专利名称：采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种试剂盒及其制备方法，具体来说是一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒。
背景技术：
舌形虫病是动物源性人兽共患病。全球已知舌形虫约118种，寄生人体的舌形虫主要有6个属10个种，分别为锯齿舌形虫(Linguatula serrata)、腕带蛇舌状虫(Armillifer armillatus)、尖吻蝮蛇舌状虫(A. aggkistrodontis)、串珠蛇舌状虫(A. moniliformis)、 大蛇舌状虫(A. grandis)、蜥虎赖利舌虫(Raillietiella hemidactyli)、辛辛那提莱佩舌虫(Leiperia cincinnalis)、口向尾蛇孑L 头舌虫(Poroc印halus crotali)、瑟皮舌虫 (P. Sebekia)和台湾孔头舌虫(P. taiwana)等。我国记载寄生人体的舌形虫有锯齿舌形虫、 尖吻蝮蛇舌状虫和台湾孔头舌虫。近年来，在我国台湾、浙江、广西都曾发现有多例尖吻蝮蛇舌状虫感染人体的报道。尽管舌形虫病例数较少，但由于有疫源地的存在，人们各异的进食习惯，为本病的感染建立了自然条件，人可成为尖吻蝮蛇舌状虫的中间宿主，主要是由于人们饮用了被感染性虫卵污染的水源或生饮蛇血、蛇胆而感染。表现为幼虫寄生人体肠系膜和肝、脾、肾等脏器，引起多脏器弥漫性损伤，特别是肝、脾等重要的脏器，危害十分重大。 加上近20年来舌形虫病疫区的扩大，新致病种的发现和致命病例的增加，使舌形虫这一罕见寄生虫病的诊断提出了新的挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒，所述的这种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒要解决现有技术中无法检测尖吻蝮蛇舌形虫病现症感染的方法。本发明提供了一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒，其特征在于包括兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体。进一步的，所述的试剂盒还包括硝酸纤维薄膜、1 %小牛血清白蛋白的PBST溶液、 PBST洗涤液、底物显色液、阳性和阴性对照样本组成和聚乙烯反应板。进一步的，所述的1 %小牛血清白蛋白的PBST溶液由小牛血清白蛋白和PBST洗涤液组成，所述的小牛血清白蛋白和PBST洗涤液的重量比为1 99。进一步的，所述的PBST洗涤液由氯化钠、KH2PO4, Na2HPO4, KC1、吐温-20和水组成，在配制PBST洗涤液的过程中，先配制一个基液的步骤，所述的基液由氯化钠、ΚΗ2Ρ04、 Na2HPO4^KCl和水组成，所述的氯化钠在所述的基液中的重量百分比为0. 8%，所述的KH2PO4 在所述的基液的重量百分比为0. 02%，所述的Na2HPO4在所述的基液中的重量百分比为 0. 29%,所述的KCl在所述的基液中的重量百分比为0. 02%，余量为水，配制好基液后，再加入吐温-20，每100ml中加入0. 5ml吐温-20，所述的PBST洗涤液的pH值为7. 4。
进一步的，所述的底物显色液由显色液A液、显色液B液和显色液C液组成，所述的显色液A液由3-3- 二氨基邻苯胺、氯化钠、KH2P04、Na2HP04、KCl和水组成，所述的3_3_ 二氨基邻苯胺在显色液A液中的重量百分比为0. 1%，所述的氯化钠在显色液A液中的重量百分比为0. 8 %，所述的KH2PO4在显色液A液中的重量百分比为0. 02 %，所述的Na2HPO4在显色液A液中的重量百分比为0.四％，所述的KCl在显色液A液中的重量百分比为0. 02%，余量为显色液A液中的水，所述的显色液B液由4-氯-1-萘酚、甲醇、氯化钠、KH2P04、Na2HP04、 KCl和水组成，所述的4-氯-1-萘酚在显色液B液中的重量百分比为0. 05%，所述的甲醇在显色液B液中的重量百分比为20%，所述的氯化钠在显色液B液中的重量百分比为0.8%， 所述的KH2PO4在显色液B液中的重量百分比为0. 02%，所述的Na2HPO4在显色液B液中的重量百分比为0.四％，所述的KCl在显色液B液中的重量百分比为0. 02%，余量为显色液 B液中的水；所述的显色液C液为过氧化氢的水溶液，所述的过氧化氢在水溶液中的重量百分比浓度为30%。进一步的，所述的底物显示液由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂为 4-氯-1-萘酚试剂，第二试剂为3，3’ - 二氨基联苯胺试剂。本发明还提供了上述的一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制备方法，包括一个制备抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原的步骤，一个制备兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的步骤，一个辣根过氧化物酶标记的抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的步骤。进一步的，在一个制备抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原的步骤中，从感染尖吻蝮蛇舌形虫虫卵3-5个月的小鼠腹部分离取幼虫，研磨后超声粉碎，制备幼虫可溶性抗原。