专利名称：检测氯霉素的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化学发光试剂盒及其测试方法，特别是检测动物组织、尿液、饲料等样本中氯霉素残留量的磁颗粒化学发光检测试剂盒。
背景技术：
氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是应用广泛的抗菌素，在畜禽疾病控制和治疗中起到了重要作用。但由于氯霉素存在严重的副作用，能抑制骨髓细胞内线粒体的蛋白质合成，造成骨髓细胞和肝细胞的毒性，从而引起人的再生性障碍性贫血，粒细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰婴综合症等疾病，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。2002年12月中国农业部公告第235号文规定，氯霉素及其盐、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品动物的所有可食组织中不得检出。但由于氯霉素价格便宜且为广谱抗生素，违法使用仍很普遍。因此加强对动物性食品中氯霉素的残留检测是非常必要的。目前，主要采用液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、酶联免疫法(ELISA)和微生物法等方法用于动物源性食品中氯霉素残留检测。1、气相色谱-质谱法(GC-MS)灵敏度很高，假阳性率低。该方法的主要缺点是样品需要衍生化这样复杂的前期处理。虽然经过衍生化处理的样品能在质谱中给出更多的结构信息，但是衍生化会产生多个不同的产物并导致样品的部分丢失，造成实验结果的偏差。2、液相色谱-质谱法(LC-MQ，样品不需要衍生化处理，可对尿液、血液、肝脏、毛发和眼球样品进行检测。该方法对氯霉素的最低检测限达到0. 007 0. 100 μ g/kg，LC-MS/ MS联用，可进一步提高信噪比，所以可用于对阳性结果的确认手段。但是，无论LC-MS还是 LC-MS/MS，仪器检测法与GC-MS—样，并未能解决仪器造价昂贵，操作步骤繁琐，样本前处理复杂，对操作人员专业素养要求高等问题。3、酶联免疫法(ELISA)是20世纪70年代出现，用于微量物质的检测，最早应用于传染病、肿瘤标志物、激素水平等临床检测，90年代开始在我国食品安全检测领域推广应用，目前依托ELISA技术的试剂盒、试纸条已经成为食品安全快速检测领域的主导产品，同时也是我公司研发和销售的主要产品类型。酶联免疫检测法基于抗原-抗体的特异性反应，检测灵敏度较高、特异性较好，技术操作简易，容易掌握，确实解决了大量的以前难以解决的许多微量小分子物质如抗生素、激素、农药残留等的定性、定量分析工作，对食品安全快速检测技术的发展起到了积极的促进作用。但是，ELISA方法存在许多自身无法克服的缺陷，主要表现在1)非均相反应检测过程中为分离游离物与结合物，需要多步洗板过程，耗时费力，难以提高操作的自动化程度。2)酶催化反应借助酶催化底物显色，测定反应液吸光度值。反应的时间与温度对酶活力存在较大影响，试剂稳定性差。4、微生物检测法虽然经济、操作简便，但在样本中有其他微生物抑制剂存在时，其灵敏度和特异性受到限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种氯霉素检测试剂盒，采用该试剂盒进行氯霉素的检测时不仅具备较高的灵敏度，特异性，而且具有较高的反应速度。本发明的另一个目的在于提供一种氯霉素的测试方法，该方法操作简单，灵敏度高，特异性好。实现上述目的，本发明提供一种氯霉素检测试剂盒，其包含的主要试剂有发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。所述的分离试剂是包被有羊抗FITC抗体的顺磁性纳米微珠。所述的顺磁性纳米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基团的微珠，用于包被羊抗FITC单克隆抗体，其内芯是!^e3O4或Y -Fe2O3，使得微珠具有顺磁性。所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的氯霉素半抗原。所述的异鲁米诺衍生物是 ABEI、AHEI 或 ABEN。所述的试剂盒还包括标准品，质控品和浓缩洗液。所述的荧光素标记物是FITC标记氯霉素单克隆抗体。本发明还提供一种利用试剂盒检测氯霉素的方法，包括下列步骤1)分别吸取20 μ 1-100 μ 1标准品或样本，然后加入20 μ 1-100 μ 1发光标记物，再加20 μ 1-100 μ 1荧光素标记物，充分混勻后，37°C温育15min ；2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C 温育5min ；3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500 μ 1冲洗复合物沉淀；4)上述清洗步骤重复2-4次；5) 4)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟 3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU 集合标准曲线法计算氯霉素的浓度。所述的发光底物的主要成分是NaOH和Η202。本发明中分析测试方法所用的分析仪是包括电源电路、自动注射泵1和2、测量室、发光室、光电倍增管计数器和输出系统，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果储存和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存、更新功能，两点自动修正标准曲线， 所采用的系统是CI-2008系统。本发明所述的分离试剂是包被羊抗FITC单克隆抗体，其表面基团的含量是 0. 1-0. 3eqm/g,含量是其保存时是溶于含有 0. 1-0. 5 % BSA, 0. 01-0. 1 % Tween-20，0. 02 % NaN3, pH7. 2-7. 6的PBS缓冲液中。所述的FITC是异硫氰酸荧光素。所述百分含量为质量
