专利名称：诊断血栓形成倾向的方法
技术领域：
本发明涉及诊断血栓形成倾向的方法。
背景技术：
Goodwin等人(Goodwin等人Archives of Pathology and Laboratory Medicine 第126卷，第11期，1349-1366页)研究了蛋白S(PS)分析的技术和诊断方面及其在临床流行病学研究中的应用。蛋白S(PS)是由635个氨基酸组成的维生素K-依赖性血浆糖蛋白， 是蛋白C抗凝体系中的辅因子。蛋白S主要在肝脏中生成。遗传性PS缺乏症和静脉血栓症的相关性首先在1984年确定。很少有动脉血栓症与遗传性PS缺乏症相关的报道病例。蛋白S作为辅因子，其提高活化蛋白C(APC)在因子 Va和VIIIa的蛋白降解中的活性。在血浆中，60%到70%的PS通过羧基末端的结合位点(PS的类固醇结合球蛋白域)与C4结合蛋白(C4bBP，补体调节蛋白)非共价结合，结合相互作用的解离常数在纳摩尔范围内。这种结合亲合力预期PS的所有可利用的C4bBP结合位点会被填满。这种结合相互作用使得血浆中PS浓度的测定和解析变得复杂。C4bBP是具有2种异构体(Mr 540000 和590000)的多聚体蛋白。PS的抗凝活性取决于游离PS。与C4bBP β +结合的PS不具有 APC辅因子活性。蛋白S缺乏症可以是遗传性或获得性的。罕见的同型PS缺乏症病例与严重的新生儿暴发性紫癜有关，类似于同型蛋白C缺乏症。同样，类似于同型蛋白C缺乏症，PS缺乏症的生物化学证据表明流行率为约五百分之一。血栓症和止血标准化小组委员会国际协会(International Society for Thrombosis and Haemostasis Standardization Subcommittee)基于总 PS、游离 PS 的血浆浓度和APC辅因子活性定义了三种类型的遗传性PS缺乏症。通过游离和总PS抗原的低水平以及APC辅因子活性降低来确定I型PS缺乏症。II型PS缺乏症的特征在于总PS和游离PS抗原的正常水平和APC辅因子活性的低水平。III型PS缺乏症的特征在于正常到低水平的总PS、低的游离PS以及与C4bBP结合的PS的部分增加。大约三分之二的PS-缺乏症患者患有I型缺乏症，三分之一患有III型缺乏症，II型缺乏症是罕见的。已经通过免疫学和功能分析测定血衆PS的量。Faioni的综述(Faioni. Thromb Haemost 2001 ；86 :1139-1140)强调了在这种复杂分析物的测定中持续产生不确定性的长期存在的方法学问题。早期分析涉及通过多克隆电免疫分析(主要Laurell)测定总PS。通过二维空间免疫电泳法测定游离PS，或通过添加3. 75 %的聚乙二醇6000 (PEG)使C4bBP_PS 复合物在血浆中沉淀后测定上清液来测定游离PS。目前临床实验室具有许多可商购得到的多克隆酶联免疫吸附剂检测(ELISA)，其和PEG沉淀一起测定总PS和游离PS。尽管PEG沉淀是众所周知的不能再现的和耗时的，但仍是确认功能性PS测试和单克隆游离PS ELISA 的最高标准。近年来，不多的可商购得到的单克隆ELISA变得可利用，其精确地测定游离 PS。游离PS测试的唯一缺点是它们可能遗漏了罕见的II型PS缺乏症病例。在1996年，血栓症及止血法国际协会和世界卫生组织(WHO)的联合会议建议，对于PS缺乏症的诊断， 测定游离PS可能比测定总PS更有用。此外，因为可用的功能性分析缺乏特异性(主要归因于APC抗性)，1996年的该共识会议支持使用游离PS的免疫测定。PS的APC辅因子活性可在基于改性的活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT)和凝血酶原时间(PT)形式的分析中测定。在APTT 形式中，在纯化的APC和因子Va的存在下将稀释的患者血浆添加到PS-耗尽的血浆中。在 PT形式中，可以采取类似方法，或耗尽血浆中的天然血浆PC可通过Protac (来自南方铜斑蛇蛇毒(铜头蝮)的酶)活化。该功能性分析的缺点是由于高频率的假阳性结果(由于APC 抗性、因子V Leiden、高浓度凝血酶原、因子VIIIa和因子VIIa的存在导致的)导致的。狼疮样抑制剂也可以干扰，尽管这种作用通过该分析中所用患者血浆的稀释被最小化。