进一步的，在一个制备兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的步骤中，用尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后对家兔进行3次免疫，收取兔血清，提取并纯化多抗。进一步的，在一个制备辣根过氧化物酶标记的抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的步骤中，采用ELISA法或双扩散法检测兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的效价，用过碘酸盐标记法标酶。进一步的，所述的阳性对照样本为尖吻蝮蛇舌形虫病病人血清，所述的阴性对照样本为正常人血清。本发明的一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的原理是将兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体(兔抗-Aag-IgG)点于硝酸纤维薄膜上，即特异性抗体结合到固相载体(硝酸纤维薄膜)上形成固相抗体，加待检血清，多抗与待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后加酶标记的抗尖吻蝮蛇舌形虫多克隆抗体 (HRP-Aag-IgG)，酶标记的抗体(HRP-Aag-IgG)与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。尖吻蝮蛇舌形虫幼虫抗原免疫家兔获得了抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体 (Aag-IgG)，用多抗检测小鼠血清中循环抗原，证实小鼠在感染后第2周即可检测到其体内的循环抗原，可作为检测现症感染、疗效考核、及药物筛选的依据。本发明用多克隆抗体(Aag-IgG)测定循环抗原具有以下优点⑴在抗体出现前， 已可测出抗原，有利于做出早期诊断。(2)循环抗原的含量与宿主体内寄生虫数量成正比，
5有助于预后的判定。(3)当体内虫体死亡后，循环抗原迅速消失，可用于疗效考核。本发明应用特异性抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫的多克隆抗体，研制dot-ELISA法检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原试剂盒。该试剂盒操作简便、快速；敏感性高、特异性强、重复性好。本发明适合医院检验科、疾病防控中心、社康中心、私人诊所等部门用于尖吻蝮蛇舌形虫病的临床现症感染的辅助诊断、疗效考核和药物筛选，具有很高的实用价值和可观的经济及社会效益。本发明的采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒应用尖吻蝮蛇舌形虫幼虫抗原免疫家兔获得多克隆抗体，检测患者血清中循环抗原(CAg)的斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)，可作为检测现症感染和疗效考核的依据，本发明建立的 dot-ELISA法敏感性高、特异性强，可实现尖吻蝮蛇舌形虫病的快速诊断、药物筛选和疗效考核。
图1是采用本发明的一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒检测尖吻蝮蛇舌形虫病的原理图。
具体实施例方式试剂和材料来源小牛血清白蛋白(购白上海生物制品所)。实施例1 一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒本发明提供了一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒包括兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体(兔抗-Aag-IgG)、辣根过氧化物酶标记的抗尖吻蝮蛇舌形虫多克隆抗体(HRP-Aag-IgG)、硝酸纤维薄膜、小牛血清白蛋白(BSA)的PBST溶液、PBST洗涤液、底物显色液、阳性和阴性对照样本组成和96孔聚乙烯反应板。进一步的，所述的1 %小牛血清白蛋白的PBST溶液由小牛血清白蛋白和PBST洗涤液组成，所述的小牛血清白蛋白和PBST洗涤液的重量比为1 99。进一步的，所述的PBST洗涤液由氯化钠、KH2P04、Nei2HP04、KC1、吐温-20和水组成， 在配制PBST洗涤液的过程中，包括一个先配制基液的步骤，所述的基液由氯化钠、KH2PO4, Na2HPO4^KCl和水组成，所述的氯化钠在所述的基液中的重量百分比为0. 8%，所述的KH2PO4 在所述的基液的重量百分比为0. 02%，所述的Na2HPO4在所述的基液中的重量百分比为 0. 29%,所述的KCl在所述的基液中的重量百分比为0. 02%，余量为水，配制好基液后，再加入吐温-20，每IOOml中加入0. 5ml吐温-20，所述的PBST洗涤液的PH值为7. 4。进一步的，所述的底物显色液由显色液A液、显色液B液和显色液C液组成，所述的显色液A液由3-3- 二氨基邻苯胺、氯化钠、KH2P04、Na2HP04、KCl和水组成，所述的3_3_ 二氨基邻苯胺在显色液A液中的重量百分比为0. 1%，所述的氯化钠在显色液A液中的重量百分比为0. 8 %，所述的KH2PO4在显色液A液中的重量百分比为0. 02 %，所述的Na2HPO4在显色液A液中的重量百分比为0.四％，所述的KCl在显色液A液中的重量百分比为0. 02%，余量为显色液A液中的水，所述的显色液B液由4-氯-1-萘酚、甲醇、氯化钠、KH2P04、Na2HP04、 KCl和水组成，所述的4-氯-1-萘酚在显色液B液中的重量百分比为0. 05%，所述的甲醇在显色液B液中的重量百分比为20%，所述的氯化钠在显色液B液中的重量百分比为0.8%，
