专利名称：一种针对血管内皮生长因子受体-3的光激化学发光药物筛选试剂盒的制作方法
技术领域：
一种针对血管内皮生长因子受体-3的光激化学发光药物筛选试剂盒，用于血管 内皮生长因子受体-3拮抗剂的高通量筛选，属于光激化学发光检测技术(LICLIA)领域。
背景技术：
肿瘤的生长和转移与新生血管有着密切的关系，目前抗肿瘤新生血管生成治疗方 面的研究已较深入，但单纯抗肿瘤血管生成治疗并未达到抗肿瘤转移的预期效果。其原因 主要是由于肿瘤生物学特性的复杂性和多态性，而且转移的发生是一个多因素、多环节参 与的调控过程，仅仅阻断某一条途径并不能完全阻断肿瘤细胞远处转移。淋巴结转移是恶性肿瘤转移的一个重要途径，有无淋巴结转移及转移淋巴结 的数目一直被认为是决定肿瘤患者临床分期、治疗方案制订和预后评估的重要因素之 一。国内外研究表明，血管内皮生长因子受体_3 (vascular endothelialgrowth factor receptor-3, VEGFR-3)信号转导通路在肿瘤淋巴管生成中起着重要作用。VEGFR-3与其配 体VEGF-C或VEGF-D特异性结合，可促进淋巴管内皮细胞迁移，激活信号转导刺激淋巴管内 皮细胞增殖，诱导肿瘤淋巴管生成。因此，针对该通路的抗体、药物及疫苗的研制成为当前 肿瘤生物治疗研究的热点和方向。2000年，Sugen公司首先开发出了 VEGFRTK抑制剂SU5416后，以VEGFR胞内部分 的酪氨酸激酶为靶点设计及筛选小分子化学药物(TKI)成为一个研究的热点。其中最为引 人注目的是索拉非尼和舒尼替尼。由于VEGFR TKI药物具有很多优点，如副作用轻微、不易产生耐药性，因此开发以 VEGFR TK为靶点的高通量药物筛选试剂盒具有巨大的意义。目前，实际应用多采用RIA及 ELISA等技术建立以VEGFR TK为靶点的高通量药物筛选模型。RIA具有高度的特异性、灵 敏度和实用性，但该方法存在放射性污染、半衰期短及试剂盒稳定性差等问题，而ELISA重 复性和灵敏度较差，同时以上两种方法耗时长，操作复杂。因此基于常规方法进行药物筛选 限制了筛选效率和筛选规模。光激化学发光检测技术(LICLIA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一代检测技 术，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激发产生的 均相化学发光技术。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。LICLIA试剂 由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面 覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶 表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒的表 面包被着成百上千个生物分子，可捕获目标分子。LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照 射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短 暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200nm)。如果发光微粒在200nm直
3径范围之内，就能接受单线态氧，发出高能级的光(520nm-620nm)从而产生信号。相反，如 果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种 依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICLIA均相反应的基础。通常在该反应体系 中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常 微弱。但通过包被在微粒表面的生物分子相互作用拉近两个微粒的距离，例如形成免疫夹 心复合物，就能产生能量的有效传递并发出光信号。
发明内容
本发明的目的在于制备一种针对血管内皮生长因子受体_3的光激化学发光药物 筛选试剂盒，用于针对血管内皮生长因子受体-3的高通量药物筛选。本发明的技术方案一种针对血管内皮生长因子受体-3(VEGFR_3)的光激化学 发光药物筛选试剂盒，由白色不透明微孔板(1)，连接PolyE4Y人工多肽的发光微粒(2)， VEGFR-3激酶(购于CST) (3)，金属离子反应缓冲液(4)，ATP (5mmol/L) (5)，鼠抗磷酸化酪 氨酸单抗冻干品(PY99)(购于Santa Cruz) (6)，生物素化羊抗鼠抗体冻干品(购于华美生 物)(7)和包被有链霉亲和素的感光微粒(购于博阳生物)(8)组成。连接PolyE4Y人工多肽的发光微粒(2)的制备在离心管中加入Img发光微粒 (购于博阳生物)，加入由12. 5 uLU % Tween-20配制的0. 05mg PolyE4Y人工多肽(购于 Sigma)溶液，加入10μ L、25mg/mL硼氢化氰钠溶液，用0. lmol/L、pH 6. 