专利名称：肉类中旋毛虫成囊前期幼虫的检疫方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及肉类检疫技术领域，尤其是涉及一种肉类中旋毛虫成囊前 期幼虫的检疫方法。
背景技术：
旋毛虫病主要因生食或半生食含有旋毛虫感染性幼虫的肉类及肉制品所致，该病 不仅严重危害人体健康，对畜牧养殖业也可造成巨大经济损失。随着人们饮食习惯的改变， 因食生或半生动物肉类而引起旋毛虫病的暴发逐渐增多；此外，由于国际贸易的全球化、旅 游事业的发展及人口的大规模流动，均增加了旋毛虫病传播的机会。据估计，目前全世界大 约有1100万旋毛虫病患者，现已将其列为再次出现的疾病(re-emerging disease)。血清 学调查显示，目前我国约有2 000万旋毛虫感染者，感染率远高于世界平均水平。因此，加 强肉类旋毛虫检疫已是刻不容缓的艰巨任务。许多国家已经立法，规定应使用直接法(旋毛虫镜检法或人工消化法)进行肉类中 的旋毛虫检疫。国内目前常采用膈肌压片镜检法检查旋毛虫，但镜检法的敏感性较低，尤 其是对含有低密度幼虫的肌肉样本检查时，其假阴性率可高达52%，达不到对肉类安全的要 求。国际旋毛虫病委员会推荐使用人工消化法进行肉类检疫，理论上，只要肉类或肉制品样 品中含有1条或1条以上旋毛虫幼虫(对公共卫生构成威胁的最低感染水平)，如果操作方 法正确，即可被检出。但是，在实际应用过程中，消化法的检疫效果受样本的制备方法、消化 液的组成、胃蛋白酶和盐酸的浓度、消化的温度和持续时间、回收幼虫的过滤和沉淀方法等 多种因素影响，实际上的敏感性是每克肌肉含3 5条幼虫才能被检出，此时被检样本中已 含有足以引起人体旋毛虫病的幼虫，但检疫时却会出现假阴性的结果。如1985-1986年在 前南斯拉夫发生的15次旋毛虫病暴发，均是食入了经过检疫合格的猪肉所致，2001-2002 年在Kumane市发生的暴发也是由于食入了漏检的猪肉所致。因此，检验结果的可靠性对于 保证食品安全与人民健康是非常重要的。传统观点普遍认为，只有成囊期幼虫才是旋毛虫(除伪旋毛虫等不成囊的旋毛虫 外)的感染阶段，目前应用的多种肉类旋毛虫检疫技术都是针对成囊期幼虫进行观察的结 果。随着研究的深入，现已证实旋毛虫感染宿主后18天的成囊前期幼虫对新宿主已具有感 染性，即成囊前期感染性幼虫。对含有旋毛虫成囊前期感染性幼虫的肉类进行检疫时，由于 此期旋毛虫幼虫多呈圆柱状或棒状，且没有典型的旋毛虫幼虫囊包，混杂在肌纤维之中较 难分辨，导致镜检的难度加大，非专业人员很难检测出来，检出率大大降低；此外，成囊前期 感染性幼虫由于没有囊包的保护作用，其抵抗消化的能力明显低于成囊期幼虫，不能耐受 常规配方人工消化液的消化作用，在使用人工消化法对含有成囊前期感染性幼虫的肉类进 行检疫时，幼虫常被消化断裂成数段，部分幼虫甚至会被消化掉，与肉样中未消化完全的肌 纤维混在一起，极难分辨，严重影响肉类旋毛虫的检疫效果，导致假阴性结果的出现，对公 众健康构成威胁。故不能将检疫旋毛虫成囊期幼虫的方法直接用于成囊前期感染性幼虫的 检疫。
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由此可见，旋毛虫镜检法和人工消化法的敏感性在实际应用中并不能完全达到对 肉类安全的要求，尤其是对旋毛虫轻度感染和/或成囊前期感染性幼虫检疫时，更不能满 足公共卫生需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高检出率且可广泛应用于肉类中旋毛虫成囊前 期幼虫的检疫方法。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的肉类中旋毛虫成囊前期幼虫的检疫方法，包括下述步骤 第一步，从待检动物酮体的不同部位采集总重2g 5g的待检肉样，在洁净平皿中置 4°C 预冷 20min ；
