专利名称：安定elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测安定残留量的试剂盒，特别是检测组织、 饲料、尿液中安定药物残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA(Enzyme Linked Immunosorbnent Assay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术。( 二)背景技术安定(Diaz印am)是一种镇静药，在畜禽中应用日益广泛，可以增加动物体重并可保证畜禽在长途运输中不会产生应激反应。但动物大量摄取安定会导致药物残留于食品而被人体吸收，大剂量可产生中枢神经抑制。长期服用可产生依赖性或成瘾， 突然停药可产生停药反应，表现为抑郁、精神激动、失眠等。我国和欧盟等国都禁止在畜牧业中应用。因此，检测安定药物在动物性食品中的残留量非常重要。目前，常用于安定残留检测的方法主要有高效液相色谱分析法(HPLC)，该方法的前处理过程繁琐、检测费用较高，不宜用于大量样本筛查，推广使用受到限制。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的安定药物残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中安定药物残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种安定检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被安定偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、安定抗体工作液、 底物显色液A液、底物显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜； 标准品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE 塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被安定药物偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗1瓶，12ml ；安定抗体工作液1 瓶，7ml ；底物显色液A液1瓶，7ml ；底物显色液B液1瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶，40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml。将14瓶试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的残留物安定将和酶标板微孔条上预包被的安定偶联抗原竞争抗安定抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含
3安定药物的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中安定药物的残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度动物组织样本的最低检测限为Iyg/ kg、饲料样本的最低检测限为1(^8/1^;尿液样本的最低检测限为148/1;组织样本的回收率为75% 士 10%;饲料样本的回收率为75% 士 10%;尿液样本的回收率为80% 士 10%; 相对于其他安定药物检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、氮气吹干装置、涡旋仪、离心机、振荡机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于安定药物残留量的检测。
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图fe为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图恥为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图5c为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图5d为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被安定偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条O)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明塑料试剂瓶( 用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶( 用于封装50ml 浓缩复溶液；白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装 7ml终止液，红色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装7ml安定抗体工作液，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)， 50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(1 ，7ml终止液瓶位(12)，7ml安定抗体工作液瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶位(15)，7种Iml/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。
具体实施方式
一、样本的前处理1.配液配液1 :0. IM氢氧化钠溶液称取2. Og氢氧化钠，加去离子水溶解定溶至500ml。[0026]配液2:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释(1份2X浓缩复溶液+1 份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液3 洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2. (a)动物组织(肌肉、肝脏等)样本处理步骤取适量样本用勻浆机4000r/min以上勻浆Imin ；称取2. 0 士0. 05g勻浆物至50ml 聚苯乙烯离心管中，加入8ml0. IM氢氧化钠溶液，用振荡器剧烈振荡5min ；3000g以上，15°C 离心IOmin ；移取Iml上清液加入IOml正己烷，用振荡器振荡5min，3000g以上，15°C离心 5min ；取5ml上层正己烷相在50°C氮气流下完全干燥；用Iml稀释后的复溶液溶解残留物； 取50 μ 1用于分析。(b)尿液样本处理步骤取Iml清亮尿样于50ml离心管中加入細1 0. IM氢氧化钠溶液，振荡2 5min ；取 Iml混合液到另一离心管中加入IOml正己烷，振荡5min，3000g以上速度，15°C离心5min ； 取5ml上层正己烷相在50°C氮气流下完全干燥；取Iml稀释后的复溶液溶解残留物；取 50 μ 1用于分析。(c)饲料样本处理步骤取1 士0. 05g饲料于50ml离心管中加入Iml去离子水和:3ml 0. IM氢氧化钠溶液溶液涡动Imin再加入IOml正己烷，振荡lOmin，3000g以上速度，15°C离心IOmin ；取Iml上层正己烷相，用50°C氮气吹干；取Iml稀释后的复溶液溶解残留物。取50 μ 1用于分析。再按如下方法进行稀释配合料将样本提取液与稀释后的复溶液按1 9体积比进行稀释检测(1份样本提取液+9份稀释后的复溶液)二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温Q0-25°C )平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇勻。[0040]2、按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品工作液/样本溶液加标准品工作液/样本溶液50 μ 1到对应的微孔中，再加入抗体工作液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置于25°C避光环境中反应 30min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ 1/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头刺破)。7、加酶标二抗加入酶标二抗100 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置25°C 避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。8、显色加入底物显色液A液50 μ 1/孔，再加底物显色液B液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。9、测定加入终止液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与安定药物含量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(μ g/L)。 假设样本ι的吸光度值为0. 211，样本2的吸光度值为0. 785，标准液吸光度值分别是 0 μ g/L 为 2. 100 ；0. 1 μ g/L 为 1. 580 ；0. 2 μ g/L 为 1. 010 ；0. 4 μ g/L 为 0. 580 ；0. 8 μ g/L 为 0. 308 ； 1.6 μ g/L为0. 120。则样本1的浓度范围是0. 8 μ g/L_l. 6 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中安定药物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0. 2μ g/L-Ο. 4μ g/ L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中安定药物残留的浓度范围。2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X 100%
B0B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值BO-O μ g/L标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以安定标准品浓度(μ g/L)的半对数为横坐标， 绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中安定药物实际含量。四、测定前的注意事项1、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温Q0-25°C )会导致所有标准的OD值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需将其摇勻。4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2_8°C，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度G50/630nm)值小于
60. 5 (A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色10-15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
权利要求1.一种安定ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、 14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被安定偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、安定抗体工作液、底物显色液A液、底物显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE 塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被安定药物偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/ 瓶；酶标二抗1瓶，12ml ；安定抗体工作液1瓶，7ml ；底物显色液A液1瓶，7ml ；底物显色液 B液1瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶，40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测组织、饲料、尿液中安定残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、安定抗体工作液、7个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的安定药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗安定药物的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含安定药物的残留量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中残留物安定药物的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在组织、饲料、尿液中安定药物的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/558GK201993365SQ201020586589
公开日2011年9月28日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者何丽霞, 何方洋, 冯月君, 段盈盈, 王建霞, 罗贵昆, 赵正苗 申请人:北京勤邦生物技术有限公司