百分含量。所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物ABEI、AHEI或ABEN标记的氯霉素半抗原标记其保存于含ρΗ7· 2-7. 6,0. 1-0. 3% Tween-20,0. 01% NaN3的PBS缓冲液中。所述百分含
量是质量百分含量。所述的荧光素标记物是FITC标记的氯霉素单克隆抗体，其保存于pH7. 2-7. 6，含5-8% BSA, 0. 02-0. 04% NaN3的PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。氯霉素标准品溶液(Ong/ml，0.025ng/ml，0. 05ng/ml，0. 15ng/ml，0. 45ng/ml， 1. 35ng/ml)，标准品稀释液为ρΗ7· 4,0. 03% NaN3,0. 05mol/L TRIS缓冲液。所述百分含量
为质量百分含量。氯霉素质控品溶液浓度分别为0. 02ng/ml，1. Ong/ml，质控品稀释液pH7. 4， 0. 03% NaN3,0. 05mol/LTRIS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。所述的浓缩洗液为PH7. 2-7. 8,0. 2-0. 4 % Tween-20,0. 02-0. 04 % NaN3, 0. 1-0. 2mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。本发明的有益效果如下1)本发明试剂盒可特异性检测氯霉素，对其他药物无交叉。2)本发明试剂盒的灵敏度较高，对氯霉素的检测灵敏度可达25ng/ml。3)本发明试剂盒的检测快捷，检测时间低于20min。
具体实施例方式实施例一试剂盒具体组分的制备1)半抗原的合成将氯霉素药物分子结构中的醇羟基采用戊二酸酐酰化得到的氯霉素半抗原。2)免疫原的制备将氯霉素半抗原与甲状腺蛋白采用水溶性碳化二亚胺法进行偶联都到免疫原。3)单克隆抗体的制备动物免疫以免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，免疫剂量为100 μ g/只，使其产生抗血清。细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9 1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，得到单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成1 X 109个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0. 5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5 X 107个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到单克隆抗体。4)发光标记物的制备取4. 5mmol/L ABEI，溶于4ml蒸馏水中，5. Ommol/L N-羟基琥珀酰亚胺溶于0. 5ml N，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室温反应3-4h。取上述制备的氯霉素半抗原15mg， 用pH7. 4PBS调节体积到1. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室温反应过夜， 过G-25凝胶柱纯化。5)荧光标记物制备用0. 025mol/L, pH9. O的碳酸盐缓冲液将氯霉素单克隆抗体稀释成质量百分比浓度；根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0. Olmg FITC，用分析天平准确称取所需的FITC粉末。用同一缓冲液将FITC配成0. lmg/ml的溶液，按上述抗体溶液体积的3-5倍，混入FITC稀释液；在4 。C避光条件下电磁搅拌、标记30-4 ；将标记溶液 3000r/min,室温离心20min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再pH7. 4的PBS缓冲液透析2-3天，期间至少更换透析液3次；取透析过夜的标记物，通过kphadexG-25或G-50 柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光标记物进行鉴定，分装，贮存于4°C冰箱中。6)分离试剂制备a)磁珠活化表面-COOH基团的磁珠(购于DYNAL，粒径为2. 8 μ m)，其含量是0. 15eq/g;取 100 μ 1 磁珠，用 100 μ 1 25mmol/L, ρΗ5· 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗涤两次，磁分离后移除上清；使用前，用4°C贮存的25mmol/L MES溶液分别配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50 μ 1新配置的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混勻，室温活化30min ； 离心管置于磁分离架上磁分离鈿in，移除上清，加入100μ l，25mmol/L，pH5. 0，MES清洗2-3 次后即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶联羊抗FITC单克隆抗体将50-100 μ g 羊抗 FITC 单克隆抗体溶解到 60 μ 1，25mmol/L，ρΗ5· OMES 中，用所述MES溶液调节总体积至100 μ 1，轻柔混勻磁珠与抗体；室温条件下至少偶联30min 或4°C偶联池，该期间可利用涡旋仪使磁珠保持混勻状态；离心管置于磁分离架上磁分离 3-5min，移除上清；为了淬灭未反应的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反应15min或 100 μ 1，ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封闭磁珠；用 100μ 1，0· 1-0. 3% BSA, 0. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封闭好的磁珠3_5次；最后将磁珠复溶于含0. 1-0. 5% BSA,