6所述的KH2PO4在显色液B液中的重量百分比为0. 02%，所述的Na2HPO4在显色液B液中的重量百分比为0.四％，所述的KCl在显色液B液中的重量百分比为0. 02%，余量为显色液 B液中的水；所述的显色液C液为过氧化氢的水溶液，所述的过氧化氢在水溶液中的重量百分比浓度为30%。具体的，采用试剂盒进行检测时，取A液+B液等量混合后，每100毫升混合液中加C液40ul混合后使用。进一步的，所述的底物显示液由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂为 4-氯-1-萘酚试剂，第二试剂为3，3’ - 二氨基联苯胺试剂。使用时4-氯-1-萘酚试剂与 3，3’ - 二氨基联苯胺试剂等量混合使用。进一步的，所述的阳性对照样本为尖吻蝮蛇舌形虫病病人血清，所述的阴性对照样本为正常人血清。实施例2本发明还提供了一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制备方法，包括一个制备抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原的步骤，一个制备兔抗-Aag-IgG的步骤，一个酶标记的抗体(HRP-Aag-IgG)的步骤，还包括一个在试剂盒中放置硝酸纤维薄膜、小牛血清白蛋白(BSA)的PBST溶液、PBST洗涤液、底物显色液、阳性对照样本、阴性对照样本、聚乙烯反应板的步骤。进一步的，在一个制备尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原的步骤中，从感染尖吻蝮蛇舌形虫虫卵3-5个月的小鼠腹部分离取幼虫，制备幼虫可溶性抗原。进一步的，在一个制备兔抗-Aag-IgG的步骤中，用尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原(AagA)与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后对家兔进行3次免疫，收取兔血清，纯化多抗(兔抗-Aag-IgG)。进一步的，在一个制备辣根过氧化物酶标记的抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的步骤中，采用ELISA法或双扩散法检测兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的效价，用过碘酸盐标记法标酶(HRP-兔抗-Aag-IgG)。具体的1.尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原的制备和兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼多克隆抗体 (Aag-IgG)的收集步骤如下从感染尖吻蝮蛇舌形虫虫卵4个月的小鼠腹部分离取幼虫，制备幼虫可溶性抗原，测得蛋白含量为7. 58mg/ml。用尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原(AagA) IOOyg与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后对家兔进行背多点免疫，4周后用AagA抗原与等体积弗氏不完全佐剂加强免疫一次，剂量同上。一共进行三次免疫。ELISA法测得家兔免疫后的抗体水平为 1 320000。采用盐析法纯化多抗(兔抗-Aag-IgG)，ELISA测得多抗的效价为1 80000， 双扩散法为1 128，经饱和硫酸胺提纯，用二乙氨基乙基纤维素(DEA^纤维素离子交换柱层析纯化，得到抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫的多克隆抗体(Aag-IgG)。(1)饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解， 室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调pH至7.8。(2)盐析吸取IOml兔血清(兔抗-PW-IgG)移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5. Oml ；继续缓慢搅拌30min ； 10000r/min离心15min ；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30min，同法离心；重复前一步1 2次；沉淀物溶于1. 5ml PBS (0. 01mol/L pH7. 2)或 Tris-HCl 缓冲液中。(3)脱盐将盐析样品过kphadex G_50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速lml/min。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHC03, lmmol/L EDTA溶液中煮lOmin，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋lOmin，冷至室温即可使用(并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4°C保存备用)。