专利名称：一种同型半胱氨酸测定方法及其试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种同型半胱氨酸测定试剂。
背景技术：
同型半胱氨酸(Homocysteine)是含硫氨基酸，在细胞内由蛋氨酸脱甲基生成。近 期的研究表明，同型半胱氨酸通过产生超氧化物及过氧化物损伤血管内皮细胞，改变凝血 因子功能，增加血栓形成倾向，促进动脉粥样硬化及血栓形成，使心血管疾病发病率及死亡 率增加，因此测定血中同型半胱氨酸的浓度在临床上意义十分重要。当同型半胱氨酸在细 胞内积聚，并进入血液循环后，大部分以氧化型存在，并与蛋白结合，还原形同型半胱氨酸 在血中仅占1 %。测定血中总同型半胱氨酸的含量，一般需采用还原剂将氧化型同型半胱氨 酸还原为还原型同型半胱氨酸，常用的还原剂为三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)。同型半胱氨酸在临床应用中的测定方法主要包括高效液相色谱法、酶免疫分析 法、荧光偏振法等。上述方法的共同特点是需要特别的测定仪器、操作复杂，试验耗时较长， 不能应用于临床大流量的自动化分析，并且价格昂贵。由于同型半胱氨酸在样本中的含量较低，常规临床酶学的测定方法无法达到所需 的测定灵敏度，限制了常规方法的采用。在酶学方法测定同型半胱氨酸的技术方面，Naoto Matsuyama等(参见美国专利#668617 发明了一种利用同型半胱氨酸转甲基酶和腺苷同 型半胱氨酸酶的非循环酶学测定技术，提高测定灵敏度的方法，但该方法操作繁琐，试剂复 杂，测定前需加入巯基化合物，测定时必须同时进行多项空白测定，增加了测定方法的不准 确性。本发明公开了一种新的测定体液样本中同型半胱氨酸的酶循环方法，该方法不受 体液样本中干扰物质的干扰，具有优良的反应灵敏度。并进过巧妙设计，首次在测定同型半 胱氨酸的酶学方法采用产物二次循环方法，不但为酶学测定试剂创建了一种新的循环增量 测定方法，而且进一步提高了反应的灵敏度和抗干扰性能。本发明同时还首次公开了基于 二次酶循环法制备的同型半胱氨酸测定试剂，该试剂可以应用于目前广泛使用的临床自动 分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题一方面是为了克服现有的同型半胱氨酸测定方法需 特殊仪器、操作复杂、耗时长、不能进行大流量的自动化分析的缺陷；另一方面是为了进一 步提高现有全自动分析试剂的灵敏度，从而改善测定质量，而提供的一种同型半胱氨酸测 定试剂。同时还提供了 一种全新的同型半胱氨酸酶循环测定试剂。本发明人巧妙地利用酶循环反应，首次公开了一种同型半胱氨酸二次酶循环法的 测定试剂。该方法无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉，可实现临床快速、大流量 的样本测试，并大大提高了同型半胱氨酸在临床常规检测项目中的质量，具有极高的科学 和经济价值。具体的，本发明通过下述技术方案解决上述技术问题
本发明涉及一种同型半胱氨酸的测定方法，其包括如下步骤将待测样本在 酶循环反应系统中，进行如式1 3所示的反应，测定酶循环反应生成的氨的生成速 率并计算，即得待测样本中同型半胱氨酸含量；所述的酶循环反应系统包括蛋氨酸 合成酶(Methionine synthetaseEC 2. 1. 1. 13，)、蛋氨酸 Y -裂解酶(Methionine gamma-lyase EC 4. 4. 1. 11), 0-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶(O-Acetylhomoserine aminocarboxypropyltransferase EC 2. 5. 1· 49)、5_ 甲基四氢叶酸或其盐和 0-乙酰-L-高 丝氨酸。同型半胱氨酸+ 5-甲基四氢叶酸 蛋氨酸合成酶一四氢叶酸+ L-蛋氧酸式权利要求
1.一种同型半胱氨酸浓度的测定方法，其特征在于其包括如下步骤将待测样本在酶 循环反应系统中，进行如式1 3所示的反应，测定酶循环反应生成的氨的生成速率并计 算，即得待测样本中同型半胱氨酸含量；所述的酶循环反应系统包括蛋氨酸合成酶、蛋氨 酸Y -裂解酶、0-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、以及5-甲基四氢叶酸或其盐和0-乙 酰-L-高丝氨酸；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于 所述的蛋氨酸合成酶的用量为1 100kU/L ；和/或，所述的蛋氨酸Y-裂解酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的0-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的5-甲基四氢叶酸或其盐的用量为0. 1 50mmol/L ； 和/或，所述的0-乙酰-L-高丝氨酸用量为1 200mmol/L，或通过酶反应现场生成。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶循环反应系统为PH6 9的缓冲 液体系；所述的缓冲液较佳的为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’42-乙 基磺酸)缓冲液；所述的缓冲液的浓度较佳的为20 300mmol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶循环反应系统还包括酶稳定剂； 所述的酶稳定剂较佳的为甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、EDTA、钾离子、钠离子、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶循环反应系统中还包括α-酮戊 二酸或其盐、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶，所述的测定酶循环反应生成的氨 的生成速率的方法为谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶组成的酶循环反应检测法，所述的酶循 环测氨反应的反应式如式5-6所示；谷氛酸脱氧醜
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的谷氨酸脱氢酶的用量为0. 1 50kU/L ； 和/或，所述的谷氨酸氧化酶的用量为0. 1 50ku/L和/或，所述的α -酮戊二酸或其盐的用量为1 50mmol/L，较佳的为1 20mmol/L ； 和/或，所述的还原型辅酶的用量为0. 1 lmmol/L，较佳的为0. 2 0. 3mmol/L ； 和/或，所述的还原型辅酶为NADH、NADPH^R NADH或硫代NADPH。
7.—种同型半胱氨酸的测定试剂，其特征在于其包括下述成分蛋氨酸合成酶、蛋氨酸Y -裂解酶、0-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、以及5-甲基四氢叶酸或其盐和0-乙 酰-L-高丝氨酸。