第二步，取漏斗一只，将漏斗下端连接上软管，用夹子将软管末端夹紧；取医用纱布折 叠成4层以上后平铺在漏斗中，先用生理盐水将纱布润湿，之后向漏斗中缓慢加入生理盐 水，使其浸没纱布块底部即可；
第三步，将恒温水浴锅温度调整至37°C后，将漏斗下部插入水浴锅中，保持水面低于纱 布块底层2cm ；
第四步，将第一步预冷后的待检肉样置于搅拌器中绞碎后，置于漏斗中的医用纱布块 上，加入生理盐水，使生理盐水液面浸没待检肉样即可；
第五步，30min后，将漏斗从水浴锅中取出，打开软管末端的夹子，将软管中的液体收集 到离心管中；
第六步，将上述离心管置于离心机中500g离心5min或自然沉淀20 30min后，弃上
清，取沉渣置于光学显微镜下镜检。若镜检发现旋毛虫幼虫，则判定该肉样为旋毛虫阳性肉样；若镜检未发现旋毛虫 幼虫，则需再收集2次分离液体，连续3次收集结果均为阴性时，则可判定该肉样不含有旋 毛虫成囊前期幼虫。由于成囊前期感染性幼虫具有向温移行的生理特征，利用此特性可将待检肉样中 的成囊前期感染性幼虫直接分离出来，从而实现对成囊前期感染性幼虫的检疫。本发明的优点在于规范了对肉类中成囊前期幼虫检疫的操作技术及要求，为保证 肉类食品安全、旋毛虫病的预防提供了一种新的检疫方法，在很大程度上弥补了现行肉类 旋毛虫检疫方法的不足，与现有检测方法联用可使肉类旋毛虫的检疫更为全面，检疫结果 更加可靠，对于保证肉类食品安全、保障人民身体健康和国际肉类贸易均具有重要意义。本 发明所涉及旋毛虫成囊前期幼虫分离方法还可作为旋毛虫成囊前期幼虫收集方法，可从旋 毛虫感染动物模型中分离出成囊前期幼虫，为科研提供旋毛虫特定生长阶段的幼虫。本发明的有益效果主要体现在
1、本发明所使用的分离装置取材方便，制作简单，造价低廉，适合在各级检疫部门推广 普及；
2、本发明所涉及肉类中旋毛虫成囊前期幼虫检疫方法原理简单，操作方便，易于掌
握；
3、本发明所涉及集样分离检疫法可同时对100份待检肉样进行检疫，大大提高了检疫
4效率；
4、本发明所涉及肉类中旋毛虫成囊前期幼虫检疫方法弥补了现行肉类旋毛虫检疫方 法的不足，与现行肉类旋毛虫检疫方法联用可使肉类旋毛虫的检疫更为全面，结果更加可
罪；
5、本发明所涉及肉类旋毛虫成囊前期幼虫分离方法尚可作为一种旋毛虫成囊前期幼 虫收集方法为科研提供旋毛虫特定生长时期的幼虫。
具体实施例方式术语定义
a、新生幼虫是指旋毛虫雌成虫有宿主肠道内刚产出的幼虫；
b、成囊前期幼虫旋毛虫新生幼虫侵入肠粘膜后随血流或淋巴侵入骨骼肌细胞后发 育，但还没有形成囊包的幼虫，即感染后5 26d在宿主骨骼肌内的幼虫；
c、成囊前期感染性幼虫对新宿主已有感染性的成囊前期幼虫，即感染后18 26d在 宿主骨骼肌内的幼虫；
d、成囊期幼虫侵入骨骼肌后形成完整囊包并具有感染性的旋毛虫幼虫，即感染后 26d至数年在宿主骨骼肌内的幼虫。本发明所述的肉类中旋毛虫成囊前期幼虫的检疫方法，包括下述步骤
第一步，从待检动物酮体的不同部位采集总重2g 5g的待检肉样，在洁净平皿中置 4°C预冷20min ；其目的是使肉样温度降低，增大温度差，有利于幼虫的分离；
