专利名称：基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物基因检测技术领域的检测方法，具体是一种基于毛细管 凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法。
背景技术：
高通量分析技术的发展为分子生物学中大量核酸分子的平行分析提供了一种有 效的途径，目前广泛应用于医疗诊断、食品安全监控、以及环境监测等众多领域中。基于DNA的聚合酶链式反应(PCR)是目前应用最为广泛的核酸分子分析技术。基 于DNA的PCR分析的特点在于它的特异性和灵敏性。目前高通量的检测方法主要是结合了 一个或几个常规复合PCR扩增方法和高通量的扩增产物检测方法，或者直接应用复合PCR 扩增方法进行检测。直接的复合PCR检测技术已经在成功的应用于许多领域中不同核酸分 子的同时扩增，但是其只能用于少量核酸分子(小于10个)的平行扩增分析。复合PCR技 术应用于更多不同核酸分子的高通量分析较难实现，主要是因为常规的复合PCR方法中存 在两个主要缺陷一是大量的引物同时存在于一个体系，容易引起非特异性的扩增；二是， 由于扩增效率的差异导致其中部分目标分子优先扩增。随着复合PCR中添加的引物对数增 加，以及扩增的循环数的增加，这种缺陷带来的限制会表现的更加明显。组合了复合PCR扩增和芯片或毛细管电泳技术的方法，可极大地提高核酸DNA分 子分析的通量。这种组合检测方法，通常的是在一个或几个复合PCR扩增后，应用高通量的 DNA芯片或毛细管电泳进行快速、自动的产物检测，这可以同时对大量的样本平行地进行小 型化、高通量和自动化分析。根据相关的报道，在l-2cm2的高密度芯片上可以形成大约IO6 个分析位点，数千个目标可以同时进行检测。但是，目前应用DNA芯片技术分析成本比较 高、操作步骤复杂、技术要求较高，而且大多数芯片具有目标特异性的特点，不同的应用领 域需要设计不同的芯片进行目标分析。此外，由于目标分子仍然采用复合PCR方法进行扩 增，扩增的通量必然受到复合PCR固有缺陷的限制，因此这种组合方法的广泛应用受到了 一定的限制。一些新的组合了高通量的目标分子扩增技术和快速、自动的产物分离技术的 方法成为目前高通量核酸DNA分子分析技术研究的重点。微滴PCROiiicrodroplet PCR)技术是一种在乳化剂中进行的新型的、高效的高通 量核酸DNA分子扩增技术。一般的，在微滴PCR中，单个DNA分子被分配到体积极小(0. 5fl 到0. 5nl的体积)的微滴中，这允许在1微升的乳化剂中形成大约107个反应平行的进行扩 增，消除了复合PCR的固有缺陷。提高了目标扩增的通量，同时减少了试剂和样品的消耗。 然而，在微滴PCR中使用大量不同的引物同时进行多目标分析时，仍然具有一定的限制，因 为在微滴形成的过程中，大量的引物的随机分配，使得每个微滴中的只含有相同的引物和 相应的目标DNA分子是不可能的。当许多不同的引物存在微小的微滴中进行PCR扩增时， 会产生类似于复合PCR扩增限制。因此，本发明建立了一种新的组合方法，首先应用一个或 几个复合PCR，利用带有通用尾巴序列的特异性引物进行少数几个循环的预扩增，预扩增的 产物两端分别会带有一段通用序列；随后在单一的微滴PCR方法中应用一对同通用序列尾巴互补的通用引物扩增所有的预扩增目标产物；最后，扩增PCR产物经过纯化后，应用毛细 管电泳进行自动分离检测。这种组合检测方法可实现对大量的目标DNA分子同时进行高通 量的扩增和检测。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于毛细管凝胶电泳检测的微滴 聚合酶链式反应分析方法，优化了 MPIC(multiplex Microdroplet PCR Implemented CGE, 基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法)方法反应的体系和条件，评估 了该方法的特异性和灵敏度，并在目前广为关注的转基因产品检测领域中应用本发明对样 品中转基因成分进行了分析，确定了该分析方法的灵活性和可应用性。本发明可做为生物 学研究中高通量DNA分子分析的一种手段，对多个DNA分子同时进行检测，提高了分析的通 量，极大的减少了宝贵的样品和试剂的消耗。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤第一步多重模板的合成将含有不同目标DNA分子的纯化DNA模板通过一个或 几个常规复合PCR应用目标特异性引物进行预扩增，产生含有通用序列尾巴的多重模板；所述的纯化DNA模板是指应用DNA提取试剂盒，从原材料中分离纯化的获得的用 于PCR扩增的基因组DNA。所述的目标特异性引物是指长度为43士6Nt的寡核苷酸链，由5’端的通用序列尾 巴和3’端目标特异性互补序列组成，其3’端的目标特异性序列部分与目标基因序列完全 互补或者相同，5’端的通用尾巴序列部分与通用引物序列相同。所述的通用引物是指长度为20Nt的寡核苷酸链，正、反向通用引物分别与目标特 异性引物的的5’端相同。