使用更高浓度的附加的因子Va的分析较少受到APC抗性或因子V Leiden的存在的影响。血浆总PS浓度的正常范围的下限通常认为是合并的正常人血浆中观察到的浓度的65%。然而，单个实验室应为其使用从正常个体获得的血浆样品的分析制定特定的正常范围。女性的PS血衆浓度低于男性,绝经前女性的PS血衆浓度低于绝经后女性、怀孕女性以及摄取口服避孕药的女性，因此指示激素情况的重要作用。通常，PS水平随着女性年龄增加而增加，但在男性中几乎没有变化。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于评估血栓形成倾向的简单且可靠的方法。发明简述本发明涉及用于在患有HIV或患有全身性自身免疫疾病的受试者中诊断血栓形成倾向的方法，所述方法包括在由所述受试者获得的血样中测定具有活化蛋白C(APC)辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平。测定血样中具有APC辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平允许诊断由抑制蛋白S的APC辅因子活性的自身抗体引起的血栓形成倾向。通过比较具有APC辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平，例如通过计算具有APC辅因子活性的游离蛋白S/总蛋白S之比，可以获得基本上与蛋白S变化无关的标准值，所述蛋白S变化例如归因于维生素K缺乏症、肝脏疾病、怀孕、衰老……。然后该标准值提供自身免疫蛋白S缺乏症的可靠指示。通常，具有APC辅因子活性的游离蛋白S/总蛋白S之比是中和游离蛋白S的辅因子活性的抗蛋白S自身抗体存在的间接标记。低比率指示中和游离蛋白S的辅因子活性的抗蛋白S自身抗体的存在。本发明也涉及具有APC辅因子活性的游离蛋白S和总蛋白S作为自身免疫蛋白S缺乏症的指示剂的用途。通常所述比率可与参考值比较。所述参考值可从一组健康受试者中获得。通常所述受试者可以具有与获得待测试生物试样的受试者相比类似的性别、年龄、和/或体重指数。或者所述参考值可以从患有带结节性再生性增生的HIV或患有全身性自身免疫疾病的一组受试者中获得。本发明也涉及具有APC辅因子活性的游离蛋白S和总蛋白S作为自身免疫蛋白S 缺乏症的指示剂的用途。
本发明也涉及用于诊断受试者的自身免疫蛋白S缺乏症的方法，所述方法包括在由所述受试者获得的血样中测定具有活化蛋白C(APC)辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平。本发明的另一目的涉及试剂盒，其包含a)用于检测具有APC辅因子活性的游离蛋白S的装置；和b)用于检测总蛋白S的装置。发明详述术语“血栓形成倾向”是指倾向血栓形成的止血功能异常。本发明使用的术语“血样”是指为体外评估目的而获得的血样。血样的例子是全血样品、血浆或血清样品。本发明涉及用于在患有HIV或患有全身性自身免疫疾病的受试者中诊断血栓形成倾向的方法，所述方法包括在由所述受试者获得的血样中测定具有活化蛋白C(APC)辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平。在一个实施方式中，所述全身性自身免疫疾病是系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂抗体综合征、白塞氏(Behcet)病、普通易变型免疫缺陷(CVID)、病毒诱导的血栓形成前状态、 血栓性血小板减少性紫癜。已经表明获得性APC抗性与患有SLE患者中抗蛋白S自身抗体有关(Nojima等人 Thromb Res. 2009 Jan 6)。本发明也涉及具有APC辅因子活性的游离蛋白S和总蛋白S作为自身免疫蛋白S 缺乏症的指示剂的用途。本发明也涉及用于诊断受试者的自身免疫蛋白S缺乏症的方法，所述方法包括在由所述受试者获得的血样中测定具有活化蛋白C(APC)辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平。本发明方法可以和用于诊断受试者的血栓形成倾向或全身性自身免疫疾病的传统方法联合使用。