专利名称：产酸菌的检测的制作方法
产酸菌的检测相关专利串请的交叉引用本专利申请要求于2009年6月15日提交的第61/187，107号美国临时专利申请和于2010年3月15日提交的第61/314，140号美国临时专利申请的权益，将这两个临时专利申请以引用的方式全文并入本文。
背景技术：
产酸菌包括相对多样的一组具有共同代谢和生理特征的革兰氏阳性微生物。该细菌群组产生酸，作为碳水化物发酵的主要终产物。该群组分为两个代谢亚群-纯乳酸发酵菌，其基本上将碳水化合物转化成酸；和杂乳酸发酵菌，其除了产生酸以外，还将碳水化合物转化为其他代谢产物，包括例如乙醇和二氧化碳。虽然一些产酸菌如产乳酸细菌(LAB)在发酵食品的生产中具有有益作用，它们也 称为食品和饮料变质的主要媒介物，特别是在真空包装肉类、肉制品和啤酒中。产酸细菌在某些食物产品中的代谢活性可导致食品或饮料的感官特性(例如气味、口味)显著劣化。传统的微生物学技术通常用于对产酸菌如LAB进行鉴别和/或计数。琼脂和肉汤培养基(例如MRS和APT培养基)被用于促进生长和/或鉴别产酸菌。将培养物在微需氧环境中温育以改善产酸菌如LAB的生长。典型的方法包括在选择性琼脂板上培养和分离假定的产酸菌菌落，然后在含有发酵管的肉汤培养基中进行次代培养以检测杂乳酸发酵性物种引起的气体产生。这些方法可能耗费多至四天来检测或鉴别产酸菌。在一些情况下，这些方法可能耗费7-10天来鉴别产酸菌。对用来检测样品中的产酸菌如LAB的简单制品和方法存在着需求。
发明内容
根据用来检测和/或鉴别产酸菌的当前的一般方法(其通常需要特定的培养基、长的温育周期、特定的温育条件和/或次培养程序)，本发明包括用于检测和/或鉴别产酸菌的简单制品和方法。在一些实施例中，本发明方法提供了对产酸菌的区分。另外，或作为另一种选择，某些实施例提供了对产酸菌的计数。在一些实施例中，本发明方法提供了对产酸菌的自动化检测和/或计数。因此，在一个方面，本发明提供了检测产酸菌的方法。检测产酸菌的方法可包括提供薄膜培养装置、支持酸性细菌的生长的培养基、变色域在PH 7.0以下延伸的pH指示剂、可被产酸菌发酵的碳水化合物以及样品。薄膜培养装置可包含冷水可溶性胶凝剂。该方法还可包括在所述培养装置中将预定体积的所述样品、所述培养基、所述PH指示剂和所述可发酵的碳水化合物合并。该方法还可包括将所述培养装置在低于7的pH下温育一段时间并检测产酸微生物的存在与否。在另一方面，提供了检测产酸菌的方法，该方法包括提供薄膜培养装置，其包含冷水可溶性胶凝剂，支持产酸菌生长的培养基，变色域在pH 7. 0下延伸的pH指示剂，可被产酸菌发酵的碳水化合物以及怀疑含有产酸菌的样品。本方法还可包括将预定体积的样品与所述培养基合并以形成第一混合物；在所述培养装置中将所述第一混合物与所述pH指示剂和所述可发酵的碳水化合物合并；将所述培养装置温育一段时间；以及检测微生物的存在与否。在任何上述实施例中，所述培养基装置可包含所述培养基和/或所述pH指示剂。在所述方法的一些实施例中，所述培养装置还可包含选择剂。在本方法的一些实施例中，温育所述培养装置可包括在好氧条件下和/或在厌氧条件下温育所述装置。在任何上述实施例中，检测微生物的存在与否可包括区分微生物。在一些实施例中，区分微生物可包括检测PH指示剂反应或检测与所述微生物相关的气泡。在任何上述实施例中，该方法还可包括将所述样品与能中和化学消毒剂的稀释剂合并。在任何上述实施例中，可将所述培养基的pH调节至pH低于6. 5，其中检测微生物的存在与否包括检测产酸微生物的存在与否。在任何上述实施例中，该方法可还包括提供抗真菌剂。在任何上述实施例中，所述 PH指示剂可选自例如氯酚红、溴甲酚紫、溴酚蓝和溴甲酚绿。在任何上述实施例中，该方法可还包括对微生物进行计数的步骤。在任何上述实施例中，该方法还可包括提供成像系统和获得所述培养装置的图像，其中检测微生物的存在与否包括显示、打印或分析所述培养装置的图像。在一些实施例中，所述方法还可包括提供图像分析系统，其中分析图像包括用图像分析系统分析图像。在另一方面，本发明提供薄膜培养装置。该培养装置可包括主体构件，该主体构件包括具有上表面和下表面的自支承式防水基材。该培养装置可还包括在所述基材的上表面上的干涂层。该干涂层可包含支持产酸菌生长的培养基；冷水可溶性胶凝剂；变色域在PH7. 0下延伸的pH指示剂；以及任选地，抗真菌剂。在一些实施例中，该培养装置还可包括覆盖片。在一些实施例中，该覆盖片还可包括涂层，该涂层包含冷水可溶性胶凝剂和/或指示齐IJ。