第二步，取漏斗一只，将漏斗下端连接上20cm 30cm的橡胶软管，用夹子将软管末端 夹紧；取医用纱布折叠成4层(既可以使幼虫通过又能有效阻止肌纤维透过纱布块，避免肌 纤维过多而干扰幼虫检疫效果)后平铺在漏斗中，使用胶头滴管先将平铺的纱布块用生理 盐水润湿，之后向漏斗中缓慢加入适量生理盐水，加入量使生理盐水刚刚浸没纱布块底部 为宜；
第三步，将恒温水浴锅内的水温调整至37°C后，将带有橡胶软管的漏斗下部插入恒温 水浴锅中，保持水面低于纱布块底层2cm，以便在纱布块上下形成一个明显的温度梯度；
第四步，将第一步预冷后的待检肉样置于搅拌器中绞碎数次，每次5秒，使待检肉样被 完全绞碎为止；然后将其置于漏斗中的医用纱布块上，加样时应尽量使待检肉样处于纱布 块的中心位置，加入适量生理盐水，使生理盐水液面刚好完全浸没待检肉样即可；
第五步，开始计时此时，纱布块上方的待检肉样由于经过预冷而温度较低，纱布块下 方的生理盐水由于水浴锅的预热作用而接近37°C，这样就在纱布块的上下形成了明显的温 度梯度，由于成囊前期幼虫具有向温移行的生理特征，待检肉样中的旋毛虫成囊前期幼虫 将透过上冷下热的纱布块得以分离，旋毛虫幼虫钻过纱布块后将沉积在橡胶软管的下段； 分离过程中注意不要触动纱布块，避免断裂的肌纤维透过纱布块而影响检疫效果；30min 后，将漏斗从水浴锅中取出，打开橡胶软管末端的夹子，将橡胶软管中的液体收集到离心管 中；收集完成后立即将漏斗下端的橡胶软管夹紧，并有纱布块上方重新加入适量的生理盐 水，继续进行幼虫分离；
第六步，将上述收集有液体的离心管置于配套离心机中500g离心5min或自然沉淀 20 30min后，弃上清，取沉渣置于光学显微镜下镜检。
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若镜检发现旋毛虫幼虫，则判定该肉样为旋毛虫阳性肉样；若镜检未发现旋毛虫 幼虫，则需再收集2次分离液体，连续3次收集结果均为阴性时，则可判定该肉样不含有旋 毛虫成囊前期幼虫。对大批量肉类检测时，一次集样检疫的肉样份数可在10份到100份之间，根据具 体情况决定该组样品数量。对每头待检动物胴体分别从不同部位采集重约2g 5g的待检 肉样之后，将该组所有待检肉样放置一起进行检疫，若镜检发现旋毛虫幼虫，则提示该组待 检肉样中至少有1份为阳性肉样，必须按照事先的编号查找出该组样品对应的待检动物胴 体，并逐一进行单独分离检疫法检疫，以确定阳性肉样；若镜检未发现旋毛虫幼虫，则需再 收集2次分离液体，连续3次检疫结果均为阴性尚可判定该组待检肉样内不含旋毛虫成囊 前期幼虫，这样可以大大提高检测速度。本发明所使用的漏斗、橡胶软管、医用纱布块、胶头滴管、平皿、搅拌器和离心管均 可以重复使用，每次使用后清洗干净，即可重复使用。动物试验
选用健康雄性6周龄昆明小鼠，清洁级·Μ 毛}kiJrichinella ^irWi1S,Tl)为河南猪 源旋毛虫，由本专利申请单位用清洁级昆明小鼠传代保种，采用喂饲法感染，剖杀感染旋毛 虫40d以上的昆明小鼠，压片镜检肌肉中成囊期幼虫，计数后用感染有旋毛虫的肌肉喂饲 已禁食Id的空白昆明小鼠。将感染旋毛虫成囊期幼虫后18d的昆明小鼠剖杀，取肌肉进行 压片镜检，以确定其感染成功，此时该小鼠肌肉内旋毛虫幼虫即为旋毛虫成囊前期幼虫。取感染旋毛虫后18d的昆明小鼠肌肉1只，另取没有感染过旋毛虫的空白昆明小 鼠肌肉9只，分别剖杀，分别自每只小鼠胴体不同部位采集肌肉样本各2g。将10份小鼠肌 肉作为待检肉样，按照本发明所述步骤进行肉类旋毛虫成囊前期幼虫检疫逐一检疫后共 发现1份肉样为阳性，其余9份为阴性，与既定结果相符，证明本发明所涉及肉类中旋毛虫 成囊前期幼虫检疫方法可以用于肉类检疫，且检疫结果可靠。