所述的多重模板是指，通过复合PCR预扩增所产生的不同PCR产物的混合模板，其 产物的两端分别含有一段来自目标特异性引物的通用序列尾巴。第二步通用微滴PCR扩增在通用微滴PCR中，使用一对与通用序列尾巴互补的 通用引物在水油乳化剂中对纯化的复合PCR预扩产物进行微滴PCR扩增；所述的微滴是指，25摄氏度条件下，取1体积份的PCR反应混合液在1. 5分钟时间 段内逐滴加入到2体积份的油-表面活性剂混合物中，同时利用涡旋混合器进行混勻得到 水油乳化剂，该水油乳化剂中微滴的直径在1 8 μ M，每微升的水油乳化剂中包含3Χ IO6 到IXlO7个微滴。所述的水油乳化剂的组分及其含量为1体积份的水相和2体积份的油相，其中 的水相的组分为:1 XKOD-PIus-反应缓冲液、10g/L BSA、1.5mM MgS04、200yM dNTP、400nM 引物Uni-F/R、5. 2U KOD-Plus-DNA聚合酶、以及适量模板DNA分子；油相组分为Span80 4. 5% (v/v) ,Tween 80 0. 4% (v/v) ,Triton X-100 0. 05% (ν/ν)、矿物油 95. 05% (ν/ν)。所述的纯化的复合PCR预扩产物是指复合PCR预扩增完成后，应用PCR产物纯化 试剂盒纯化复合PCR预扩增产物。第三步毛细管凝胶电泳分析根据目标序列的大小不同，应用毛细管凝胶电泳 对纯化的微滴PCR扩增产物进行自动分离检测。所述的纯化的微滴PCR扩增产物是指微滴PCR完成后，收集相同反应的水油乳化 4剂16000g，并在室温环境下离心5分钟后取下层包含微滴PCR扩增产物的水相，并用PCR产 物纯化试剂盒纯化该水相。所述的毛细管凝胶电泳自动分离检测是指使用毛细管凝胶电泳仪对纯化的微滴 PCR扩增产物进行分离检测。所述的毛细管凝胶电泳自动分离检测也指应用生产商提供的分析软件对毛细管 凝胶电泳结果进行分析，根据不同片段大小的目标产物对应不同的出峰时间来鉴定微滴 PCR扩增的产物。本发明设计了带有通用模板的目标特异性引物，引入了微滴PCR扩增方法忽然毛 细管凝胶电泳PCR产物自动分析方法，使不同片段大小的DNA模板分子可独立地在微滴平 行地进行扩增，极大地提高了分析的效率和通量。本发明中应用转基因作物的检测序列为 目标，优化了 MPIC方法的扩增体系和条件，明确了本发明的MPIC方法的灵活性和可适用 性。本发明的方法具有高的通量、高的特异性和灵敏度，可至少分析24个不同的DNA目标 序列，其检测灵敏度可达0. 1%。本发明所建立的高通量DNA分子分析方法提供了高通量、 准确和灵敏地多目标DNA分析，适应了当前分子生物学研究中对多目标DNA进行高通量分 析的要求，本发明不仅可应用于转基因成分的分析，也为其它领域中的DNA分子分析提供 一个新的高通量分析的选择。附件说明
图1为本发明方法示意图。图2为实施例MPIC方法同时分析24个不同的DNA目标的毛细管凝胶电泳图。图3为实施例检测不同基质中相同比例的24个转基因DNA目标序列的毛细管凝 胶电泳图。图4为实施例模拟DNA样品分析的毛细管凝胶电泳图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 应用本实施例的MPIC方法，检测来自14个转基因品系的24个DNA目 标序列。第一步植物材料及其DNA提取转基因作物NK603玉米、GA21玉米、Btl76玉米、Btll玉米、MIR604玉米、T25玉 米、TC1507 玉米、GTS40-3-2 大豆、RT73 油菜、M0N88913 棉花、M0N1445 棉花、M0N531 棉花、 0XY235油菜和华农一号番木瓜。非转基因作物小麦。植物DNA提取应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物 DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA，14种转基因的作物的DNA等量混合后同非转基因小麦DNA混合，每个转基因品系的DNA含量为1.6%，此混合DNA作为本实例中进一步实 验的模板。第二步通用引物设计本实施例中，选用几段非植物基因组DNA序列，首先对这几段DNA序列在一些公共 数据库(GenBank、EMBL、DDBJ)中进行序列比对，选择一段同植物DNA序列或一些转基因载 体序列相似性差的序列，使用引物设计软件primer 5.0进行引物设计。所述的通用引物的正向序列为GCCTTGTTCTACCATTACGC ；所述的通用引物的反向序列为TCAGCCACCTCTTTGTCCTT。第三步目标特异性引物设计目标特异性引物中目标特异性序列部分，可使用引物设计软件primer 5. 0进行 设计或参考相关的文献。本实施例中共设计或引用24对目标特异性引物，特异性扩增片段 的大小在128bp 610bp (包含通用序列)之间，扩增片段相互之间的序列长度最小差异为 5bp.第四步多重模板的合成应用相应的目标特异性引物，在3个常规复合PCR(每个复合PCR中应用8对目标 特异性引物)中预扩增14个纯化的转基因品系基因组DNA的混合模板(每个转基因品系 的DNA含量为1. 6% )。预扩增的PCR产物两端分别含有一段来自目标特异性引物的通用 序列尾巴，即为微滴PCR扩增的多重模板。复合PCR预扩增引物混合液见表1 ；复合PCR预 扩增体系见表2 ；复合PCR预扩增条件见表3。所述的14个纯化的转基因品系基因组DNA的混合模板是指应用上海市农业科学 院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物基因组DNA提取试剂盒从原材料中分离、纯化 基因组DNA。表1.复合PCR预扩增引物混合液