0的2-(N-吗啉)乙 磺酸(MES)缓冲液将体积补充到200 μ L，37°C避光振荡反应48小时，加入10 μ L 0. 3mol/ L、pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37°C避光孵育1小时，离心， 分离得到已连接PolyE4Y的发光微粒，1 100用金属离子反应缓冲液稀释后备用。金属离子反应缓冲液(4)的配制金属离子反应缓冲液按照如下浓度配制， 60mmol 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、20mmol MgCl2UOmmol MnCl2、5ymol Na3VO4 禾口 2mmol 二硫苏糖醇(DTT)用蒸馏水定容至1L。一种用所述的试剂盒进行高通量药物筛选的方法，将含有PolyE4Y人工多肽的发 光微粒、VEGFR-3激酶和ATP的金属离子反应缓冲液加入到白色不透明微孔板；接着加入样 品稀释缓冲液及不同浓度的样品到各自的微孔中，室温振荡孵育；然后各孔顺序加入PY99 单抗、生物素化羊抗鼠抗体进行标记免疫反应；接着加入包被有链霉亲和素的感光微粒进 行反应，反应后用光激化学发光检测仪检测光信号，以样品稀释缓冲液的检测数据为阴性 对照，以加入被测样品的检测数据计算样品的半数抑制浓度IC50值。所述的高通量药物筛选的方法，操作为取2(^1^含有1(^!1101/1 PolyE4Y人工多 肽的发光微粒、IOOng VEGFR-3激酶和ATP (40 μ mol/L)的金属离子反应缓冲液加入到白色 不透明微孔板；加入2 μ L的样品稀释缓冲液及2 μ L不同浓度的样品溶液到各自的微孔中， 室温振荡孵育1小时；然后各孔顺序加20 μ L、0. 2 μ g/mL的PY99单抗；继续加入20 μ L、 1 μ g/mL的生物素化羊抗鼠抗体，37°C孵育30分钟；加175 μ L、10 μ g/mL包被有链霉亲和 素的感光微粒，37°C孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，以样品稀释缓冲 液的检测数据为阴性对照，以加入被测样品的检测数据计算被测样品的半数抑制浓度IC50 值。所述的高通量药物筛选的方法，其中的样品处理水溶性样品的样品稀释缓冲液为蒸馏水，蒸馏水作为阴性对照；脂溶性样品的样品稀释缓冲液为0. 5%二甲基亚砜DMSO 溶液，0. 5 %的DMSO作为阴性对照。本发明的有益效果本发明用于针对血管内皮生长因子受体_3的高通量药物筛 选，试剂盒结构简单，操作简便、检测时间短、灵敏度高。
图1 :VEGFR_3高通量药物筛选试剂盒示意图。1、白色不透明微孔板，2、连接 PolyE4Y人工多肽的发光微粒，3、VEGFR-3激酶，4、金属离子反应缓冲液，5、5mmol/L ATP, 6, 鼠抗磷酸化酪氨酸单抗冻干品PY99，7、生物素化羊抗鼠抗体冻干品，8、包被有链霉亲和素 的感光微粒。图2 :LICLIA反应示意图。图3 :VEGFR-3激酶活性检测曲线图。
具体实施例方式实施例1试剂盒的制备发光微粒、包被有链霉亲和素的感光微粒购于博阳生物科技(上海)有限公司。包被有PolyE4Y人工多肽的发光微粒制备在离心管中加入Img发光微粒，加入 12. 5μ LU% Tween-20配制的0. 05mg PolyE4Y人工多肽，加入10 μ L、25mg/mL硼氢化氰钠 溶液，用0. lmol/L、pH 6. 0的2- (N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液将体积补充到200 μ L，37°C 避光振荡反应48小时，加入10 μ L 0. 3mol/L、pH 5. 0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封 闭未结合位点，37°C避光孵育1小时后离心，分离得到已连接PolyE4Y的发光微粒，1 100 用金属离子反应缓冲液稀释后备用。金属离子反应缓冲液的配制60mmolHEPES、20mmol MgCl2、10mmolMnCl2、5 μ mol Na3V04、2mmol DTT用蒸馏水定容至1L。试剂盒的组成(1)、白色不透明微孔板(12条X8孔，可以拆分为单孔)。(2)、1 X包被有PolyE4Y人工多肽的发光微粒2mL。(3)、1 X VEGFR-3 激酶5 μ g(4)、1X 金属离子反应缓冲液(60mmol/L HEPES、20mmol/L MgCl2、10mmol/L MnCl2、5ymol/L Na3V04、2mmol/L DTT) :50mL(5)、ATP(5mmol/L) :20μ L(6)、1X鼠抗磷酸化酪氨酸单抗冻干品(PY99)，用时ImL蒸馏水溶解。(7)、1 X生物素化羊抗鼠抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。(8)、1 X包被有链霉亲和素的感光微粒20mL。测定时注意事项1、VEGFR-3激酶和ATP保存于-20 V，使用时置冰上操作。2、使用之后立即将其余试剂放回2_8°C。3、在37°C恒温孵育过程中，避免光线照射。实施例2试剂盒的应用