在任何上述实施例中，该装置可还包含可被产酸菌发酵的碳水化合物。在任何上述实施例中，所述PH指示剂可选自例如氯酚红、溴甲酚紫、溴酚蓝和溴甲酚绿。在任何上述实施例中，该培养基可包含聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯或乙酸钠。在该培养装置的任何上述实施例中，可将所述培养基的pH调节至pH低于6. 5。在又一个方面，本发明提供了套件。该套件可包括薄膜培养装置，该装置包括冷水可溶性胶凝剂、支持产酸菌生长的培养基、可被产酸菌发酵的碳水化合物和PH指示剂。在一些实施例中，该套件的培养基可包含抗真菌剂。在一些实施例中，该套件的培养基可包含PH指示剂或可被产酸菌发酵的碳水化合物。在一些实施例中，该套件的培养装置可包含所述培养基、所述可被产酸菌发酵的碳水化合物、所述PH指示剂或上述物质中任意两种或更多种的组合。在上述实施例中的任一者中，该套件可装有样品制备附属物，所述附属物选自样品稀释剂、缓冲剂、样品采集装置和移液管。在任何上述套件实施例中，可将培养基的PH调节至pH低于6. 5。词语“优选的”和“优选地”指在某些情况下，可以提供某些有益效果的本发明实施例。然而，在相同的情况或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，对一个或多个优选的实施例的表述并不暗示其他实施例是不可用的，且并非意图将其他实施例排除在本发明范围之外。本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种或多种(一个或多个)”可互换使用。因此，例如，怀疑含有“一种”微生物的样品可被理解为意指该样品可包含“一种或多种”微生物。术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任意两个或更多个的组
口 o另外，本文通过端点表述的数值范围包括该范围内的所有数值(例如，1-5包含I、I. 5,2,2. 75,3,3. 80、4、5 等)。本发明的上述发明内容并非意图描述本发明的每一个公开的实施例或每种实施方式。以下具体实施方式
更具体地举例说明了示例性实施例。在本专利申请全文的几处，通过实例列表提供指导，可以不同组合使用这些实例。在每一种情况下，所列举的列表均仅充当一个代表性的群组，而不应被理解为是排他性列表。
本发明将结合下面所列的附图进行进一步的阐述，其中在几个视图中相同的结构由相同的数字指代。图I是薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。图2是具有网格图案的自支撑基材的一个实施例的顶视图。图3是薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。图4是包括隔片和捕集元件的薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。图5是根据本发明的检测系统的一个实施例的框图。图6是用发射绿光的二极管照明的PETRIFILM板的生长区域的黑白图像示图。
具体实施例方式在详细说明本发明的任何实施例之前，应当理解，本发明并不将其应用局限于以下描述所提及的或附图所示出的具体构造和组件布置方式。本发明能有其他的实施例，并且能够以多种方式进行操作或实施。另外应该理解的是，本申请中所用的用语和术语的目的是为了进行说明，不应被认为是限制性的。本文的“包括”、“包含”、“含有”或“具有”及其变型的使用旨在涵盖随后所列的项及其等同物以及附加项。除非另外指明或限定，否则术语“支承”和“连接”及其变型按广义使用，均涵盖直接和间接的支承和连接。应理解，也可采用其他实施例，且可在不偏离本发明范围的情况下作出结构变化或逻辑变化。另外，诸如“前部”、“后部”、“顶部”和“底部”等之类的术语仅用于描述相对于彼此的元件，而绝非旨在细述设备的特定取向、指示或暗示必需或必要的设备取向或者指定在使用中将要如何使用、安装、显示或布置本文描述的本发明。本发明整体涉及用于检测和区分样品中的产酸菌的方法和制品。产酸菌被描述为兼性厌氧菌，其通常在已将氧气移除(例如通过催化移除)的环境(例如腔室)中培养。本发明方法提供了产酸菌在含氧和/或低pH环境中的生长、检测和区分。本文描述的方法可用于厌氧或好氧环境，潜在地消除了对特定温育装置的需要。另外，本发明方法提供了通过检测二氧化碳气体从单独菌落的产生来对产酸菌进行区分，从而消除了分离纯培养物所需的额外温育时间以及发酵管检测气体产生的使用。