荧光纳米颗粒和核酸染料-细菌核酸复合物的荧光最大发射波长 的差值不小于45nm ；所述磁纳米颗粒为无激发波长和发射波长的颗粒。
4.根据权利要求3所述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的 方法，其特征在于所述磁纳米颗粒为二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的 方法，其特征在于所述二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒为表面修饰甘露糖的二氧化硅包 被氨基化磁纳米颗粒，所述待测样品在与该表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米 颗粒进行共培育以前，先与刀豆蛋白A进行共培育。
6.根据权利要求5所述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的 方法，其特征在于，所述表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒的制备方法包 括以下步骤(1)羧基化甘露糖的制备向去离子水中分别加入甘露糖、一氯醋酸钠溶液和NaOH溶 液，混合，然后加入磷酸二氢钠溶液并滴加盐酸，使混合液中的PH值控制在中性，得到羧基 化甘露糖溶液；(2)磁纳米颗粒表面修饰甘露糖取30 35体积的上述羧基化甘露糖溶液，并添加适 量的PB缓冲液、NHS试剂和EDC试剂，恒温摇床振荡，再向振荡后的羧基化甘露糖溶液中加 入未经修饰的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒使该颗粒在羧基化甘露糖溶液中的浓度达 到3 X IO5 3. 5 X IO5个/mL，恒温摇床振荡，富集、去上清液，用PB缓冲液洗涤后再富集， 制得表面修饰甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁纳米颗粒。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测 大肠杆菌的方法，其特征在于所述大肠杆菌为大肠杆菌0157:H7，所述大肠杆菌抗体为羊 抗大肠杆菌抗体。
8.根据权利要求7所述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的 方法，其特征在于所述荧光纳米颗粒为嵌合联吡啶钌配合物的羧基化二氧化硅荧光纳米 颗粒；所述核酸染料为SYBR Green I。
9.根据权利要求8所述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的 方法，其特征在于，所述嵌合联吡啶钌配合物的羧基化二氧化硅荧光纳米颗粒是采用以下方法制备得到将环己烷、表面活性剂曲拉通X-100和正己醇混合均勻，再加水作分散相， 搅拌均勻后形成反相微乳液，向所述反相微乳液中加入联吡啶钌配合物的水溶液使联吡啶 钌配合物在反相微乳液中的浓度为0. 007mol/L 0. 009mol/L，搅拌均勻后加入适量的正 硅酸乙酯和氨水，反应完全后加入羧基化试剂，再充分反应后加入无水乙醇破乳，离心收集 纳米颗粒，依次用乙醇、水洗涤反应后的纳米颗粒，制得嵌合联吡啶钌配合物的羧基化二氧 化硅荧光纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌 的方法，其特征在于，所述荧光纳米颗粒标记的羊抗大肠杆菌抗体是采用以下方法制备得 到取0. 9 1体积的荧光纳米颗粒离心分散，去上清液后加入MES缓冲液超声分散，离心 洗涤后再次充分分散在PB缓冲液中，加入适量的NHS试剂和EDC试剂，恒温摇床振荡反应 25min 30min，再加入0. 05 0. 06体积的羊抗大肠杆菌抗体并于恒温摇床中振荡反应完 全，离心去上清后充分分散在PB缓冲液中，制得荧光纳米颗粒标记的羊抗大肠杆菌抗体。
全文摘要
本发明涉及一种大肠杆菌的检测方法，具体公开了利用磁纳米颗粒富集结合双色流式细胞术检测大肠杆菌的方法，其步骤是首先利用磁纳米颗粒与待测样品共培育并富集，该富集是指所述磁纳米颗粒与待测样品形成的复合物在外加磁场作用下富集起来；然后以荧光纳米颗粒标记的大肠杆菌抗体与富集后的待测样品进行免疫共培育并二次富集，再以核酸染料对二次富集后的待测样品进行染色，最后采用多参数流式细胞术和激光共聚焦显微镜对染色后的待测样品进行检测和观察，根据检测到的具有荧光双阳性信号的对象的数量来对待测样品中大肠杆菌的检测结果进行分析和判断。本发明的检测方法具有快速、准确、灵敏且假阳性率低等优点。
文档编号G01N15/10GK101907556SQ201010230079
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者何定庚, 何晓晓, 周丽霞, 曹杰, 王柯敏 申请人:湖南大学