8.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于所述的测定试剂还包含α-酮戊二酸 或其盐、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶；所述的谷氨酸脱氢酶的用量较佳的为0. 1 50kU/L ； 和/或，所述的谷氨酸氧化酶的用量为0. 1 50ku/L和/或，所述的α -酮戊二酸或其盐的用量较佳的为1 50mmol/L，更佳的为1 20mmol/L ；和/或，所述的还原型辅酶较佳的为0. 1 lmmol/L，更佳的为0. 2 0. 3mmol/L ； 和/或，所述的还原型辅酶较佳的为NADH、NADPHjIHf NADH或硫代NADPH。
9.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于所述的测定试剂还包含酶稳定剂和/ 或缓冲成分；所述的酶稳定剂较佳的为甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、EDTA、钾离子、钠离子、牛血清白 蛋白、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种；所述的缓冲成分较佳的为能形成PH6 9的缓冲液的成分；所述的缓冲液较佳的为磷 酸盐缓冲液、Tris缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’ -(2-乙基磺酸)缓冲液；所述的缓冲 液的浓度较佳的为20 300mmol/L。
10.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于所述的测定试剂为固体干粉形式，或 者还包括水，为水溶液形式；所述的水溶液形式为能直接使用的水溶液形式，或需经稀释才 使用的浓缩液形式。
11.如权利要求10所述的测定试剂，其特征在于 所述的测定试剂为能直接使用的水溶液形式时， 所述的蛋氨酸合成酶的用量为1 100kU/L ；和/或，所述的蛋氨酸Y -裂解酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的0-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的5-甲基四氢叶酸或其盐的用量为0. 1 50mmol/L ； 和/或，所述的0-乙酰-L-高丝氨酸的用量为0. 1 200mmol/L，或现场生成； 所述的测定试剂为固体干粉形式或需经稀释才使用的浓缩液形式，各所述成分的含量 以能溶解和/或稀释为能直接使用的水溶液形式中各成分的含量进行选择。
12.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于所述的测定试剂为所有成分混合的单 一试剂形式，或者为包含独立包装各成分的成套试剂盒形式，或者为将各成分分为若干独 立包装组分的成套试剂盒形式。
13.如权利要求7 12任一项所述的测定试剂，其特征在于 所述的测定试剂为下述中的任一种(1)所述的测定试剂为单一试剂，其包含蛋氨酸合成酶、蛋氨酸Y-裂解酶、0-乙酰高 丝氨酸氨基羧丙基转移酶、5-甲基四氢叶酸或其盐、0-乙酰-L-高丝氨酸、三_(羧乙基) 磷化氢盐酸盐、α -酮戊二酸或其盐、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸氧化酶；(2)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1和2的双组份成套试剂盒，试剂1包含 蛋氨酸 -裂解酶、0-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、0-乙酰-L-高丝氨酸、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、还原型辅酶、α-酮戊二酸或其盐、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶，试剂2 包含蛋氨酸合成酶、5-甲基四氢叶酸或其盐；以及(3)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1和2的双组份成套试剂盒，试剂1包含蛋 氨酸Y-裂解酶、0-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、高丝氨酸0-乙酰转移酶、谷氨酸氧 化酶、乙酰辅酶A、L_高丝氨酸、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、还原型辅酶、α -酮戊二酸或 其盐、谷氨酸脱氢酶、试剂2包含蛋氨酸合成酶、5-甲基四氢叶酸或其盐；以及(4)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1、2和3的三组份成套试剂盒，试剂1包含 α -酮戊二酸或其盐、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶，试剂2包 含蛋氨酸Y-裂解酶、0-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、高丝氨酸0-乙酰转移酶、谷氨 酸氧化酶、乙酰辅酶A，L-高丝氨酸、，试剂3包含蛋氨酸合成酶、5-甲基四氢叶酸或其盐。(5)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1、2和3的三组份成套试剂盒，试剂1包含 α -酮戊二酸或其盐、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶，试剂2包 含蛋氨酸Y -裂解酶、0-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、谷氨酸氧化酶、0-乙酰-L-高丝 氨酸，试剂3包含蛋氨酸合成酶、5-甲基四氢叶酸或其盐。
全文摘要
本发明公开了一种同型半胱氨酸浓度的测定方法将待测样本在酶循环反应系统中，进行如式1～3所示的反应，测定酶循环反应生成的氨的生成速率并计算，即得待测样本中同型半胱氨酸含量；所述的酶循环反应系统包括蛋氨酸合成酶、蛋氨酸γ-裂解酶、O-乙酰高丝氨酸氨基羧丙基转移酶、以及5-甲基四氢叶酸或其盐和O-乙酰-L-高丝氨酸。本发明还公开了与该方法相应的测定试剂。本发明建立了一种新型的同型半胱氨酸的酶学测定方法及测定试剂。本发明方法无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉，可实现临床快速、大流量的样本检测，使同型半胱氨酸成为临床上常规检测项目成为可能，具有极高的科学和经济价值。式1式2式文档编号G01N33/68GK102095696SQ20111003696
公开日2011年6月15日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者王学忠 申请人:王学忠