此外，本发明涉及对样品中的产酸菌进行计数。在一些实施例中，产酸菌的检测包括用成像系统进行自动检测。合适的样品可获自或源自多种来源。术语“来源”通常用来指需要针对微生物进行测试的食品或非食品。来源可以为固体、液体、半固体、凝胶状材料、气体(例如空气)以及它们的组合。在一些实施例中，来源可由捕集元件提供，该捕集元件用于例如从所关注的表面或者从空气采集该来源。在一些实施例中，液体组合物可包括捕集元件，该捕集元件可进一步被破碎分开(例如在搅动或溶解过程中)以增强该来源和任何所关注的微生物的回收。所关注的表面可包括多种表面的至少一部分，所述表 面包括但不限于壁(包括门)、地板、天花板、排水沟、冷却系统、管道(例如空气管道)、通风孔、马桶座圈、把手、门把手、扶手、工作台面、桌面、用餐表面(例如盘子、碟子等)、工作表面、设备表面、服装等，以及它们的组合。来源的全部或一部分可用于本方法中。当使用来源的一部分时，这有时可以称作该来源的“样品”。然而，术语“样品”在本文中一般用来指从来源获取并被引入到测试装置中以进行微生物检测的那部分材料体积或质量。术语“食品”通常用于指固体、液体(例如，包括但不限于溶液、分散体、乳状液、悬浮液等以及它们的组合)和/或半固体可食用组合物。食品的例子包括(但不限于)肉类、家禽、蛋、鱼、海鲜、蔬菜、水果、预加工食品(例如汤、调味汁、糊)、谷物产品(例如面粉、谷类食物、面包)、罐装食物、奶、其他乳制品(例如奶酪、酸奶、酸奶油)、脂肪、油类、甜点、调味品、香料、面食、饮料、水、啤酒、动物饲料、其他合适的可食用材料以及它们的组合。“样品采集装置”在本文中以最广义的含义使用，指用来采集液体、半固体或固体样品材料的器具。样品获取装置的非限制性例子包括拭子、擦拭物、海绵、勺子、刮刀、压舌板、过滤器、吸管、吸管头和虹吸管。术语“污染物”通常用于指能够携带和/或传播传染性生物体的无生命物体或基材。污染物可包括但不限于布料、拖把头、毛巾、海绵、抹布、餐具、硬币、纸币、手机、衣物(包括鞋子)、门把手等、它们的部分或它们的组合。术语“产酸菌”一般用于指特征在于它们产生酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的任何原核微生物。产酸菌的例子包括但不限于醋杆菌属(Acetobacter)和LAB。最普通的产酸菌包括产乳酸细菌。术语“产乳酸细菌”或“LAB” 一般用于指表征为它们产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的任何原核微生物。乳酸菌的例子包括但不限于如下属的成员-链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、气球菌属(Aerococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、酒球菌属(Oenococcus)、芽胞乳杆菌属(Sporolactobacillus)、四联球菌属(Teragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weisella)。乳酸菌包括某些病原菌如抗万古霉素肠球菌、明串珠菌属(Leuconostoc)的某些物种和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。可能影响产酸菌生长的环境因素可包括营养物质的存在与否、pH、含水量、氧化-还原电位、抗微生物化合物、温度、大气气体组成和生物结构或屏障。培养装置在某些实施例中本发明包括用于检测产酸菌如产乳酸细菌的培养装置。本发明的培养装置包括例如薄膜培养板装置。薄膜培养板装置通常比传统的琼脂平皿更加紧凑，且通常含有干燥的可再水化的培养基以支持某些微生物的生长。薄膜培养板装置的非限制性例子包括美国专利No. 4，565，783、No. 5，089，413和No. 5，681，712中公开的带涂层基材装置；将所述专利中每一者都以引用方式全文并入本文。图I示出根据本发明的薄膜培养装置的一个实施例。培养装置110包括主体构件，该主体构件包括具有上表面和下表面(分别为112a和112b)的自支撑防水基材112。基材112可为相对刚性的膜(例如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯)，该膜不会吸水或者以别的方式被水影响。基材112可为透明的或不透明的，这取决于是否想要透过该基材观察细菌菌落。为有利于对细菌菌落计数，基材212可具有印在其上的网格图案(例如方格)，如图2中所
