专利名称：第四代hiv抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种第四代HIV抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用。
背景技术：
HIV (Human Immunodeficiency Virus,人体免疫缺损病毒)传播的广泛性和危害性已成为全球关注的社会热点问题。因此，提高HIV诊断水平具有重要现实意义。从1985年第I代HIV抗体检测试剂问世到现在，HIV血清学检测试剂已经发展到了第4代。第4代ELISA试剂的优点在于能同时检测抗原和抗体，由于加入抗原的检测可将窗口期缩短7 9天，在对HIV早期诊断的效果上明显优于第3代。
目前国内已有部分厂家研制得到了第四代检测试剂盒，主要采用的是化学发光法和酶联免疫法，但该种检测方法需要借助实验仪器才能完成，从而不方便用户使用；而且检测效果受操作人员熟练度的影响较大，从而限制了普通用户的使用。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸，具有使用方便、操作简单、便于推广的优点。本发明的技术方案如下本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸，包括吸水滤纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫和反应支持物；在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸；并且，所述硝酸纤维素膜上自靠近所述样品垫一侧依次设置有第一条带Tl、第二条带T2和质控条带C ;所述第一条带Tl包被P24抗原单克隆抗体，所述第二条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原，所述质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述胶体金垫含有胶体金标记的P24抗原单克隆抗体和胶体金标记的GP36、GP41、GP120抗原混合标记物。本发明还提供一种制备上述的第四代HIV抗体抗原检测试纸的方法，包括以下步骤(I)分别制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体、GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原；(2)硝酸纤维素膜的制备将步骤(I)制得的P24抗原单克隆抗体用0.02mol/LpH = 7. 2的PBS稀释成I. Omg/ml，用喷膜机以I. O μ Ι/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第一条带Tl ;将步骤(I)制得的GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原分别用O. 02mol/L pH=7. 2的PBS稀释成O. 3mg/ml、0. 6mg/ml和O. 4mg/ml，用喷膜机以I. O μ 1/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第二条带T2 ;将羊抗鼠IgG多克隆抗体用O. 02mol/LpH = 7. 2的PBS稀释成I. Omg/ml，用喷膜机以I. 0μ Ι/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成质控条带C ；(3)胶体金垫的制备采用最佳标记pH值为7. 4至8. O、最佳标记浓度为15至18 μ g/ml的标记条件制得胶体金标记的P24抗原单克隆抗体；分别采用最佳标记pH值为7. 4至8. O、最佳标记浓度为10至12 μ g/ml的标记条件制得胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原；将本步骤上述得到的胶体金标记的P24抗原单克隆抗体、胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原进行纯化后，喷涂到胶体金垫上,干燥备用；(4)第四代HIV抗体抗原检测试纸的制备在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。优选的，所述制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体的制备方法为采用动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水，将获得的P24抗原单克隆抗体腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀，得到蛋白浓度高于2. Omg/ml、纯度大于90%的P24抗原单克隆抗体。优选的，所述GP36抗原、GP41抗原或GP120抗原的制备方法为
将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后，再用离子层析柱层析纯化，得到浓度高于2. Omg/ml，纯度大于90%的GP36、GP41或GP120抗原。本发明还提供了第四代HIV抗体抗原检测试纸在检测HIV中的应用。本发明的有益效果如下本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸，不仅具有使用方便、操作简单、便于推广的优点，而且能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果，通过区分抗体和抗原检测，达到了区分感染阶段的目的，为患者提供更多的信息。
图I为本发明实施例提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的正面示意图；图2为本发明实施例提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的侧面示意图；图3为本发明提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的检测结果阳性示意图；图4为本发明提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的检测结果阴性示意图；图5为本发明提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸的检测结果无效示意图。其中1-吸水滤纸；2-硝酸纤维素膜；3-胶体金垫；4-样品垫；5-反应支持物。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的实施方式进行详细说明。实施例I :第四代HIV抗体抗原检测试纸(参见图I和图2)(I) P24抗原单克隆抗体的制备采用通用的动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水，然后对该P24抗原单克隆抗体腹水进行纯化，具体的纯化方法为将含有P24抗原单克隆抗体的腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后，使用紫外分光法测定蛋白浓度、使用SDS-PAGE测定纯度，所得P24抗原单克隆抗体的蛋白浓度高于2. Omg/ml，纯度大于90%为合格。