通常医师也可以考虑用于现有方法的其他临床或病理参数来诊断血栓形成倾向或全身性自身免疫疾病。因此，使用本发明方法获得的结果可以与来自为诊断血栓形成倾向或全身性自身免疫疾病而进行的其他试验、分析或方法的结果比较和/或结合。 这种比较和/或结合可有助于提供更精确的诊断。在血样中测定具有APC辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平可通过本领域任何已知方法进行。可使用标准免疫诊断技术(包括免疫测定，例如竞争、直接反应、阵列芯片或夹层型测定)测定所述水平。这种测定包括但不限于，蛋白质印迹法；凝集试验； 酶标记和介导的免疫测定，例如ELISA ;生物素/抗生物素蛋白类型的测定；放射性免疫测定；免疫电泳法；免疫沉淀法；气相色谱法；高效液相色谱法(HPLC);尺寸排阻色谱法；固相亲和力法等。例如，可通过免疫学(例如可商购得到的Diagnostica Stago, France的 ASSERACHR0M 游离蛋白S检测)和功能性检测(例如可商购得到的Diagnostica Stago, France的STACLOT 蛋白S检测)测定具有APC辅因子活性的游离蛋白S水平。可在基于改性的活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)形式的检测中测定PS的APC 辅因子活性。
可通过免疫学(例如可商购得到的Diagnostica Stago,France的ASSERACHR0M 总蛋白S检测)测定总蛋白S水平。在一个具体实施方式
中，可用能够选择性地与具有APC辅因子活性的游离蛋白S 相互作用的结合配偶体(binding partner)测定具有APC辅因子活性的游离蛋白S水平。 所述结合配偶体可以与负责识别活化蛋白C的蛋白S的特定氨基酸结合。通常结合配偶体可以与蛋白S的Y-羧基谷氨酸域结合。该域参与蛋白S与APC的相互作用(Sailer等人 Blood. 2005 Jan I ；105(1) :122-30)。例如，所述结合配偶体可以是多克隆或单克隆的抗蛋白S抗体，或其片段或衍生物。在另一个实施例中，所述结合配偶体可以是适体(aptamer)。可根据已知方法通过将适当的抗原或抗原表位施用于例如选自猪、母牛、马、兔、 山羊、绵羊和小鼠等等的宿主动物产生本发明的多克隆抗体或其片段。本领域已知的多种佐剂可用于增加抗体的生产。尽管用于实施本发明的抗体可以是多克隆抗体，但优选单克隆抗体。可利用提供产生抗体分子的任何技术由培养基中的传代细胞系制备并分离本发明的单克隆抗体。用于制备并分离的技术包括但不限于最初由Kohler和Milstein(1975) 描述的杂交瘤技术 ’人B细胞杂交瘤技术(Cote等人，1983);和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，1985)。或者，描写用于产生单链抗体的技术(例如参见美国第4，946，778号专利)可以适用于制备单链抗体。用于实施本发明的抗体也包括片段，其包括但不限于F(ab' )2片段 (其可通过完整抗体分子的胃蛋白酶消化来产生)以及Fab片段(其可通过还原F(ab' )2 片段的二硫键来产生)。或者，可以构建Fab和/或scFv表达库以允许快速识别具有所需特异性的片段。例如，可以使用抗体的噬菌体展示。在这种方法中，在适合的噬菌体(例如 M13)的表面上表达单链Fv(ScFv)或Fab片段。简言之，去除已经用蛋白免疫的适合的宿主 (例如小鼠)的脾细胞。从产生对抗所述蛋白的所需抗体的那些细胞获得VL和VH链的编码区。然后这些编码区与噬菌体序列的末端融合。一旦所述噬菌体插入适合的载体(例如细菌)中，噬菌体即展示抗体片段。也可以通过本领域技术人员已知的组合方法提供抗体的噬菌体展示。然后由噬菌体展示的抗体片段可用作免疫测定的一部分。适体是在分子识别方面代表抗体的可替代物的一类分子。适体是能有效识别具有高亲和性和特异性的任何种类的靶分子的寡核苷酸或寡肽序列。可通过Tuerk C.和 Gold L. , 1990所描述的随机序列库的指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)分离这种配体。