/Jn o参见图I，可将基材112在其上表面112a上涂覆一层粘合剂114，该粘合剂起到保持均匀单层116中的干胶凝剂、pH指示剂、碳水化合物、可任选的抗真菌剂、其他指示剂和/或其他营养物质以易于水化。粘合剂114应以优选小于粉末状胶凝剂和/或营养物质的粒子直径的厚度涂覆到基材112上。目的是施加足够的粘合剂以将粒子粘附到基材，但又 不太多而造成粒子完全嵌在粘合剂中。冷水可溶性粉末的均匀单层116是所期望的，其表面积充分暴露以便水化。图I中还示出了可任选的在覆盖片122上的粘合剂层114'和冷水可溶性粉末层116'。当用水溶液(例如该样品和/或含水助悬介质，如水或缓冲液)进行水化时，胶凝剂形成水凝胶。在一些实施例中，粘合剂114、114'可包含水基粘合剂组合物。优选地，水基粘合剂层114、114'当被含水测试样品湿润时充分透明，以使得能够观察微生物集落。该水基粘合剂组合物可掺入一种或多种亲水剂，包括营养物质、选择剂、指示剂(例如PH指示剂)或它们的组合。根据本说明书，在该水基粘合剂组合物中使用的具体营养物质和/或选择剂对本领域技术人员是显而易见的并且可针对待培养和/或待选择性检测或抑制的具体产酸菌进行优化。例如，可将某些选择剂(例如抗生素如万古霉素)添加至该组合物以选择对应的抗生素抗性微生物。另外，可调节选择剂的浓度以选择一定水平的抗性，这是本领域一般技术人员所熟知的。在可用于发酵食品和饮料的一个优选实施例中，选择剂包括抗真菌剂。可用的抗真菌剂包括放线菌酮、制霉菌素和纳他霉素(也称为匹马霉素)。其他可用的抗真菌剂可以是两性霉素B和菲律宾菌素。用于培养产酸菌的营养培养基是本领域已知的。这类培养基的非限制性例子包括MRS培养基、APT培养基、胰蛋白胨葡萄糖牛肉浸膏培养基、胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏培养基、番茄汁琼脂和Kang-Fung培养基。这些及其他营养培养基适用于本发明的装置和方法，只要该营养培养基的组分不会干扰对由于微生物产酸而导致的PH指示剂改变的检测(通过目测检测或自动检测)。合适的营养培养基包括在制备后根据它们各自的PH而变动的培养基。例如，胰蛋白胨葡萄糖牛肉浸膏培养基可具有约7. 0±0. 2的pH，APT培养基可可具有约6. 7±0. 2的pH，MRS培养基可具有约6. 5±0. 2的pH，土豆汁琼脂可具有约6. 1±0. 2的pH。在一个优选的实施例中，可将营养培养基的pH调节至较低的pH。例如，在酿造工业中，希望具有pH低于约6. 8并且高于约3. 5+/-0. 2的营养培养基。在特别优选的实施例中，用于检测啤酒中的产酸菌(特别是LAB)的MRS营养培养基可具有5. 8+/-0. 2的pH。在另一个优选的实施例中，营养培养基可具有6. 5+/-0. 2的pH。适用于本发明的装置和方法的指示剂包括变色域范围低于pH 7.0的pH指示剂。合适的PH指示剂的非限制性例子包括变色域范围低于所接种的培养基的pH的加酸显色化合物。合适的PH指示剂将具有这样的pH变色域，该变色域在低于所接种的培养基的pH下延伸足够远以检测(通过视觉和/或通过使用成像系统)产酸菌生长菌落中的或邻近产酸菌生长菌落的PH指示剂的变化。优选地，pH指示剂将具有这样的pH变色域，该变色域具有的低端点低于所接种的培养基的PH不小于0. 25个pH单位。更优选地，pH指示剂将具有这样的pH变色域，该变色域具有的低端点低于所接种的培养基的pH不小于0. 5个pH单位。甚至更优选地，pH指示剂将具有这样的pH变色域,该变色域在所接种的培养基的pH下延伸不小于1.0个pH单位。最优选地，pH指示剂将具有低端点为约3. 5的pH变色域。合适的PH指示剂的非限制性例子包括溴甲酚紫、溴酚蓝、氯酚红和溴甲酚绿。