0.01-0. 1% Tween-20,0. 02% NaN3 的 PBS 或 TRIS 缓冲液中，2_8°C保藏。实施例二试剂盒的组建组建检测氯霉素的磁颗粒直接竞争化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分FITC标记的氯霉素单克隆抗体的荧光标记物ABEI标记的氯霉素半抗原的发光标记物表面包被羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠的分离试剂氯霉素标准品溶液(Ong/ml，0.025ng/ml，0. 05ng/ml，0. 15ng/ml，0. 45ng/ml，
1.35ng/ml)，标准品稀释液为ρΗ7· 4，含有0. 03% NaN3,0. 05mol/LTRIS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。氯霉素质控品溶液浓度分别为0. 02ng/ml, 1. Ong/ml，质控品稀释液pH7. 4，含有 0. 03% NaN3,0. 05mol/LTRIS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。浓缩洗液为ρΗ7· 6,0. 4% Tween-20,0. 02% NaN3,0. lmol/L PBS 缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。实施例三实际样品中氯霉素的检测1、样本前处理(一)鸡肉组织前处理方法用均质器均质组织样本；称取3. 0士0. 05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入 6ml乙酸乙酯，用振荡器振荡10min，3000g以上，室温O0_25°C )离心IOmin ；移取上层有机相(约相当于2g的样本)至IOml干净玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加Iml复溶工作液，用涡旋仪涡动Imin转入2ml离心管中，3000g以上，室温Q0-25°C )离心15min ；除去上层有机相，取下层50 μ 1用于分析。样品稀释倍数0. 5。( 二)鸡血样本前处理方法用加有肝素钠Q0-30单位/ml血)的离心管采集鸡血样本(建议采血注射器也用肝素钠润洗)，血样本室温静置lh，待析出血浆后，3000g以上，15°C离心IOmin ；取Iml血浆至IOml聚苯乙烯离心管中，加2ml乙酸乙酯振荡Imin ；室温Q0_25°C )下静置待水相与有机相完全分层或3000g以上，室温Q0-25°C )离心5min ；移取上层所有机相至IOml干净玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml复溶工作液，用涡旋仪涡动aiiin溶解干燥的残留物；取50μ 1用于分析，血清血浆样品稀释倍数1(三)尿液前处理方法将尿液于3000g以上，室温Q0-25°C )离心5min，直至尿液样本清亮；移取2ml清亮尿液样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加0. 5ml pH4. 8IOOmM醋酸钠缓冲液混合；加40 μ 1 葡萄糖苷酸酶(Merck，Art.No.4114)至稀释的尿液样本中，置37°C水解至少池(或过夜)， 取出室温00-25°C )放置；该溶液恢复至室温00-25°C )后加入8ml乙酸乙酯混合Imin ； 3000g以上，室温Q0-25°C)离心101^11，取鈿1上层液体至IOml干燥玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml复溶工作液，涡动aiiin溶解干燥的残留物；取50 μ 1用于分析，尿液样品稀释倍数1(四)肠衣前处理方法用均质器均质样本；称取1. 0士0. 05g均质后的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入IOml乙酸乙酯，振荡10min，3000g以上，室温O0_25°C )离心IOmin ；取5ml上层有机相 (相当于0. 5g的样本)至IOml干净玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml 正己烷，涡动30s，再加0. 5ml复溶工作液强烈振荡Imin转入2ml离心管中，3000g以上，室温Q0-25°C)离心5min ；除去上层有机相，取下层50 μ 1用于分析，肠衣样品稀释倍数1。(五)牛奶样本前处理方法取牛奶样本，3000g以上，10°C离心lOmin，吸除上层脂肪；取5ml去除脂肪牛奶样本至IOml聚苯乙烯离心管中，加入150 μ 1 C液出现沉淀，振荡15s，再加入150 μ 1 D液， 振荡Imin充分混合；3000g以上，15°C离心lOmin，移取上层液；用复溶工作液以等体积稀释上层液(1份上层液+1份复溶工作液)；取50 μ 1用于分析，样品稀释倍数2。(六)蛋类前处理方法用均质器低速均质鸡蛋样本，使得蛋清和蛋黄充分混合；称取3. O 士0. 05g均质后的蛋样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加9ml乙腈-水溶液，振荡10min，3000g以上，室温 (20-250C )离心IOmin ；取3ml上层液与3ml蒸馏水充分混合，加入4. 