将盐析样品装入透析袋中，对50 100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析) 12 M小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂(碘化汞11. 5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后， 再加20% NaOH 50ml)检测，直至透析外液无黄色物形成为止。(4)蛋白质含量的测定(Pr) (mg/ml) = (1. 45X0D280-0. 74X0D260) X 稀释倍数；或(Pr) = 0D280X稀释倍数/32.酶标记兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼多克隆抗体(HRP-Aag-IgG)制备采用过碘酸盐标记法标酶(HRP-兔抗-PW-IgG)。所述的标记物的标记酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)。辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成khiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定^^1 氏碱。其操作步骤如下①将5mg HRP 溶于 0. 5ml 0. lmol/L NaHC03 溶液中；加 0. 5mll0mmol/L NaI04 溶液，混勻，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；②加0. 75ml 10. lmol/L Na2C03 混勻；③加入0. 75ml兔血清(多抗)，混勻；④称取kphadex G25干粉0. 3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用(避光)3小时或4°C过夜；⑤用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加V20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室温作用30min ；再加入3/20VNaBH4溶液，混勻，室温作用1小时(或4°C 过夜)；⑥将交联物过kphadex G200或kpharose 6B O. 5 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰；⑦酶结合物质量鉴定酶活性和抗体活性的测定，应用ELISA法、免疫扩散、 DAB-H202显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性；⑧HRP抗体结合物的保存加入等量甘油后，小量分装_20°C存放，防止反复冻融； 或加入等量60%甘油4°C保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性，必要时还可以冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。实施例3本发明的一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的操作步骤如下(原理如图1所示)a)将兔抗-Aag-IgG稀释成200 μ g/ml，用点样器吸取1 μ 1抗体于硝酸纤维薄膜上，室温包被10分钟。
b)封闭将包被好的膜片浸入小牛血清白蛋白(BSA)的PBST溶液。37°C，15 分钟。c)洗涤将封好的膜用用洗涤液洗3次，每次3分钟凉干，即为“快诊膜”。d)被检抗原“快诊膜”按方格剪下，光面向上，放入96孔聚乙烯反应板孔内，每孔加被检血清的血清100 μ 1，同时设空白(PBS)、阴性和阳性样品对照。370C Ih0e)洗涤同(3)f)酶标记HRP-Aag-IgG 将酶标抗体1 100稀释后，每孔加100 μ 1，37°C Ih0g)洗涤同(3)h)底物取底物显色液A液5ml、底物显色液B液5ml、底物显色液C液如1，混合后每个反应孔加IOOul，室温避光lOmin，蒸馏水终止反应。)判断标准根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量；斑点呈现黄兰色斑点判断为阳性，不出现颜色则为阴性。+++斑点呈深黄兰色++斑点呈黄兰色+斑点呈淡黄兰色-无可见斑点
权利要求
1.一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒，其特征在于包括兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体。
2.如权利要求1所述的一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒， 其特征在于还包括硝酸纤维薄膜、小牛血清白蛋白的PBST溶液、PBST洗涤液、底物显色液、阳性和阴性对照样本组成和聚乙烯反应板。
3.如权利要求1所述特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒，其特征在于所述的小牛血清白蛋白的PBST溶液由小牛血清白蛋白和PBST洗涤液组成，所述的小牛血清白蛋白和PBST洗涤液的重量比为1 99。