取20只小鼠随机分为2组(每组10只)，分别按20条/只、10条/只剂量经口感 染旋毛虫成囊期幼虫。感染后18d剖杀小鼠，将2组感染小鼠肌肉分别搅碎后混勻，各均分 为15等份，每份6g，每份肉样再等分为3份后依次用国际旋毛虫委员会推荐的消化法、猪旋 毛虫病诊断技术(GB/T 18642-2002)消化法及本发明所述的肉类旋毛虫成囊前期幼虫检疫 法进行检疫。另取20小鼠按5条/只剂量经口感染旋毛虫成囊期幼虫，感染后18d剖杀， 将小鼠肌肉搅碎后混勻，均分为30份，每份6g，每份肉样再等分为3份后依次用上述3种检 疫方法进行检疫结果发现，对于20条/只剂量感染后18d的15份小鼠肌肉，3种检疫方 法的幼虫检出率均为100% Cx2 = O. 000,P > 0. 05); 10条/只剂量感染后18d的15份小 鼠肌肉，3种方法的检出率依次为93. 33%，93. 33%及100% (x2=l. 645，P > 0. 05)；说明 3种不同检疫方法在10条/只和20条/只剂量感染组幼虫检出率的差异均无统计学意义， 检疫效果相当。而对于5条/只较低剂量感染组的30份感染后18d的小鼠肌肉，3种方法 的检出率依次为63. 33%，90%及100%(乂 2 = 18. 866,P < 0. 05)，检出率的差异具有统计学 意义，且以本发明最高。可以认为，在低剂量感染时，本发明所述的肉类中旋毛虫成囊前期 幼虫检疫法对旋毛虫成囊前期幼虫的检疫效果优于消化法。
权利要求
一种肉类中旋毛虫成囊前期幼虫的检疫方法，其特征在于包括下述步骤第一步，从待检动物酮体的不同部位采集总重2g～5g的待检肉样，在洁净平皿中置4℃预冷20min；第二步，取漏斗一个，将漏斗下端连接上软管，用夹子将软管末端夹紧；取医用纱布折叠成4层以上后平铺在漏斗中，先用生理盐水将纱布润湿，之后向漏斗中缓慢加入生理盐水，使其浸没纱布块底部即可；第三步，将恒温水浴锅温度调整至37℃后，将漏斗下部插入水浴锅中，保持水面低于纱布块底层2cm；第四步，将第一步预冷后的待检肉样置于搅拌器中绞碎后，置于漏斗中的医用纱布块上，加入生理盐水，使生理盐水液面浸没待检肉样即可；第五步，30min后，将漏斗从水浴锅中取出，打开软管末端的夹子，将软管中的液体收集到离心管中；第六步，将上述离心管置于离心机中500g离心5min或自然沉淀20～30min后，弃上清，取沉渣置于光学显微镜下镜检。
全文摘要
本发明公开了一种肉类中旋毛虫成囊前期幼虫的检疫方法，1、从待检动物胴体的不同部位采集肉样，置4℃预冷；2、将漏斗下端连接软管，用夹子将其末端夹紧；取医用纱布块平铺漏斗中，用生理盐水浸没纱布块；3、将漏斗下部插入37℃水浴锅中，保持水面低于纱布块底层2cm；4、将预冷后的待检肉样绞碎置于漏斗中的纱布块上，加入生理盐水；5、30min后，将漏斗取出，打开软管上夹子，将其中的液体收集到离心管中；6、将离心管中液体离心或沉淀后弃上清，取沉渣置于光学显微镜下镜检。本发明的优点在于利用成囊前期感染性幼虫具有向温移行的生理特征，将待检肉样中的成囊前期感染性幼虫直接分离出来，实现对成囊前期感染性幼虫的可靠检疫。
文档编号G01N1/28GK101943693SQ20101028318
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者姜鹏, 崔晶, 张玺, 李峰, 王中全, 王书伟, 王烨, 王莉 申请人:郑州大学