示例性的一类可用的指示剂包括这样的染料，其可被生长中的微生物代谢或者以其他方式与生长中的微生物反应，由此造成微生物集落被着色或者发荧光，以易于由技术人员或由自动读出器检测和/或定量。这种染料的非限制性例子包括氯化三苯基四唑、对甲苯基四唑红、四唑紫、藜芦基四唑蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二钠盐。但是应认识至IJ，取决于所要鉴定的具体生物体，也可使用其他合适的染料。本领域普通技术人员会认识至IJ，根据本发明使用的任何指示剂、染料、选择剂、酶底物或营养物质不应实质上干扰对本文所述的PH指示剂的观察和成像。可将诸如盐酸或氢氧化钠之类的pH调节剂用于一些实施例中来调节培养基或制备的样品的pH。在一个替代实施例中，可采用缓冲试剂如碳酸钠来提供显示具有中性pH的培养基，并可采用“Cab-O-Si 1M-5”作为加工助剂，如美国专利No. 4，565，783中所描述，将该专利以引用方式全文并入本文。当然，可根据所要培养的微生物的类型，对用于粉末116的具体涂层混合物(例如营养物、指示剂和/或胶凝剂)加以调整。设想到，本发明的制品可包括区分性指示剂。本文所用的“区分性指示剂”指添加到培养基中的会指示某些微生物的存在而不会指示其他微生物的存在的试剂。区分指示剂的非限制性例子包括染料(例如染剂、PH指示剂、氧化还原指示剂)、酶底物(例如磷酸酶、糖苷酶、肽酶、核酸酶、脂肪酶等的显色底物或荧光底物)以及当被某些微生物代谢时会产生可检测的反应(例如在菌落内或邻近菌落处的PH指示剂变色)的特定营养物质(例如可发酵的碳水化合物、氨基酸)。在一些实施例中，可将一种或多种区分性指示剂在涂覆到基材上的水基组合物中添加至薄膜培养装置。在一些实施例中，可将一种或多种区分性指示剂添加至液体样品，然后液体样品加到培养装置。在一些实施例中，可在培养装置进行水化后，将一种或多种区分性指示剂加至培养装置。涉及到使用加至水化后的培养装置的区分性指示剂的方法的一个例子是其中将用于检测耐热核酸酶的制品加到温育后的培养装置的方法，如美国专利No. 6，022，682中所述，将该专利以引用方式全文并入本文。在本发明范围内还设想到，粉末116可任选包括为执行某些用于微生物鉴定的生化测试所必需的试剂。可将在存在特定类型的微生物的情况下发生颜色改变的这种试剂(例如酶底物)包括在粉末116或粘合剂114中。
在本发明的另一个实施例中，粉末116可构成涂层，该涂层包含已经被溶解或悬浮于溶液中、涂覆并干燥于基材112上的胶凝剂和营养物质、选择剂和/或指示剂(例如，氧化还原指示剂、PH指示剂、酶底物)的混合物。在该实施例中，该涂层基本上是无水的(即该涂层具有的水含量不高于约脱水涂层在允许其与周围环境平衡后的水含量)。在本发明的另一个优选的实施例中，粉末116可构成涂层，该涂层包含已经被溶解或悬浮于溶液中、涂覆并干燥于基材112上的干胶凝剂、pH指示剂、碳水化合物、可任选的抗真菌剂、其他指示剂和/或其他营养物质的混合物。在该实施例中，该涂层是基本无水的。如图I所示，主体构件可包括施加到基材112的上表面的隔离物118，隔离物118包括在中部切穿以暴露基材112上的粉末116的圆形孔120。孔120的壁提供预定大小和形状的凹槽以限定水化后的培养基。孔120通常刻划出培养装置110的生长区域。隔离物118应足够厚以形成所需体积的凹槽，例如1、2或3毫升。闭孔聚乙烯泡沫或聚苯乙烯泡沫是用于隔离物118的优选材料，但可以使用为疏水性的(不可润湿的)、对微生物惰性的并 且能够经受消毒的任何材料。在一些实施例中(未显示)，隔离物118可包括多个孔20 (例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个孔)，每个孔可接种上不同的液体样品。隔离物118可包括相对较厚的设计，如美国专利No. 5，681，712中所述的那些设计，将该专利以引用方式全文并入本文。较厚的开孔的隔离物118的一个目的是对设置在隔离物118的孔120中的膜(例如微孔过滤器膜)(未示出)进行定位和保护。较厚的隔离物118的另一个目的是为了减少或防止覆盖片122与生长中的微生物集落的接触(即提供生长表面和覆盖片122之间的“顶部空间”，这还可使得对生长中的微生物集落的通气增加)。隔离物118的厚度应足以围住在对培养装置接种时加到该装置的液体体积。取决于膜(当使用时)的厚度，隔离物可为至少约0. 5mm厚、约Imm厚、约I. 5mm厚和约2mm厚。图3示出了薄膜培养装置310的另一个实施例。该实施例包括基材312、粘合剂314、冷水可溶性粉末316和覆盖片322，如图I中所描述的。在一些实施例中，可将该pH指示剂包括在冷水可溶性粉末316中。相比于图I的培养装置110，图3的培养装置310不包括隔离物来在接种过程中限定样品。可在覆盖片322闭合后将模板例如加重环(未显示)暂时施加到该覆盖片的外面，用以在冷水可溶性粉末316形成凝胶的同时将样品限定到特定区域。