制备的试剂盒检测已知VEGFR-3拮抗剂SU11248及PTK787的拮抗活性。具体检测步骤如下样品处理将样品苹果酸舒尼替尼(SU11248)及瓦他拉尼(PTK787)用0. 5 % 的 DMSO 溶液溶解，分别稀释至 1000nmol/L，500nmol/L, 250nmol/L, 1 OOnmo 1/L, 50nmol/L, 25nmol/L, lOnmol/L, Onmol/L,备用。取20 μ L含有10 μ g/mL PolyE4Y人工多肽的发光微粒、IOOng VEGFR-3激酶和 40ymol/L ATP的金属离子反应缓冲液，加入到白色不透明微孔板；加入2 μ L0. 5%的DMSO 样品稀释缓冲液及不同浓度的样品溶液到各自的微孔中，室温振荡孵育1小时；加20 μ L、 0. 2 μ g/mL的PY99单抗；继续加入20 μ L、1 μ g/mL生物素化羊抗鼠抗体，37°C孵育30分钟； 加175 μ L、10y g/mL包被有链霉亲和素的感光微粒，37°C孵育15分钟后在光激化学发光检 测仪上检测光信号，以样品稀释缓冲液的检测数据为阴性对照，从检测数据计算被测样品 的IC50值。表 1
SUl1248IC50(nM)样品浓度(nM)01025501002505001000135.5荧光值(cps)107928894809265234930393933832672表2
PTK787IC50(nM)样品浓度(nM)0102550100250500100097.1荧光值(cps)102928744689257734080303924831972
权利要求
一种针对血管内皮生长因子受体 3，简称VEGFR 3，的光激化学发光药物筛选试剂盒，其特征是由白色不透明微孔板(1)，连接PolyE4Y人工多肽的发光微粒(2)，VEGFR 3激酶(3)，金属离子反应缓冲液(4)，三磷酸腺苷ATP(5)，鼠抗磷酸化酪氨酸单抗冻干品PY99(6)，生物素化羊抗鼠抗体冻干品(7)和包被有链霉亲和素的感光微粒(8)组成；所述金属离子反应缓冲液的配制60mmol 4 羟乙基哌嗪乙磺酸、20mmolMgCl2、10mmol MnCl2、5μmol Na3VO4和2mmol二硫苏糖醇用蒸馏水定容至1L。
2.一种用权利要求1所述的试剂盒进行高通量药物筛选的方法，其特征是将含有 PolyE4Y人工多肽的发光微粒、VEGFR-3激酶和ATP的金属离子反应缓冲液加入到白色不 透明微孔板；接着加入样品稀释缓冲液及不同浓度的样品溶液到各自的微孔中，室温振荡 孵育；然后各孔顺序加入PY99单抗、生物素化羊抗鼠抗体进行标记免疫反应；接着加入包 被有链霉亲和素的感光微粒进行反应，反应后用光激化学发光检测仪检测光信号，以样品 稀释缓冲液的检测数据为阴性对照，以加入被测样品的检测数据计算样品的半数抑制浓度 IC50 ；所述样品稀释缓冲液水溶性样品的样品稀释缓冲液为蒸馏水，蒸馏水作为阴性对照； 脂溶性样品的样品稀释缓冲液为0. 5 % 二甲基亚砜DMSO溶液，0. 5 %的DMSO作为阴性对照。
3.根据权利要求2所述的高通量药物筛选的方法，其特征是操作为取20μ L含有 10 μ g/mL PolyE4Y人工多肽的发光微粒、IOOng VEGFR-3激酶和40 μ mol/LATP的金属离子 反应缓冲液，加入到白色不透明微孔板；加入2 μ L的样品稀释缓冲液及2 μ L不同浓度的样 品溶液到各自的微孔中，室温振荡孵育1小时；然后各孔顺序加20 μ L、0. 2 μ g/mL的PY99 单抗；继续加入20 μ L、1 μ g/mL生物素化羊抗鼠抗体，37°C孵育30分钟；加175 μ LUO μ g/ mL包被有链霉亲和素的感光微粒，37°C孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信 号，以样品稀释缓冲液的检测数据为阴性对照，以加入被测样品的检测数据计算被测样品 的半数抑制浓度IC50值。
全文摘要
一种针对血管内皮生长因子受体-3的光激化学发光药物筛选试剂盒，属于光激化学发光检测技术(LICLIA)领域。将含有PolyE4Y发光微粒、VEGFR-3激酶和ATP的反应缓冲液加到微孔板，加样品稀释缓冲液及样品溶液，振荡孵育；顺序加入PY99单抗、生物素化羊抗鼠抗体避光反应，再加入包被有链霉亲和素的感光微粒孵育后检测。PolyE4Y在VEGFR-3激酶及ATP的作用下磷酸化，有拮抗作用的样品抑制这种磷酸化反应；磷酸化的PolyE4Y与PY99单抗结合，再与生物素化羊抗鼠抗体及感光微粒形成复合体，光激发下通过单线态离子氧将能量传递给发光微粒产生荧光，用光激化学发光检测仪检测，计算样品的IC50。本发明药物筛选试剂盒结构简单，操作简便、检测时间短、灵敏度高。
文档编号G01N33/531GK101943702SQ20101024426
公开日2011年1月12日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者周彬, 张艺, 徐娟, 杨润琳, 王柯, 黄飚 申请人:江苏省原子医学研究所