(2)GP36、GP41 和 GP120 抗原的制备将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后，再用离子层析柱层析纯化，并使用紫外分光光度法测定蛋白浓度、使用SDS-PAGE测定纯度，所得抗原以浓度高于2. Omg/ml，纯度大于90%为合格。(3)硝酸纤维素膜上第一条带Tl包被P24抗原单克隆抗体的方法经实验确定，最佳包被条件为包被缓冲液为O. 02mol/L pH = 7. 2的PBS，包被浓度为I. Omg/ml，喷量选择为I. O μ Ι/cm。即将P24抗原单克隆抗体用O. 02mol/L pH = 7. 2的PBS稀释成I. Omg/ml，用喷膜机以I. O μ Ι/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第一条带Tl。(4)硝酸纤维素膜上质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗体的方法
经实验确定，最佳包被条件为包被缓冲液为O. 02mol/L pH = 7. 2的PBS，包被浓度为I. Omg/ml，喷量选择为I. O μ 1/cm。(5)硝酸纤维素膜上第二条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原的方法经实验确定，最佳包被条件为包被缓冲液为O. 02mol/L pH = 7. 2的PBS，包被浓度为GP36 为 O. 3mg/ml、GP41 为 O. 6mg/ml、GP120 为 O. 4mg/ml，喷量选择为 I. O μ 1/cm。(6)胶体金的制备与鉴定使用柠檬酸三钠还原法还原氯金酸制备胶体金颗粒，使用紫外分光光度计扫描460 600nm区间的光吸收值，在520至530nm区间有最大吸收峰，且吸收值大于2. O为合格,对应胶体金颗粒直径大约为30 40nm。(7)胶体金标记P24抗原单克隆抗体的方法P24抗原单克隆抗体最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定使用胶体金梯度pH值平行标记该抗体，选择变色边缘的标记PH值，然后将该pH值加上O. 5作为P24抗原单克隆抗体进行标记的最佳PH值，大约为7. 4至8. O ;在该最佳pH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入P24抗原单克隆抗体后混匀，放置20分钟以上，按每毫升胶体金加Λ 100 μ I的比例加入10%的NaCl，混匀，观察颜色，选定加入Ρ24抗原单克隆抗体浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10%值作为最佳标记量，大约为15至18 μ g/ml。(8)胶体金分别标记GP36、GP41和GP120抗原的方法GP36抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定使用胶体金梯度pH值平行标记该抗原，选择变色边缘的标记pH值,然后将该pH值加上O. 5作为该GP36抗原进行标记的最佳PH值，大约为7. 4至8. O ;在该最佳pH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入GP36抗原后混匀，放置20分钟以上，按每毫升胶体金加入100 μ I的比例加入10%的NaCl，混匀，观察颜色，选定加入GP36抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10%值作为最佳的标记量，大约为10至12 μ g/ml。GP41抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定使用胶体金梯度pH值平行标记该抗原，选择变色边缘的标记PH值，然后将该pH值加上O. 5作为该GP41抗原进行标记的最佳PH值，大约为7. 4至8. O ;在该最佳pH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入GP41抗原后混匀，放置20分钟以上，按每毫升胶体金加入100 μ I的比例加入10%的NaCl，混匀，观察颜色，选定加入抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10%值作为最佳的标记量，大约为10至12 μ g/ml。
GP120抗原最佳标记pH值和最佳标记浓度的确定使用胶体金梯度pH值平行标记该抗原，选择变色边缘的标记pH值,然后将该pH值加上O. 5作为该GP120抗原进行标记的最佳PH值，大约为7. 4至8. O ;在该最佳pH值条件下，设定蛋白梯度进行标记，在胶体金中加入GP120抗原后混匀，放置20分钟以上，按每毫升胶体金加入100 μ I的比例加入10%的NaCl，混匀，观察颜色，选定加入GP120抗原浓度最低且颜色不发生变化的标记量再额外附加10%值作为最佳的标记量，大约为10至12 μ g/ml。(9)对上述(7) (8)中所得到的四种胶体金标记溶液进行纯化的方法将标记好的胶体金溶液，加入BSA和PEG20000至终浓度均为0.2%，混匀，放置15分钟以上，使用高速冷冻离心机12000rpm离心15分钟以上，弃去上清，将沉淀使用胶体金保存液复溶，体积为原标记胶体金体积的1/10。复溶比例的调试使用胶体金工作液稀释标记胶体金浓缩液进行稀释，稀释比例为10至20倍，喷涂到胶体金垫上进行干燥，最后根据与包被硝酸纤维素膜配对的检测结果确定最佳的稀释比例，一般选择15倍左右。