4.如权利要求1或3所述特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒，其特征在于所述的PBST洗涤液由氯化钠、KH2P04、Na2HP04、KCl、吐温-20和水组成，在配制PBST洗涤液的过程中，先配制一个基液的步骤，所述的基液由氯化钠、KH2PO4, Na2HPO4, KCl和水组成，所述的氯化钠在所述的基液中的重量百分比为0. 8%，所述的KH2PO4在所述的基液的重量百分比为0. 02%，所述的Na2HPO4在所述的基液中的重量百分比为0.四％，所述的KCl在所述的基液中的重量百分比为0. 02%，余量为水，配制好基液后，再加入吐温-20，每IOOml 中加入0. 5ml吐温-20，所述的PBST洗涤液的pH值为7. 4。
5.如权利要求2所述特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中的底物显色液由显色液A液、显色液B液和显色液C液组成，所述的显色液A液由3-3- 二氨基邻苯胺、氯化钠、KH2P04、Na2HP04、KCl和水组成，所述的3_3_ 二氨基邻苯胺在显色液A液中的重量百分比为0. 1%，所述的氯化钠在显色液A液中的重量百分比为0. 8%，所述的KH2PO4在显色液A液中的重量百分比为0. 02%，所述的Na2HPO4在显色液 A液中的重量百分比为0.四％，所述的KCl在显色液A液中的重量百分比为0. 02%，余量为显色液A液中的水，所述的显色液B液由4-氯-1-萘酚、甲醇、氯化钠、KH2P04、Na2HP04、KCl 和水组成，所述的4-氯-1-萘酚在显色液B液中的重量百分比为0. 05%，所述的甲醇在显色液B液中的重量百分比为20%，所述的氯化钠在显色液B液中的重量百分比为0.8%， 所述的KH2PO4在显色液B液中的重量百分比为0. 02%，所述的Na2HPO4在显色液B液中的重量百分比为0.四％，所述的KCl在显色液B液中的重量百分比为0. 02%，余量为显色液 B液中的水；所述的显色液C液为过氧化氢的水溶液，所述的过氧化氢在水溶液中的重量百分比浓度为30%。
6.如权利要求2所述的特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于所述的底物显示液由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂为4-氯-1-萘酚试剂，第二试剂为3，3’ - 二氨基联苯胺试剂。
7.权利要求1所述的特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制备方法， 其特征在于包括一个制备抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原的步骤，一个制备兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的步骤，一个辣根过氧化物酶标记的抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的步骤。
8.如权利要求7所述的一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于在一个制备抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原的步骤中，从感染尖吻蝮蛇舌形虫虫卵3-5个月的小鼠腹部分离取幼虫，研磨后超声粉碎，制备幼虫可溶性抗原。
9.如权利要求7所述的一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于在一个制备兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的步骤中，用尖吻蝮蛇舌形虫幼虫可溶性抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后对家兔进行3次免疫，收取兔血清，提取并纯化多抗。
10.如权利要求7所述的一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于在一个辣根过氧化物酶标记的抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的步骤中，采用ELISA法或双扩散法检测兔抗尖吻蝮蛇舌形虫幼虫多克隆抗体的效价， 用过碘酸盐标记法标酶。
11.如权利要求7所述的一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于所述的阳性对照样本为尖吻蝮蛇舌形虫病病人血清，所述的阴性对照样本为正常人血清。
全文摘要
本发明提供了一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒，包括兔抗-Aag-IgG、酶标记的抗体(HRP-Aag-IgG)、硝酸纤维薄膜、1％小牛血清白蛋白的PBST溶液、PBST洗涤液、底物显色液、阳性和阴性对照样本组成和聚乙烯反应板。本发明还提供了一种采用特异性多抗检测尖吻蝮蛇舌形虫循环抗原的试剂盒的制备方法。本发明采用多克隆抗体测定循环抗原有利于做出早期诊断，有助于预后的判定。当体内虫体死亡后，循环抗原迅速消失，可用于疗效考核。本发明的试剂盒敏感性高、特异性强，可实现尖吻蝮蛇舌形虫病的快速诊断、药物筛选和疗效考核。
文档编号G01N33/544GK102288754SQ20101050238
公开日2011年12月21日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者周晓农, 张永年, 李 浩, 陈家旭, 陈韶红 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所