可通过 DNA 的组合化学合成获得随机序列库。在该库中，各成员是单一序列的最终化学改性的线性寡聚体。已在 Jayasena S. D. , 1999中评述了该类分子的可能的修饰、用途和优点。肽适体由通过平台式蛋白(例如大肠杆菌硫氧还蛋白A)展示的构象限制的抗体可变区构成，所述蛋白通过两种杂交方法选自组合库(Colas等人，1996)。上述检测可以包括结合配偶体(即抗体或适体)与固体支持物的结合。可用于实施本发明的固体支持物包括基底，例如硝化纤维(例如，以膜或微滴定孔形式)、聚氯乙烯 (例如，薄片或微滴定孔)、聚苯乙烯乳胶(例如，珠子或微滴定板)、聚偏氟乙烯、重氮化纸、 尼龙膜、活化珠、磁性响应珠等。可通过可检测分子或物质(例如荧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其他标签)标记本发明的结合配偶体(例如抗体或适体)。标签是通常(直接或间接地)提供信号的、本领域已知的。如本发明所使用的，对于抗体或适体而言，术语“标记的”旨在包括通过将可检测物质[例如放射性试剂或荧光基团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或靛菁绿(Cy5))]与抗体或适体偶联(即物理连接)来直接标记抗体或适体，以及通过与可检测物质的反应性间接标记探针或抗体。可通过本领域已知的任何方法用放射性分子标记本发明的抗体或适体。例如放射性分子包括但不限于用于闪烁法研究的放射性原子，例如1123、 1124、Inlll、Rel86、Rel88。在一个具体实施方式
中，ELISA法可适于测定血样中具有APC辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平，其中微滴定板的孔涂有针对具有APC辅因子活性的游离蛋白 S的一组抗体以及涂有能够检测总蛋白S的一组抗体。然后将血样加入涂层的孔中。在培养足以形成抗体-抗原复合物的时间后，洗涤平板以去除未结合部分并添加可检测地标记的二级结合分子。所述二级结合分子可以与任何捕获的样品标记蛋白反应，洗涤平板并使用本领域熟知方法检测二级结合分子的存在。在另一个具体实施方式
中，可通过阵列芯片测定血样中具有APC辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平。这种阵列技术允许在单个基底上同时进行大量实验，当用于生物学分析物时，通常称为生物芯片。阵列芯片的实例记载在国际专利文献W02007012885 和 Dupuy AM 等人(2005) > Weinberger SR 等人(2000)和 Jain KK 等人(2000)中。例如用于具有APC辅因子活性的游离蛋白S和用于总蛋白S的所述结合配偶体可以固定在所述阵列芯片的表面上。然后将由所述受试者获得的血样置于阵列芯片中。在培养足以形成复合物的时间后，洗涤阵列芯片以去除未结合部分。在第二步，用针对具有APC 辅因子活性的所述游离蛋白S和所述总蛋白S具有特异性的二级结合配偶体测定具有APC 辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平。在一个优选的实施方式中，所述结合配偶体是标记的，因此允许形成一组对于游离蛋白S或总蛋白S具有特异性的“斑点”(有色沉淀)。例如，可通过用特异性检测器分析所述阵列芯片中的斑点进行检测和量化。本发明的另一目的涉及试剂盒，其包含a)用于检测具有APC辅因子活性的游离蛋白S的装置；和b)用于检测总蛋白S的装置。通常所述试剂盒包含a)选择性地与具有APC辅因子活性的游离蛋白S相互作用的结合配偶体；和b)能够检测总蛋白S的结合配偶体。通常所述结合配偶体可以是多克隆或单克隆抗体或其片段或衍生物。通常所述抗体可以如上所述地进行标记。所述试剂盒也可包含具体检测方法所需的其他适当包裹的试剂和材料，其包括固相基质(如果适用)，以及标准品。在一个优选的实施方式中，通过测定具有活化蛋白C(APC)辅因子活性的游离蛋白S水平来实现本发明方法。或者，可通过测定游离蛋白S水平来实现本发明方法。通过以下附图和实施例进一步说明本发明。