培养装置310接种有样品的部分通常刻划出装置310的生长区域。在一些实施例中，可将装置310接种有多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个)不同的液体样品，采用适当的隔离物和模板来将单独的样品限定于培养装置310的粉末316的不同部分。当用水溶液(例如该样品和/或含水悬浮介质，如水或缓冲液)进行水化时，包含胶凝剂的冷水可溶性粉末形成水凝胶。在一个实施例中，可根据例如美国专利No. 4，565，783中所述的方法，如下制备薄膜培养板装置产生液体涂覆混合物，将该液体涂覆混合物涂覆到基材上，干燥该带覆层的基材并任选地，附接覆盖片。这个实施例的示例性装置在图4中示出。薄膜培养装置410包括主体构件411，该主体构件具有自支撑防水基材412，该防水基材分别具有上表面412a和下表面412b。基材412优选为由不吸收水的防水材料如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯制成的相对刚性的材料。其他合适的防水材料包括含有防水聚乙烯涂层的基材如纸材。上表面412a涂覆有液体组合物，然后让该液体组合物干燥以在基材412上提供干涂层416。干涂层416包含如本文所述的冷水可溶性胶凝剂，并且还可包含诸如碳水化合物之类的营养物质、诸如抗生素或抗真菌剂之类的选择剂、指示剂、pH指示剂或上述物质中的任意两种或更多种的组合。用于产生干涂层416的液体组合物可容易地通过在约220 ° 的烘箱中加热液体组合物直至基本上该组合物中的全部水已蒸发来干燥。然而，如果在水分已蒸发后加热组合物，则组合物的某些组分(例如营养物、指示剂)可能开始降解。在使用时，用液体(例如液体样品和/或液体营养培养基)水化干涂层416以形成重构的液体组合物。当提及干燥形式的培养基或营养培养基的PH时，该pH是就适用的干涂层在用去离子水再水化后进行测量的。可将一层粘合剂414涂覆于基材412上。该粘合剂可起到将干涂层416保持在基材412上的作用。该粘合剂在水化时应该足够透明以允许观察在涂覆了的基材412的表面上生长的细菌菌落。该粘合剂还应该以这样的厚度涂覆于基材412上，该厚度使得基材能均匀地涂覆有干涂层416而不会将该涂层嵌入粘合剂中。
具有大致圆形的孔420的隔离物418粘附于干涂层416和/或基材412上。隔离物418覆盖基材412的周边，孔420限定了待用样品接种的区域。隔离物418环绕装置410的生长区域并起到防止液体样品从基材412渗漏。在一个可供选择的实施例中，装置410可不包括容纳样品的隔离物418。在该装置(未示出)中，可使用上述的加重环状模板将样品在接种过程中容纳于基材上，并且样品在温育过程中仅由培养基的组分(例如胶凝剂)包含。覆盖片422附接至泡沫隔离物418的上表面的边缘。覆盖片422优选由透明的膜或片材制成，以便于对基材上存在的细菌菌落进行计数。另外，覆盖片422优选对细菌和水蒸汽具有不透性，以避免各组分受污染和变质的风险。用作覆盖片422的优选材料是双轴取向的聚丙烯。任选地，覆盖片422可涂覆有一层粘合剂，该粘合剂可涂覆有包含胶凝剂、营养物质、选择剂和指示剂(例如PH指示剂)或上述物质中的两种或更多种的任意组合的干燥组合物(例如粉末)(未显示)。在使用时，通过向后拉覆盖片并将接种物分布在干涂层416上来将预定量的接种物(通常约I毫升液体接种物)添加至图4中所示的装置。该接种物可任选包含营养物质、选择剂、指示剂或上述物质中的两种或更多种的组合。然后再将覆盖片422放回涂层417上，接种物均匀地散布在泡沫隔离物418的圆形开口内。用于该操作的简便工具是加重的圆形模板。随着接种物接触涂层417并散布在该涂层上，涂层发生水化而形成凝胶。凝胶中存在的营养物质可支持微生物的生长。然后将接种了的装置温育预定的时间，之后可透过透明的覆盖片422对生长在基材上的细菌菌落数目进行计数。可任选将捕集元件如膜式过滤器用于装置410。图4示出了设置在隔离物418的孔420中的膜式过滤器426。另外示出的是在膜式过滤器426上生长的的微生物集落428。合适的微孔膜不会实质性地干扰产酸菌产生酸或不会干扰用PH指示剂检测酸。在某些优选的实施例中，微孔膜在与重构的液体组合物接触时是基本上透明的。可在将液体添加至装置410来重构干涂层416之前将膜式过滤器426设置在装置410中。可在将液体添加至装置410来重构干涂层416之后将膜式过滤器426设置在装置410中。在一些实施例中，膜式过滤器426可包含足够的液体以在将过滤器426设置在装置410中时重构干涂层416。优选的涂层混合物(当用预定体积的样品水化时)可包含具有表I中所示浓度的培养基成分。在一些实施例中，用于培养装置的涂层混合物可包含表I所示成分中的一些，而含有样品的液体(例如稀释剂)可包含剩余的表I所示成分中的一些或全部。因而，添加培养装置中的成分和稀释剂中的成分可得到表I所示的培养基。在一个实施例中，涂层混合物包含全部的成分。表I.示例性培养基的组成。