权利要求
一种基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征在于，包括如下步骤第一步多重模板的合成将含有不同目标DNA分子的纯化DNA模板通过一个或几个常规复合PCR应用目标特异性引物进行预扩增，产生含有通用序列尾巴的多重模板；第二步通用微滴PCR扩增在通用微滴PCR中，使用一对与通用序列尾巴互补的通用引物在水油乳化剂中对纯化的复合PCR预扩产物进行微滴PCR扩增；第三步毛细管凝胶电泳分析根据目标序列的大小不同，应用毛细管凝胶电泳对纯化的微滴PCR扩增产物进行自动分离检测。
2.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法， 其特征是，所述的纯化DNA模板是指应用DNA提取试剂盒，从原材料中分离纯化的获得的用 于PCR扩增的基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法， 其特征是，所述的目标特异性引物是指长度为43士6Nt的寡核苷酸链，由5’端的通用序列 尾巴和3’端目标特异性互补序列组成，其3’端的目标特异性序列部分与目标基因序列完 全互补或者相同，5’端的通用尾巴序列部分与通用引物序列相同。
4.根据权利要求3所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法， 其特征是，所述的通用引物是指长度为20Nt的寡核苷酸链，正、反向通用引物分别与目标 特异性引物的的5’端相同。
5.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法， 其特征是，所述的多重模板是指，通过复合PCR预扩增所产生的不同PCR产物的混合模板， 其产物的两端分别含有一段来自目标特异性引物的通用序列尾巴。
6.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法， 其特征是，所述的微滴是指，25摄氏度条件下，取1体积份的PCR反应混合液在1. 5分钟 内逐滴加入到2体积份的油-表面活性剂混合物中，同时利用涡旋混合器进行混勻得到水 油乳化剂，该水油乳化剂中微滴的直径在1 8μΜ，每微升的水油乳化剂中包含3X IO6到 IXlO7个微滴。
7.根据权利要求1或6所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析 方法，其特征是，所述的水油乳化剂的组分及其含量为1体积份的水相和2体积份的油相， 其中的水相的组分为1 XKOD-PIus-反应缓冲液、10g/L BSAU. 5mM MgS04、200yM dNTP、 400nM引物Uni-F/R、5. 2U K0D-Plus_DNA聚合酶、以及适量模板DNA分子；油相组分为 Span804. 5% (ν/ν)、Tween 80 0. 4% (ν/ν)、Triton X-100 0. 05% (v/v)、矿物油 95. 05% (ν/ν)。
8.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法， 其特征是，所述的PCR产物纯化是指应用PCR产物纯化试剂盒纯化复合PCR预扩增产物。
9.根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法， 其特征是，所述的纯化是指微滴PCR完成后，收集相同反应的水油乳化剂ieooog,并在室温 环境下离心处理5分钟后取下层包含微滴PCR扩增产物的水相，并用PCR产物纯化试剂盒 纯化该水相。
全文摘要
一种生物基因检测技术领域的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，通过多重模板的合成、通用微滴PCR扩增以及毛细管凝胶电泳分析得以实现。本发明可做为生物学研究中高通量DNA分子分析的一种手段，对多个DNA分子同时进行检测，提高了分析的通量，极大的减少了宝贵的样品和试剂的消耗。
文档编号G01N27/447GK101948926SQ20101029912
公开日2011年1月19日 申请日期2010年10月2日 优先权日2010年10月2日
发明者张大兵, 杨立桃, 郭金超 申请人:上海交通大学