(10)第四代HIV抗体抗原检测试纸的制备在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。具体的，搭接粘帖可以为以下方式包被好的硝酸纤维素膜2粘贴在反应支持物5上，其条带T1、T2线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物5边缘28. Omm(具体数值会根据反应支持物5的尺寸发生变化)，条带C线方向硝酸纤维素膜的边缘距离反应支持物5的边缘32. Omm (具体数值会根据反应支持物5的尺寸发生变化)；条带C线方向的反应支持物5上粘贴有吸水滤纸I，压住硝酸纤维素膜Imm到2mm ;条带T线方向的反应支持物5上首先粘贴4mm到8mm (根据实际生产活性的差异而变化)的胶体金垫3，压住硝酸纤维素膜条带T线的边缘Imm到2mm ;在此方向上继续粘贴样品垫4,压住胶体金垫2_到4mm(依赖于胶体金垫3的宽度)。实施例2 检测方法(参见图3、4、5)将待检标本(全血、血清或者血浆)60至100 μ I直接加入实施例I所得的检测试纸中的样品垫4处(全血样本需要额外加入一些稀释液)，样品将沿着反应支持物5的各个附着物向吸水滤纸方向移动，20分钟内读取实验结果。结果参照图3，如果样本中含有Ρ24抗原，则与检测试纸上的胶体金标记的Ρ24抗原的单克隆抗体特异性结合形成复合物，沿着膜区继续上行则与包被在硝酸纤维素膜2上的另一个Ρ24抗原单克隆抗体发生特异性结合，在条带Tl处出现红色或者粉红色；如果样本中含有HIV抗体，则与检测试纸上的胶体金标记的GP36、GP41、GP120抗原的单克隆抗体特异性结合形成复合物，沿着膜区继续上行则与包被在硝酸纤维素膜2上的另一个GP36、GP41、GP120抗原单克隆抗体发生特异性结合，在条带T2处出现红色条带，如果同时含有以上两种待检物则在两条线上同时显示红色条带。参照图4，如果样本中没有P24抗原也没有HIV的抗体，就不能形成上述复合物,条带Tl和T2处也就不能出线红色或粉红色，为阴性。参照图5，无论样本中是否含有P24抗原或者HIV抗体，胶体金标记的单克隆抗体都会继续上行至包被膜的条带C，去此处包被的羊抗鼠IgG结合形成红色或者粉红色条带，即为质控线，如果在检测中此条带不出现，则证明胶体金失效或者操作有失误，结果无效，需要重新检测。
综上所述，通过使用本发明所提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸，不仅具有使用方便、操作简单、便于推广的优点，而且能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果，通过区分抗体和抗原检测，达到了区分感染阶段的目的，为患者提供更多的信息。以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本 发明保护的范围。
权利要求
1.一种第四代Hiv抗体抗原检测试纸，其特征在于，包括吸水滤纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫和反应支持物；在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸； 并且，所述硝酸纤维素膜上自靠近所述样品垫ー侧依次设置有第一条带Tl、第二条带T2和质控条带C ;所述第一条带Tl包被P24抗原单克隆抗体，所述第二条带T2包被GP36、GP41和GP120抗原，所述质控条带C包被羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述胶体金垫含有胶体金标记的P24抗原单克隆抗体和胶体金标记的GP36、GP41、GP120抗原混合标记物。
2.ー种制备权利要求I所述的第四代HIV抗体抗原检测试纸的方法，包括以下步骤 (1)分别制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体、GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原； (2)硝酸纤维素膜的制备将步骤(I)制得的P24抗原单克隆抗体用O.02mol/L pH =.7.2的PBS稀释成I. Omg/ml，用喷膜机以I. O μ Ι/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第一条带Tl ;将步骤(I)制得的GP36抗原、GP41抗原和GP120抗原分别用O. 02mol/L pH = 7. 2的PBS稀释成O. 3mg/ml、0. 6mg/ml和O. 4mg/ml,用喷膜机以I. O μ 1/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成第二条带T2 ;将羊抗鼠IgG多克隆抗体用O. 02mol/L pH = 7. 2的PBS稀释成I. Omg/ml，用喷膜机以I. O μ Ι/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，形成质控条带C ； (3)胶体金垫的制备采用最佳标记pH值为7.4至8. O、最佳标记浓度为15至18 μ g/ml的标记条件制得胶体金标记的P24抗原单克隆抗体；分别采用最佳标记pH值为7. 4至.8.O、最佳标记浓度为10至12 μ g/ml的标记条件制得胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原；将本步骤上述得到的胶体金标记的P24抗原单克隆抗体、胶体金标记的GP36、GP41和GP120抗原进行纯化后，喷涂到胶体金垫上，干燥备用； (4)第四代HIV抗体抗原检测试纸的制备在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述制备纯度和浓度均符合要求的P24抗原单克隆抗体的制备方法为 采用动物体内生产单抗的方法获得P24抗原单克隆抗体腹水，将获得的P24抗原单克隆抗体腹水使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀，得到蛋白浓度高于2. Omg/ml、纯度大于90%的P24抗原单克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述GP36抗原、GP41抗原或GP120抗原的制备方法为 将含有GP36、GP41或GP120抗原的细菌培养液用辛酸-饱和硫酸铵沉淀后，再用离子层析柱层析纯化，得到浓度高于2. Omg/ml，纯度大于90%的GP36、GP41或GP120抗原。
5.权利要求I所述的第四代HIV抗体抗原检测试纸在检测HIV中的应用。
全文摘要
本发明提供一种第四代HIV抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用，包括吸水滤纸、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫和反应支持物；在所述反应支持物外表面上依次相互搭接粘帖所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水滤纸。因此，本发明所提供的第四代HIV抗体抗原检测试纸具有使用方便、操作简单、便于推广、能够在一个检测试纸上同时区分P24抗原阳性结果和HIV抗体阳性结果的优点。
文档编号G01N33/569GK102680690SQ201110064489
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者江兵泽, 顾子易 申请人:北京易斯威特生物医学科技有限公司, 江兵泽, 顾子易