图I 蛋白S活性”与“总蛋白S”的比率。测定来自患有(实心圆)和不患有(空心圆)结节性再生性增生的HIV-阳性患者的血浆、来自患有结节性再生性增生(实心正方形)的HIV-阴性患者的血浆和来自健康对照组(空心正方形)的血浆中的蛋白S活性水平和总蛋白S水平。附图描绘了各患者的 “蛋白S活性”与“总蛋白S”的比率。利用Student T检验评价统计学显著性。图2 :患有结节性再生性增生的HIV-阳性患者的蛋白S-特异性IgG水平A.在涂有蛋白S的ELISA平板中培养来自患有(灰色圆)和不患有(空心圆) 结节性再生性增生的HIV-阳性患者的血浆、来自患有结节性再生性增生(灰色和黑色正方形)的HIV-阴性患者的血浆和来自健康对照组(空心正方形)的血浆。使用过氧化物酶-偶联的多克隆抗-人IgG及其底物检测结合的IgG。测定1/50的血浆稀释物的所述结合强度作为492nm处的光密度(OD)得分。涂层的蛋白S的识别取决于IgG的剂量(未显示)。B.由患有结节性再生性增生的HIV-感染患者的血浆纯化的IgG的抑制活性。用重组蛋白S(每毫升20微克)培养由患者血浆纯化的IgG(每毫升0到2毫克)。然后在所说明的功能性凝聚试验中测定蛋白S的蛋白C辅因子活性。IgG的特异性抑制活性以单位 /毫克表示，并代表产生百分之五十的蛋白S抑制的IgG浓度的倒数。柱代表中值。P值显示于图中。数据来自至少两个独立实验。在HIV-阴性患者的情形，患有系统性红斑狼疮的两位患者描述为黑色正方形。图3 蛋白S活性”与“总蛋白S”的比率和IgG-介导的蛋白S的抑制之间的相关性由5位患有结节性再生性增生的HIV-感染患者的血浆纯化得到的IgG的抑制活性(参见图2B)绘制成游离蛋白S与总蛋白S的比率(参见图I)的函数。使用非参数斯皮尔曼(Spearman)相关性试验评价相关性的显著性(Rho = -0. 9 ；P = 0. 037)。
权利要求
1.用于在患有Hiv或患有全身性自身免疫疾病的受试者中诊断血栓形成倾向的方法， 所述方法包括在由所述受试者获得的血样中测定具有活化蛋白C(APC)辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平。
2.用于诊断受试者的自身免疫蛋白S缺乏症的方法，所述方法包括在由所述受试者获得的血样中测定具有活化蛋白C(APC)辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平。
3.权利要求I或2的方法，包括计算具有APC辅因子活性的游离蛋白S/总蛋白S的比率的步骤，其中低比率指示中和游离蛋白S辅因子活性的抗蛋白S自身抗体的存在。
4.权利要求I至3任一的方法，其中所述受试者患有HIV。
5.权利要求I至4任一的方法，其中所述受试者患有全身性自身免疫疾病。
6.权利要求5的方法，其中所述全身性自身免疫疾病是系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂抗体综合征、白塞氏病、普通易变型免疫缺陷(CVID)、病毒诱导的血栓形成前状态、血栓性血小板减少性紫癜。
7.试剂盒，含有a)用于检测具有APC辅因子活性的游离蛋白S的装置；和b)用于检测总蛋白S的装置。
8.权利要求7的试剂盒，其中所述试剂盒含有a)与具有APC辅因子活性的游离蛋白S选择性相互作用的结合配偶体；和b)能够检测总蛋白S的结合配偶体。
9.具有APC辅因子活性的游离蛋白S和总蛋白S作为自身免疫蛋白S缺乏症的指示剂的用途。
全文摘要
本发明涉及用于在患有HIV或患有全身性自身免疫疾病的受试者中诊断血栓形成倾向的方法，所述方法包括在由所述受试者获得的血样中测定具有活化蛋白C(APC)辅因子活性的游离蛋白S水平和总蛋白S水平。
文档编号G01N33/68GK102597777SQ201080020882
公开日2012年7月18日 申请日期2010年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者塞巴斯蒂安·拉克鲁瓦-德马兹, 斯利尼瓦斯·考维拉, 斯坦尼斯拉斯·波尔, 樊尚·马莱 申请人:勒内-笛卡尔-巴黎第五大学, 国家健康与医学研究院, 国家科学研究中心, 巴黎公共救济院