权利要求
1.一种检测产酸菌的方法，该方法包括 提供薄膜培养装置，其包含冷水可溶性胶凝剂，支持产酸菌生长的培养基，变色域在PH7.O以下延伸的pH指示剂，可被产酸菌发酵的碳水化合物和样品； 在所述培养装置中将预定体积的所述样品、所述培养基、所述PH指示剂和所述可发酵的碳水化合物合并； 将所述培养装置温育一段时间；以及 检测微生物的存在与否。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述培养装置包含培养基。
3.根据权利要求I或权利要求2所述的方法，其中所述培养装置包含pH指示剂。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的方法，其中将所述培养基的pH调节至pH低于6.5，并且其中检测微生物的存在与否包括检测产酸微生物的存在与否。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述培养装置还包含选择剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述选择剂为抗真菌剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗真菌剂选自放线菌酮、制霉菌素、纳他霉素、两性霉素B、菲律宾菌素以及上述物质的组合。
8.—种检测产酸菌的方法，该方法包括 提供薄膜培养装置，其包含冷水可溶性胶凝剂，支持乳酸菌生长的培养基，变色域在PH7.O以下延伸的pH指示剂，可被产酸菌发酵的碳水化合物和怀疑含有产酸菌的样品； 将预定体积的样品和所述培养基合并以形成第一混合物； 在所述培养装置中将所述第一混合物、所述PH指示剂和所述可发酵的碳水化合物合并； 将所述培养装置温育一段时间；以及 检测微生物的存在与否。
9.权利要求I至3中任一项或权利要求8所述的方法，其中温育所述培养装置包括有氧地温育所述装置。
10.根据权利9所述的方法，其中检测微生物的存在包括区分微生物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中区分微生物包括检测pH指示剂反应。
12.根据权利要求10所述的方法，其中区分微生物包括检测与所述微生物相关的气泡。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述pH指示剂选自溴甲酚紫、氯酚红、溴甲酚绿和溴酚蓝。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法还包括将所述样品与能中和化学消毒剂的稀释剂合并。
15.根据权利要求8或权利要求10至14中任一项所述的方法，其中将所述培养基的PH调节至pH低于6. 5，并且其中检测微生物的存在与否包括检测产酸微生物的存在与否。
16.根据权利要求4至8中任一项或权利要求15所述的方法，其中温育所述培养装置包括厌氧地温育所述装置。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法还包括 提供成像系统；以及获取所述培养装置的生长区的图像； 其中检测微生物的存在与否包括显示、打印或分析所述生长区的图像。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述成像系统包括照明源，并且其中获取所述生长区的图像包括对所述生长区进行照明。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法还包括对微生物进行计数的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中对微生物进行计数包括对两种或更多种类型的微生物进行计数。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述成像系统包括照明源，并且其中获取所述生长区的图像包括对所述生长区进行照明。
