专利名称：一种抗诺龙的特异性抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及选择一种最大可能包含诺龙原有结构的化合物作为诺龙半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗体制备方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食品安全已成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题。随着人们生活水平的提高，人们越来越关注自己的健康，功能食品也日益受到人们的青睐。但是随之而来的功能食品中掺假现象日益严重，严重危害着消费者的身心健康。近年来，功能食品的安全问题日益突出，对于食品中掺假物质检测技术也提出了新的要求，研究者正在积极寻求能满足以下几个方面特点的食品快速检测与分析方法高灵敏度；高特异性；宽适用范围，可测定各类功能食品；低检测费用；易商品化。免疫检测是目前符合这一要求的使用最为广泛的快速检测技术。诺龙具有较强的毒副作用，可引起癌症，肝炎和神经混乱。功能食品中恶意掺加诺龙极易对人体造成危害，因此对功能食品中诺龙的检测具有重要意义。由于17 β-NT在功能食品中的的添加都很微量，同时功能食品的成分一般比较复杂，基质影响很难消除，常规检测方法很难达到理想的检测效果，因此迫切需要建立一种经济、可靠、特异、敏感、快速有效的方法。针对功能食品的恶意掺假现象，本论文制备出掺假物诺龙的高灵敏度、特异性强的抗体，建立简单、快速的诺龙固相萃取-酶联免疫检测方法，为功能食品鉴伪提供一种可靠的技术支撑。
发明内容
本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。本发明为达到以上目的所设计的技术方案是合成分子结构式如下图所示的诺龙半抗原
权利要求
1.诺龙的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为
2.权利要求1所述的诺龙人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得(1)诺龙半抗原的合成步骤精确称取0. 5488mg诺龙溶于13. 5mL无水四氢呋喃中，加入0. 4g 丁二酸酐，0. 55mL三乙胺和0. 243mg DMAP，60°C反应过夜，将溶剂悬蒸至干；(2)半抗原的纯化将所得残渣用有机溶剂乙酸乙酯/石油醚(1/1，ν/ν)溶解后，过层析柱纯化。经过优化，最终选择乙酸乙酯/石油醚(l/l，v/v)为展开剂。将得到的滤液旋蒸后得到白色晶体， 即为17 β-NT半抗原；
3.权利要求1所述的诺龙酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得 权利2所得的17 β-NT半抗原与HRP结合制成酶标抗原。方法与免疫抗原的制备方法相同分别精确称取上述所得17 β -NT半抗原0. 025mmol (9. 36mg)和9. 3mg EDC，溶于 ImLN-N 二甲基甲酰胺(DMF)溶液中。将此溶液在冰浴中逐滴加入2mL浓度为5mg/mL的HRP 溶液中(IOmg HRP溶于2mL 130mmol/L碳酸氢钠缓冲液中，pH 8. 1)，搅拌，室温下反应证； 再精确称取4. 7mg EDC加入反应液中，搅拌，4°C反应过夜，然后将反应液在4°C、pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液(PBQ中透析三天，然后精确量取酶标抗原溶液的体积，测定浓度加入硫柳汞，4°C保存；
4.权利要求1所述的诺龙抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得 免疫动物选用雌性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月进行第五次免疫，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是初次免疫取Img按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；加强免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；抗体纯化定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-kpharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗诺龙的特异性抗体。
全文摘要
诺龙人工抗原和抗体的制备方法，涉及一种最大程度保留诺龙结构的人工半抗原、抗原和抗体的制备方法，通过化学合成方法制得的诺龙半抗原与载体BSA蛋白相连接合成人工抗原，抗体是人工抗原经动物免疫、取血，分出抗血清，纯化制得。本发明是通过设计合成具有诺龙结构的半抗原和人工抗原，突出了此分子特异性抗原决定簇又克服了化学合成的困难，并采用免疫动物诱导产生亲和性很高的抗体；与其他同类方法相比，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点，所设计、合成的半抗原为制备特异性良好的抗体奠定了基础。
文档编号G01N33/535GK102336830SQ20101023795
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者张燕, 王俊平, 王硕, 王莉 申请人:天津科技大学