5ml乙酸乙酯，充分混合5min，3000g以上，室温O0_25°C )离心IOmin ；移取上层有机相至IOml干净玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥残留物，再加入2ml复溶工作液，用涡旋仪充分混合Imin转入細1离心管中，3000g以上，室温 (20-25°C )离心5min ；除去上层有机相，取下层50 μ 1用于分析，蛋类样品稀释倍数2。2、用试剂盒检测与结果分析分别吸取20 μ 1-100 μ 1标准品或样本，然后加入20 μ 1-100 μ 1发光标记物，再加 20μ 1-100μ 1荧光素标记物，充分混勻后，37°C温育15min ；加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C温育5min ；用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500 μ 1冲洗复合物沉淀；所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3- 后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中氯霉素的含量与 RLU成一定比例关系，可以通过RLU结合标准曲线法计算氯霉素的浓度。激发底物1是NaOH，激发底物2是H202。底物装载前，用蒸馏水清洗底物泵10_20 遍，排空管道内残存的水迹后，再将相应的底物直接放入仪器内，将泵管插入底物瓶中；用底物冲洗管道5次，并测定底物的RLU值，正常情况下，底物的RLU值不应超过1200。若超过1200，需重新用蒸馏水对管道和底物泵进行更多次清洗，直至空白值降至合理范围内。若超过三天不做实验，需卸载底物瓶，并盖上盖子，以防蒸发。随后用蒸馏水清洗管道，并排空，以免强碱溶液腐蚀底物泵。本发明采用6 个氯霉素标准品(Ong/ml，0. 025ng/ml，0. 05ng/ml，0. 15ng/ml， 0. 45ng/ml, 1. 35ng/ml)进行曲线测绘。仪器根据所述方法检测得到一条RLU值与氯霉素浓度相关的定标曲线，此后测量中，每一个样本中的氯霉素浓度与标准曲线相比较得出样本
中的氯霉素含量。实施例四试剂盒质量的测定1、试剂盒的灵敏度试剂盒灵敏度的定义为测定20次零标准品，测定的平均值加上3倍标准差。该试剂盒的灵敏度为0. 025ng/ml。2、样本的准确度和精密度准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒准确度常用回收率表示。精密度又称可重复性，常用变异系数表示。按照实施例三的样本提取方法，以0. 05ng/g(ml)、0. lng/g(ml)两个浓度的氯霉素分别对鸡肉、鸡血、猪尿、肠衣样本进行添加，以0. lng/g(ml)、0. 2ng/g(ml)两个浓度的氯霉素分别对牛奶、鸡蛋样本进行添加回收，每种样本每个浓度各4个平行，用三批试剂盒进行测定，计算样本的平均回收率及精密度。实验结果见下表。表1准确度和精密度测定ng/g (ml)
权利要求
1.一种检测氯霉素的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的分离试剂是包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的顺磁性纳米微珠是里面包覆有 Fe3O4或γ -Fe2O3，表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基团的微珠。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的氯霉素半抗原。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的异鲁米诺发光标记物是ABEI、 AHEI 或 ABEN。
6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括标准液、 质控品和浓缩洗液。
7.根据权利要求1-3之一所述的试剂盒，其特征在于所述的荧光素标记物是FITC标记的氯霉素单克隆抗体。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测氯霉素的方法，包括下列步骤1)分别吸取20μ 1-100 μ 1标准品或样本，然后加入20 μ 1-100 μ 1发光标记物，再加 20 μ 1-100 μ 1荧光素标记物，充分混勻后，37°C温育15min ；2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μ1，混勻后在37°C温育 5min ；3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μ 1冲洗复合物沉淀；4)上述清洗步骤重复2-4次；5)4)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3- 后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中氯霉素的含量与RLU成一定比例关系，可以通过 RLU集合标准曲线法计算氯霉素的浓度。
全文摘要
本发明涉及检测氯霉素的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。发光标记物是异鲁米诺发光标记物标记的氯霉素半抗原，荧光标记物是指荧光素或其衍生物标记的氯霉素单克隆抗体，分离试剂是指包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。本发明还涉及一种采用所述的试剂盒检测动物源性食品中氯霉素的方法，本方法对氯霉素检测具备较高的灵敏度、特异性和较快的检测速度。
文档编号G01N21/76GK102565031SQ20101059023
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者万宇平, 何丽霞, 何方洋, 张禹, 扶胜, 朱亮, 罗晓琴, 赵赫, 郭旭 申请人:北京勤邦生物技术有限公司