22.根据权利要求21所述的方法，其中对所述生长区进行照明包括用有限波段的可见波长对所述生长区进行照明。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述有限波段的可见波长选自在约500nm至约550nm范围内的波长。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述有限波段的可见波长选自在约520nm至约530nm范围内的波长。
25.根据权利要求18所述的方法，其中对所述生长区进行照明包括使用偏置滤波器来对所述生长区进行照明或来采集所述生长区的图像。
26.根据权利要求17至25中任一项所述的方法，该方法还包括提供图像分析系统的步骤；其中分析所述图像包括用所述图像分析系统分析所述图像。
27.根据权利要求26所述的方法，其中分析所述图像包括分析所述图像的选定波长。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述选定波长在约500nm至约550nm的范围内选择。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述选定波长在约520nm至约530nm的范围内选择。
30.一种薄膜培养装置，其包括 主体构件，所述主体构件包括具有上表面和下表面的自支撑防水基材；和 在所述基材的上表面上的干涂层，其中所述涂层包含支持产酸菌生长的培养基；冷水可溶性胶凝剂；和变色域在pH 7. 0以下延伸的pH指示剂。
31.根据权利要求30所述的装置，其还包括可由产酸菌发酵的碳水化合物。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的装置，其还包括覆盖片。
33.根据权利要求32所述的装置，其中所述覆盖片还包括涂层，所述涂层包含冷水可溶性胶凝剂。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的装置，其中所述覆盖片还包括涂层，所述涂层包含指示剂。
35.根据权利要30至34中任一项所述的装置，其中所述pH指示剂选自溴甲酚紫、氯酚红、溴甲酚绿和溴酚蓝。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的装置，其中所述冷水可溶性胶凝剂选自瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、褐藻胶以及上述物质中任意两种或更多种的组合。
37.根据权利要求30至36中任一项所述的装置，其中所述培养基包含聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯或醋酸钠。
38.根据权利要求30至37中任一项所述的制品，其中将所述培养基的pH调节至pH低于 6. 5。
39.一种套件，其包括 薄膜培养装置，其包含冷水可溶性胶凝剂； 支持产酸菌生长的培养基； 可由产酸菌发酵的碳水化合物；和 pH指示剂。
40.根据权利要求39所述的套件，其中所述培养基包含所述pH指示剂或可由产酸菌发酵的碳水化合物。
41.根据权利要求39所述的套件，其中所述培养装置包含所述培养基、pH指示剂、所述可由产酸菌发酵的碳水化合物或上述物质中任意两种的组合。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的套件，其还包括选自样品稀释剂、缓冲剂、样品采集装置和移液管的样品制备附属物。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的套件，其中将所述培养基调节至pH低于.6.50
全文摘要
本发明提供可用于检测样品中的产酸菌的装置和方法。所述装置包含营养培养基和pH指示剂以检测和区分产酸微生物如乳酸菌。使用方法包括对产酸微生物进行检测或计数。所述方法还提供对产气产酸菌的检测。
文档编号G01N33/84GK102803504SQ201080035115
公开日2012年11月28日 申请日期2010年6月15日 优先权日2009年6月15日
发明者罗伯特·F·杨, 帕特里克·A·马赫, 迈克尔·E·休吉斯, 克里斯蒂娜·A·宾斯费尔德, 贾森·W·比约克, 玛拉·S·赖夫-温纳, 亨利·J·吕布朗特 申请人:3M创新有限公司